Summary
Описан надежный и легко воспроизводимый метод подготовки функционируемых, ближнеинжегруппирующих фотолюминесцентных золотых нанокластеров и их непосредственного обнаружения внутри клеток HeLa с помощью цитометрии потока и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Abstract
За последнее десятилетие флуоресцентные золотые нанокластеры (AuNCs) стали свидетелями растущей популярности в биологических приложениях, и огромные усилия были направлены на их развитие. В этом протоколе подробно описан недавно разработанный легковой метод приготовления водорастворимых, биосовместимых и коллоидно стабильных ближнеинжекрасных испускающих АУНК. Этот комнатной температуры, снизу вверх химический синтез обеспечивает легко функциональные AuNCs ограничен тиоктической кислоты и тиол-модифицированный полиэтиленгликоль в водной растворе. Синтетический подход не требует ни органических растворителей, ни дополнительного обмена лигандами, ни обширных знаний о синтетической химии для воспроизведения. Полученные AuNCs предлагают свободные поверхностные карбоксиловые кислоты, которые могут быть функционализированы с различными биологическими молекулами, несущими свободную группу амина без негативного влияния на фотолюминесцентные свойства AuNCs. Была также описана быстрая, надежная процедура цитометрической количественной оценки потока и конфокальной микроскопической визуализации поглощения AuNC клетками HeLa. В связи с большим сдвигом Стокса, надлежащая установка фильтров в цитометрии потока и конфокальной микроскопии необходима для эффективного обнаружения ближнего инфракрасного фотолюминесценции AuNCs.
Introduction
В последнее десятилетие, ультрамалые (2 нм) фотолюминесцентных золотых нанокластеров (PL AuNCs) стали перспективными зондами для фундаментальных исследований и практических применений1,22,33,4,5,6,7,8,9,10. Их многочисленные желательные характеристики включают высокую фотостабильность, tunable максима выбросов, длительные сроки выбросов, большие сдвиги Стокса, низкая токсичность, хорошая биосовместимость, почечная очистка и поверхностное биоконъюгация. PL AuNCs может обеспечить фотолюминесценцию от синего до ближнего инфракрасного (NIR) спектральной области, в зависимости от количества атомов в кластере11 и характера поверхностного лиганда12. NIR (650-900 нм) испуская AuNCs особенно перспективны для долгосрочного in vitro и in vivo изображений клеток и тканей, так как они предлагают высокое соотношение сигнала к шуму из-за минимального перекрытия с внутренней аутофлуоресценции, слабое рассеяние и поглощение, и высокое проникновение тканей NIR света13,14.
В последние годы, различные подходы, которые используют преимущества Au-S ковалентных взаимодействий были разработаны для подготовки NIR-PL AuNCs ограничен с различными тиол-содержащих лигандов13,15,16,17. Для биомедицинских применений AuNCs должны быть функционализированы с биологическим компонентом для облегчения связывающих взаимодействий. Таким образом, AuNCs с высокой коллоидной стабильностью, которые легко функционально функционируют в вавном растворителе, очень желательны. Общая цель текущего протокола заключается в описании ранее сообщалось18 подготовки AuNCs с functionalizable группы карбоксиловой кислоты на поверхности, используя тиоциловую кислоту и полиэтиленгликоль (PEG) в водной среде в подробно и их спряжения с молекулами, несущими первичный амин после кислотно-аминального метода. Из-за простоты синтеза и высокой воспроизводимости, этот протокол может быть использован и адаптирован исследователями из нехимических фонов.
Одним из ключевых необходимых для применения AuNCs в биомедицинских исследованиях является способность наблюдать и измерять AuNCs внутри клеток. Среди методов, доступных для мониторинга поглощения наночастиц клетками, цитометрии потока (FCM) и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) предлагают надежные, высокопроизводительные методы, которые позволяют быстро измерять интернализацию флуоресцентных наноматериалов в большом количестве клеток19. Здесь также были представлены методFC и CLSM для прямого измерения и анализа PL AuNCs внутри клеток без необходимости в дополнительных красителей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка ближнего инфракрасного излучающего AuNCs (1)
- Добавьте 7,8 мг (37,8 мкм) тиоктической кислоты (TA) и 60 л от 2 МН НаОГ до 23,4 мл ультрачистой воды (резистика 18,2 МЗ.см при 25 градусах Цельсия) и перемешайте (не менее 1000 об/мин) до полного растворения (15-20 мин). Для более быстрого растворения TA, sonicate смеси. Для синтеза рекомендуется свежеприготовленный раствор TA.
- Добавьте в раствор 10,2 л HAuCl4Х3H2O (470 мг/мл) вавого раствора.
- После 15 мин, добавить 480 кл. NaBH4 (1,9 мг/мл) при энергичном перемешивании (не менее 1000 об/ ч) и перемешать реакционную смесь в тех же условиях на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеприготовленный раствор NaBH4 в ледяной ультрачистой воде и добавить в реакционную смесь сразу после приготовления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез AuNCs легко масштабируется. До 2 L AuNCs был синтезирован в одной партии, без каких-либо изменений в оптических свойствах частиц. - (Критически) На следующий день очистите раствор, применяя три цикла центрифугирования/фильтрации с помощью мембранного фильтрационного устройства с молекулярным отсечкой веса 3 кДа. Без этой процедуры очистки следующий шаг не работает должным образом.
- Добавить тиол-прекратить полиэтиленгликоль (MW 2000; 15,6 мг; 7,8 моль) в раствор, настроить рН до 7-7,5 и перемешать смесь на ночь, чтобы получить 1. Очистите дисперсию, применяя три цикла центрифугации/фильтрации с помощью мембранного устройства фильтрации с молекулярным отсечкой веса 3 кДа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Корректировка рН до 7-7,5 чрезвычайно важна. Более высокий рН может привести к синей сдвиг ехнии максимы.
2. Спряжение 3--(аминопропил)трифенилфосфосфоний бромид (ТЭС) на поверхности 1
- Смешайте 1 раствор (24 мл), приготовленный на предыдущем этапе, и 3-(аминопропил)трифенилфосфоний бромид (12 мг, 30 мкм). Отрегулируйте рН до 4,5 с 1 М HCl.
ПРИМЕЧАНИЕ: 3-(Aminopropyl)трифенилфосфоний (TPP) бромидная соль была подготовлена, как описано в литературе20. - Начните реакцию, добавив избыток N-(3-диметил-аминопропил)-N-этилкарбодимид гидрохлорид (EDC) HCl) (60 мг, 312 моль). РН раствора будет увеличиваться и не должно выходить за пределы 6. Мониторинг рН реакционной смеси в течение первого часа. Если рН увеличивается выше 6, уменьшите его до 4,5-6, добавив 1 M HCl.
- Перемешать реакционную смесь на ночь при комнатной температуре.
- Очистите дисперсию, применяя три цикла центрифугации/фильтрации с помощью мембранного устройства фильтрации с молекулярным отсечкой веса 3 kDa для получения 2. Разбавить 2, полученной здесь с ультрачистой водой, до первоначального объема 24 мл. Концентрация АУ в растворе составляет 200 мкг/мл.
3. Клеточная культура
- Культурные клетки HeLa (коллекция культуры HPA) в модифицированном Eagle's Medium Dulbecco дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота плода в 5% CO2 при 37 градусах Цельсия.
- Разделите и процвируйте клетки, когда они достигают слияния 80%. Чтобы свести к минимуму приобретение новых мутантов, количество размножений клеток не должно превышать 30.
4. Интернализация AuNC в клетки HeLa
- Семя клеток в 12-хорошей пластине при плотности 20000 клеток /мл (1 мл/хорошо). Цель состоит в том, чтобы достичь 50% слияния после 48 ч.
- На 48 ч после посева, аспирировать культуры среды и добавить 400 злител полной среде культуры (для необработанных элементов управления) или 500 мкг наночастиц в 400 л полной культиваемых среды (для обработанных образцов) к каждой скважине. Верните культуры в инкубатор 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление больших объемов раствора AuNC отрицательно влияет на жизнеспособность клеток. Решения AuNC должны быть сконцентрированы. Таким образом 2 полученные в шаге 2.4 сконцентрированы 100 времен. 40 мЛ AuNC был сконцентрирован до 400 л. Для получения желаемой концентрации AuNC к 400 множам культуры ячеек было добавлено 25 qL aquot этого концентрированного раствора. - После 2 ч интернализации, отсоединить клетки стандартной трипсинизации в соответствии с протоколом производителя.
- Соберите образцы в полипропиленовых микроцентрифуговых трубках и центрифугах в течение 5 мин при 350 х г при 4 градусах Цельсия.
- Подготовьте следующий буфер FCM: предварительно охлажденный фосфат буферный солен (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM 2 PO4,pH 7.4) дополнено с 2% альбомином сыворотки крупного рогатого скота при 44
- Вымойте гранулы с 1 мл буфера FCM и центрифуги в течение 5 минут при 350 х г при 4 градусах По Цельсию.
- Отрежь гранулы в 500 qL буфера FCM и храните образцы при 4 градусах Цельсия до анализа.
5. Анализ цитометрии потока
- Фильтр все образцы с помощью 5 мл полистирола кругло-дно трубки с клеточной крышкой.
- Перед получением данных с помощью программного обеспечения прибора укажите конфигурацию цитометра.
- Формат все точки-сюжеты и гистограммы для "Приобретения".
- Участок двух параметров точки участка области переднего рассеяния (FSC-A) и боковой области рассеяния (SSC-A), чтобы показать распределение ячеек. Чтобы исключить дублеты, создайте двухпараметрный точечный участок высоты FSC (FSC-H) против FSC-A. Чтобы контролировать относительную интенсивность флуоресценции в образце, нарисуйте однопараметрную гистограмму для флуоресцентного канала (FL-A). Используйте линейную шкалу для изображения данных FSC и SSC, а также логарифмическую шкалу для всех флуоресцентных параметров.
- Приобрести необработанный образец (без наночастиц) с низкой скоростью потока, чтобы свести к минимуму совпадающие события (если это разрешено прибором). Во время приобретения, настроить фотомультипликатор трубки (PMT) напряжения, чтобы получить необработанной популяции в масштабе на участке FSC против SSC. При необходимости отрегулируйте напряжение PMT для канала FL, чтобы поместить неокрашенную популяцию в левом углу гистограммы.
- Выберите конкретную вкладку «ворота» в программном обеспечении и нарисуйте соответствующие ворота вокруг желаемого населения. Ячейки внутри ворот будут перемещаться к следующему контрольно-пропускному пункту.
- Запись 10 000 событий на выборку.
- Запись всех образцов под одинаковыми настройками инструмента.
- Используйте соответствующую программу для анализа данных цитометрии потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые приложения могут потребовать настройки фильтров. Для обмена фильтрами всегда следуйте рекомендациям производства в руководстве пользователя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть сохранен и перезагружен, чтобы сохранить настройки инструмента и стратегию gating.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высота бокового рассеяния (SSC-H) против области бокового рассеяния (SSC-A) также может быть использована для исключения дублетов. Этот тип gating может быть более чувствительным, как детектор FSC, как правило, не PMT.
6. Интернализация 2 в клетки HeLa для конфокального лазерного сканирования микроскопии (CLSM)
- Семя клетки на 4-камерное стекло нижней 35 мм блюдо при плотности 250000 клеток / мл (0,5 мл/ камерой). Держите камеру в инкубаторе 37 градусов с 5% CO2 атмосферы. Цель состоит в том, чтобы достичь 50% слияния после 24 ч.
- На 24 ч после посева, добавить 100 мкг 2 (или 10 юртей из бульона раствор 10 мг/мл) в каждой тарелке камеры, содержащей 0,5 мл среды с клетками (для обработанных образцов).
- Верните блюдо в инкубатор. Пусть клетки интернализировать AuNCs в течение 24 ч до их использования для CLSM.
- После периода интернализации отбросьте среду и промойте клетки предварительно разогретой свежей средой в течение 5 мин. Повторите шаг стирки еще раз. Затем заполните каждую камеру с 800 л свежей среде.
7. CLSM Изображение живых клеток Hela помечены 2
- Для микроскопической визуализации используйте 63x масло (n no 1.518) объектив объективной линзы (NA No 1.4) в конфокальном микроскопе с планом-апохроматом.
- Смонтировать блюдо на микроскоп инвертированной сцене с камерой нагревается до 37 градусов по Цельсию и поставляется с увлажненным 5% CO2 атмосферы.
- Для обнаружения интернализированного AuNC используйте лазер 405 нм мощностью 2% с соответствующим пучевым сплиттером. Установите диапазон длин волн обнаружения между 650 и 760 нм.
- Установите разрешение изображения на 2048 x 2048 пикселей. В настройке скорости приобретения, цель для пикселей оставить время около 4 й. Приобрести изображение с 2x усреднения (режим линии, средний метод усреднения). Установите пинхол до 1 Airy единицы (для 405 нм света). Для повышения чувствительности используйте режим фотон-счета.
- Для правильного освещения в передаваемом свете с дифференциальным интерференционным контрастом (DIC) используйте настройку конденсатора конденсатора и полевой остановки Кёлера. Для приобретения передаваемого света используйте лазер мощностью 488 нм мощностью 0,7% без назначенного детектора флуоресценции. Установите соответствующий сплиттер пучка для длины волны лазера.
- Приобретите по два изображения для каждого трека (красная флуоресценция и DIC). Отслеживайте AuNCs по их красной флуоресценции; границы клеток легко определяются в передаваемом свете с помощью изображений DIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NIR PL AuNCs были подготовлены из Au3 "в присутствии TA, а затем тиол-прекратить PEG (MW 2000) был связан на поверхности AuNC, чтобы получить 1 после рабочего процесса показано на рисунке 1. Амидиционная связь между 1 и 3 -(аминопропил) трифенилфосфоном (ТЭС) бромистом при условии 2. Как и ожидалось, спектр поглощения(рисунок 2a) указал, что AuNCs 1 и 2 не имеют характерной поверхностной плазмонной полосы и показывают широкое излучение от 550 нм до 850 нм(рисунок 2b). После крепления ТЭС на поверхность 1,PL сильно увеличился. Выбросы из AuNCs также были видны при ультрафиолетовом свете (365 нм, рисунок 2b всетвий). Выбросы от AuNCs является стабильным и длина волны выбросов не зависит от волне волн возбуждения(рисунок 2c). Тем не менее, интенсивность выбросов является максимальной, когда возбужденных с ультрафиолетовым светом.
2 был обнаружен внутри клеток HeLa путем мониторинга PL на цитометр потока. Клетки HeLa инкубировались в течение 2 часов при концентрации мультимедиа между 0,5 мг/мл и 2 мг/мл. Данные FCM подтвердили поглощение 2 клетками HeLa. Флуоресценция NIR (720 нм) зависела от обоих времен(рисунок 3а)и концентрации 2 (рисунок 3b). Максимальная интенсивность наблюдалась с помощью фильтра диапазона 780/60.
AuNCs в клетках были изображены неинвазивно с помощью стандартного конфокального лазерного сканирующего микроскопа. На рисунке 4 показано конфоковое изображение клеток HeLa, окрашенных 2 (200 мкг/мл). После 24 ч инкубации наблюдалась ярко-красная фотолюминесценция 2 внутри клеток.
Рисунок 1: Синтез золотых нанокластеров. Рабочий процесс подготовки 1 и 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оптические свойства золотых нанокластеров. Нормализованная(a)спектра поглощения (Inset: Фотография водной растворов 1 и 2 под белым светом) и(b)фотолюминесцентные спектры 200 мкг/мл aqueous решений 1 и 2 (Inset: фотография решений AuNC под ультрафиолетовым светом (365 нм)). (c)Эксцитация-излучение PL карта 2. Возбуждение смещается на 10 нм шагов. Пик выбросов около 750 нм очень стабилен (не смещается с возбуждением) и показывает огромный сдвиг Стокса от возбуждения. Наиболее эффективное возбуждение происходит около 340 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Обнаружение золотых нанокластеров внутри клеток HeLa по цитометрии потока. Интернализация 2 в клетки HeLa была изучена с помощью FCM. Гистограммы показывают(a)время- и(b)концентрационно-зависимое поглощение AuNCs клетками HeLa. В зависимом от времени эксперименте клетки HeLa не лечились (контроль; 0 ч) или лечились 1,28 мг/мл 2 и инкубировали при 37 градусах Цельсия в указанное время. Клетки затем промывают pbS и анализируются FCM. В концентрационно-зависимом эксперименте клетки HeLa не обрабатывались (контроль; 0 мг/мл) или обрабатывались с указанными концентрациями 2 и обрабатывались таким же образом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: CLSM-изображение клеток HeLa, помеченных золотыми нанокластерами. Клетки HeLa были инкубированы с 2 (200 мкг/мл) на 24 ч и изображены с CLSM. (a) Представляет красный канал флуоресценции (650-760 нм); (b) передаваемый световой канал (DIC) и(c)накладывается(a)и(b). Шкала бар, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Тест на стабильность 1. Фотолюминесценция спектра 1 в 1 M NaCl на 0 ч и после 72 ч. Интенсивность была нормализована до максимы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NIR-излучающих AuNCs были синтезированы с использованием подхода снизу вверх, в котором раствор прекурсора золота (HAuCl4) был обработан с подходящими лигандой тиола, а затем уменьшение au3 " Сокращение ионов металла в ваквомом растворе, как правило, агрегируется и приводит к крупным наночастицам, а не сверхмалым NCs21. Для подготовки ультрамалых (2 нм) PL AuNCs синтетические условия были скорректированы для предотвращения образования крупных частиц и содействия образованию сверхмалых скоплений. Характер лигандов, используемых для крышки поверхности AuNC также играет важную роль в воздействии на структуру, электронные и оптические свойства частиц12,,22,,23,,24,,25,26,27,28,29,30. Поэтому выбор подходящих лигандов, способных стабилизировать ультрамалые кластеры, является ключом к получению высокофлуоресцентных АУНК. Тиол-содержащие лиганды являются наиболее часто используемыми стабилизаторами в синтезе AuNCs, из-за сильной ковалентной связи между тиол и золотом. В предыдущем докладе31 указывается, что многотиовые лиганды намного превосходят монотиол-лиганды в стабилизации PL AuNCs. Мультитиол лиганды обеспечивают повышенную коллоидную стабильность AuNCs из-за более высокого числа связывающих участков между лигандом и поверхностью AuNC. Bidentate тиол TA был использован для синтеза NIR PL AuNCs, поскольку он обеспечивает значительно улучшенную коллоидную стабильность AuNCs в широком диапазоне неблагоприятных условий по сравнению с монотиол лиганды32. TA также обеспечивает водной фазовый рост наночастиц с дискретным контролем размера, и, самое главное, он предлагает группу карбоксиловой кислоты на поверхности наночастиц, которые могут быть использованы для спряжения биологически значимых молекул33,34.
TA стабилизирует AuNCs электростатической репульсией, вызванной депротонных групп карбоксилата на поверхности35. Однако, в кислых растворах, TA-защищенные AuNCs будут colloidally неустойчивыми из-за protonation группы carboxylate. Наночастицы могут быть стабилизированы электростерически, а не чисто электростатически. Такой подход обеспечивает коллоидную стабилизацию даже при наличии высоких концентраций соли и изменениях рН, что важно для биомедицинского применения. Для приления электростерической стабилизации TA-AuNCs, кластеры были впоследствии функционализированы с тиол-прекратить PEG (MW 2,000) на 5:1 молярное соотношение TA:PEG, уступая 1 (Рисунок 1). Для успешного вложения ТИол-прекратить PEG, TA-AuNCs должны быть очищены. Функциональность AuNC с ПОМОЩЬю ПЭГ улучшила стоя ваковая растворимость при кислых рН и увеличение коллоидной устойчивости в высокоии ионных носителях прочности. Важно, чтобы крепление тиол-прекратить ПЭГ осуществляется на рН 7,0-7,5. Более высокий рН приведет к синей сдвиг ехнища максимы. Несвязанные лиганды были удалены путем центрифугации/фильтрации с помощью мембранного устройства фильтрации с молекулярным отсечкой веса 3 kDa. Лиганды, связанные с наночастицами, испытывают значительное расширение линии в 1H NMR по сравнению с свободными лигандами, которые могут скрыть пиковые назначения и интеграцию36. Значительно широкий 1H NMR пик, связанный с тиоктической кислоты и тиол-модифицированный полиэтиленгликоль предполагает, что лиганды связаны с поверхностью AuNC и удаление свободных лигандов18. Успешная интеграция люминесцентных АУНК в биологическую среду требует стабильности над условиями, такими как высокая ионная прочность, поскольку биологические носители богаты избытком ионов. Стабильность 1 была проверена путем мониторинга фотолюминесценции в 1 M NaCl в течение 72 ч. Никакие существенные изменения в свойствах фотолюминесценции в 1 M NaCl указывают на высокую стабильность AuNCs(Дополнительная диаграмма 1). AuNCs были стабильны в буферном растворе в течение более года без каких-либо доказательств осадков (данные не показаны).
1 предлагает карбоксиловую кислоту на поверхности. Карбодиимид на основе соединения реагентов широко используются для ковалентно ссылку карбоксиловых кислот амина через образование амид связи37. Наиболее часто используемым карбодиамидным реагентом в спутном растворе является 1-этил-3-(диметиламинопропил) карбодиимидгидродид гидрохлорид (ЭДК-ХЛ). EDC-HCl был использован для ковалентного соединения бромида ТЭС с 1 для получения 2. Одним из основных преимуществ этого протокола является спряжение молекул с первичной группой амина через формирование амидных связей без ущерба для флуоресценции и коллоидной стабильности. Характеристика электронов с высоким разрешением (HRTEM) показала, что AuNCs 1 и 2 имеют средний диаметр 1,15 и 0,2 нм, что указывает на то, что функциональное соединение не изменяет размер ядра AuNCs18. Кроме того, бесплатные группы карбоксила могут быть активированы с помощью EDC и Sulfo-NHS38. Решения 1 и 2 возбужденных с УФ лампы (365 нм) флуоресц ярко-красный(рисунок 1b, врез),в то время как они появляются светло-желтый под окружающим освещением(Рисунок 1a, врез). TPP спряжения увеличивает AuNC PL из-за передачи заряда металла к лигену (MLCT)18.
Наночастицы могут вызывать неблагоприятные биологические эффекты, которые могут ограничить их применение в биологии. Для оценки цитотоксичности 2 на клетках HeLa, XTT (натрий 2, 3-бис (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-(фениламино)-карбонил-2H-тетразолий внутренней соли) была проведена анализа жизнеспособности клеток. Клетки HeLa, обработанные 2 (200 мкг/мл) в течение 48 ч, не показали потери жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными клетками. Это наблюдение показывает, AuNCs являются биосовместимыми, что делает их перспективными кандидатами в качестве флуоресцентных зондов для применения в биологических исследованиях.
При возбуждении с лазером 405 нм, 2 обеспечивает широкое излучение с максимальным около 750 нм. Чрезвычайно большой сдвиг Стокса (350 нм) позволяет надежно отличать испускаемый свет от захватывающего источника света; однако настройка фильтра FCM должна быть настроена соответствующим образом. Для 2, 780/60 нм фильтр bandpass идеально подходит из-за широты фильтра и тот факт, что максимум выбросов AuNCs находится в том же регионе. Очень важно использовать широкие фильтры диапазона в регионе максимума выбросов для эффективного обнаружения PL39,,40,,41,,42. Сигнал флуоресценции, зависящий от времени и дозы, от клеток, обработанных 2, предполагает, что FCM можно использовать для удобного мониторинга клеточных исследований с использованием AuNCs. Когда время инкубации было увеличено до 24 ч, концентрации 40 мкг/мл 2 было достаточно для обнаружения АУНК флуоресценцией в FCM (данные не показаны). Однако для короткого инкубационного времени (1-2 ч) необходимы более высокие концентрации АУНК. Этот метод обнаружения AuNCs с помощью сигнала ФЛуоресценции NIR со стандартным цитометром потока поможет еще больше расширить потенциальное применение АУНК в биомедицинской науке. Описанный здесь подход может быть использован для оценки темпов и механизмов клеточного поглощения14, взаимосвязи между концентрацией наночастиц и клеточной токсичностью, или влияние химии поверхности на поглощение нанокластера в быстром и количественном порядке с помощью FCM.
Сотовая поглощение 2 клетками HeLa была изображена CLSM. После 24 ч инкубационного ярко-красного выброса 2 было обнаружено при возбуждении с помощью 405 нм лазера. Тем не менее, 405 нм лазер также возбуждает внутренние фторофоры внутри клеток. Чтобы отличить сигнал AuNC от автофлюоресценции, выброс от AuNC был собран выше 650 нм. Привлекательные свойства, такие как яркое ближнее инфракрасное люминесценции, высокая коллоидная стабильность, хорошая биосовместимость и вышерезультатные результаты, демонстрируют, что AuNCs являются перспективными средствами визуализации для биомедицинских и клеточных приложений визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Некоторые части методов и результатов были ранее представлены в статье Pramanik et al.18 Здесь эти методы были преобразованы в практические протоколы по пункту. Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Acknowledgments
Авторы благодарны Алзбете Магдоленовой за помощь в цитометрии потока. Авторы признают финансовую поддержку проекта GACR Nr. 18-12533S. Микроскопия была проведена в лаборатории конфокальной и флуоресценции микроскопии совместно финансируемых Европейским фондом регионального развития и государственного бюджета Чешской Республики, проекты нет. К.1.05/4.1.00/16.0347 и КЗ.2.16/3.1.00/21515, при поддержке чешско-BioImaging большой проект RI LM2015062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
References
- Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
- Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
- Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
- Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
- Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
- Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
- Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
- Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
- Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
- Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
- Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
- Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
- Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
- Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
- Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
- Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
- Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
- Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
- Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
- Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
- Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
- Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
- Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
- Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
- Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
- Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
- Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
- Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
- Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
- Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
- Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
- Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
- Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
- Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
- Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
- Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
- Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
- Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).
