Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

تركيب مجموعات نانوية ذهبية قريبة من الأشعة تحت الحمراء للتطبيقات البيولوجية

Published: March 22, 2020 doi: 10.3791/60388

Summary

طريقة موثوقة وسهلة الاستنساخ لإعداد وظيفية، والأشعة تحت الحمراء القريبة تنبعث منها مجموعات نانوية الذهب المنبعث بالضوء والكشف المباشر داخل خلايا هيلا عن طريق تدفق قياس الخلايا والمسح المجهري ليزر بؤري.

Abstract

على مدى العقد الماضي، شهدت مجموعات النانو الذهبية الفلورية (AuNCs) شعبية متزايدة في التطبيقات البيولوجية وكرست جهود هائلة لتطويرها. في هذا البروتوكول، تم وصف طريقة متطورة وسهلة مؤخرًا لإعداد الأونيك القابلة للذوبان في الماء والمتوافقة بيولوجيًا والغروانية القريبة من الأشعة تحت الحمراء الباعثة للأشعة تحت الحمراء. هذا غرفة درجة الحرارة، من أسفل إلى أعلى التركيب الكيميائي يوفر AuNCs وظيفية بسهولة توج مع حمض الثيوتيك والبولي إيثيلين glycol المعدلة ثيول في محلول مائي. النهج الاصطناعية لا يتطلب المذيبات العضوية أو تبادل ليغاند إضافية ولا معرفة واسعة من الكيمياء الاصطناعية للتكاثر. تقدم الـ AuNCs الناتجة أحماض كربوكسيليك سطحية حرة ، والتي يمكن أن تكون وظيفية مع جزيئات بيولوجية مختلفة تحمل مجموعة أمين مجانية دون التأثير سلبًا على خصائص الإضاءة الضوئية للأونيك. كما تم وصف إجراء سريع وموثوق به للقياس الكمي للخلايا المتدفقة والتصوير المجهري المحوري لمن يناب أونك من قبل خلايا HeLa. بسبب التحول ستوكس كبيرة، الإعداد السليم للمرشحات في قياس التدفق الخلوي والمجهر confocal ضروري للكشف الفعال من photoluminescence الأشعة تحت الحمراء القريبة من AuNCs.

Introduction

في العقد الماضي، ظهرت ultrasmall (≤ 2 نانومتر) photoluminescent الذهب nanoclusters (PL AuNCs) كتحقيقات واعدة لكل من البحوث الأساسية والتطبيقات العملية1,,4,,,,,10. وتشمل خصائصها العديدة المرغوبة ارتفاع عدم الاستقرار الضوئي، وأقصى قدر من الانبعاثات الغيرقابلة، وأعمار الانبعاثات الطويلة، وتحولات ستوكس الكبيرة، والسمية المنخفضة، والتوافق البيولوجي الجيد، وإزالة الكلى، والاقتران الحيوي السهل. يمكن أن توفر الـ PL AuNCs إضاءة ضوئية من الأزرق إلى المنطقة الطيفية القريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR) ، اعتمادًا على عدد الذرات داخل الكتلة11 وطبيعة الليغاند السطحي12. NIR (650-900 نانومتر) AuNCs الباعثة واعدة بشكل خاص لطويلة الأجل في المختبر وفي الجسم الحي تصوير الخلايا والأنسجة، لأنها توفر نسبة عالية إشارة إلى ضوضاء بسبب الحد الأدنى من التداخل مع الفلور الفلورية الجوهرية، وضعف التشتت والامتصاص، واختراق الأنسجة العالية من ضوء NIR13،14.

في السنوات الأخيرة، وقد وضعت النهج المختلفة التي تستفيد من التفاعلات الكوفة Au-S لإعداد NIR-PL AuNCs توج مع مجموعة متنوعة من الليغاند التي تحتوي على ثيول13،15،16،17. بالنسبة للتطبيقات الطبية الحيوية، يجب أن تكون أوانسياب المكونات الفعالة بمكون بيولوجي لتسهيل التفاعلات الملزمة. وهكذا، AuNCs مع استقرار الغرواني العالية التي هي قابلة للوظائف بسهولة في المذيبات المائية هي مرغوب ة للغاية. الهدف العام للبروتوكول الحالي هو وصف إعداد18 من AuNCs المبلغ عنها سابقًا مع مجموعة حمض كاربوكسيليك قابلة للتشغيل على السطح من خلال استخدام حمض الثيوكتيك وجلايكول البولي إيثيلين (PEG) في بيئة مائية بالتفصيل واقترانها مع جزيئات تحمل أمينًا أساسيًا يتبع طريقة اقتران الحمض الأمين. بسبب سهولة التوليف والتكاثر العالي ، يمكن استخدام هذا البروتوكول وتكييفه من قبل باحثين من خلفيات غير كيميائية.

أحد المتطلبات الرئيسية لتطبيقات AuNCs في البحوث الطبية الحيوية هو القدرة على مراقبة وقياس AuNCs داخل الخلايا. من بين الطرق المتاحة لرصد استيعاب الجسيمات النانوية من قبل الخلايا، والتدفق الخلوي (FCM) والمسح المجهري للأشعة المحورية (CLSM) توفر قوية، وطرق عالية الإنتاجية التي تسمح قياسات سريعة من استيعاب المواد النانوية الفلورية في عدد كبير من الخلايا19. هنا ، تم تقديم طريقة FCM و CLSM للقياس والتحليل المباشرين لـ PL AuNCs داخل الخلايا ، دون الحاجة إلى أصباغ إضافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد AuNCs شبه الأشعة تحت الحمراء الباعثة (1)

  1. أضف 7.8 ملغ (37.8 ميكرومول) حمض الثيوكتيك (TA) و60 ميكرولتر من 2 M NaOH إلى 23.4 مل من الماء فائق النقاء (المقاومة 18.2 MΟ.cm عند 25 درجة مئوية) وحرك (على الأقل 1000 دورة في الدقيقة) حتى يذوب تمامًا (~ 15-20 دقيقة). لإنحلال أسرع من TA، سونيكات الخليط. للتوليف، ينصح حل TA أعدت حديثا.
  2. أضف 10.2 ميكرولتر من HAuCl4·3H2O (470 ملغم/مل) من محلول مائي للحل.
  3. بعد 15 دقيقة، أضف 480 ميكرولتر من NaBH4 (1.9 ملغم/مل) تحت التحريك القوي (1000 دورة في الدقيقة على الأقل) وحرك خليط التفاعل تحت نفس الظروف بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: إعداد الطازجة الحل NaBH4 في الماء فائق النقاء الباردة الجليد وإضافة إلى خليط التفاعل مباشرة بعد التحضير.
    ملاحظة: توليف AuNCs قابل للتطوير بسهولة. تم تصنيع ما يصل إلى 2 L من AuNCs في دفعة واحدة ، دون أي تغيير في الخصائص البصرية للجسيمات.
  4. (حرج) في اليوم التالي، تنقية الحل عن طريق تطبيق ثلاث دورات من الطرد المركزي / الترشيح باستخدام جهاز ترشيح غشاء مع قطع الوزن الجزيئي من 3 كيلو دا. بدون إجراء التنقية هذا، لا تعمل الخطوة التالية بشكل صحيح.
  5. إضافة ثيول منهي ة البولي إيثيلين جليكول (MW 2,000; 15.6 ملغ; 7.8 ميكرومول) إلى الحل, ضبط درجة الحموضة إلى 7-7.5 وتحريك الخليط بين عشية وضحاها للحصول على 1. تنقية التشتت عن طريق تطبيق ثلاث دورات من الطرد المركزي / الترشيح باستخدام جهاز ترشيح غشاء مع قطع الوزن الجزيئي من 3 كيلو دا.
    ملاحظة: تعديل درجة الحموضة إلى 7-7.5 مهم للغاية. أعلى درجة الحموضة يمكن أن يؤدي إلى تحول الأزرق من الحد الأقصى للانبعاثات.

2- اقتران بروميد ثلاثي الفينيل فوسفونيوم (TPP) 3-(أمينوبروبيل) على سطح 1

  1. خلط الحل 1 (24 مل) أعدت في الخطوة السابقة و3-(أمينوبروبيل)بروميد ثلاثي الفينيل فوسفونيوم (12 ملغ، ~ 30 ميكرومول). ضبط درجة الحموضة إلى 4.5 مع 1 M HCl.
    ملاحظة: تم إعداد 3-(أمينوبروبيل)ثلاثي الفينيل فوسفونيوم (TPP) ملح بروميد كما هو موضح في الأدب20.
  2. بدء رد الفعل عن طريق إضافة فائض من N-(3-dimethyl-aminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide هيدروكلوريد (EDC· HCl) (60 ملغ، 312 ميكرومول). سوف يزيد درجة الحموضة من الحل ولا ينبغي السماح لها بتجاوز 6. مراقبة درجة الحموضة من خليط التفاعل للساعة الأولى. إذا زاد درجة الحموضة فوق 6، قم بتقليله إلى 4.5-6 بإضافة 1 M HCl.
  3. يُحرّك خليط التفاعل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  4. تنقية التشتت عن طريق تطبيق ثلاث دورات من الطرد المركزي / الترشيح باستخدام جهاز ترشيح غشاء مع قطع الوزن الجزيئي من 3 كيلو دا للحصول على 2. تم 2 الحصول على 2 مخففة هنا مع المياه فائقة النقاء إلى الحجم الأولي من 24 مل. تركيز Au في المحلول هو 200 ميكروغرام/مل.

3. ثقافة الخلية

  1. الثقافة هيلا الخلايا (HPA مجموعة الثقافة) في جلبكو المعدلة النسر المتوسط تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنين في 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية.
  2. تقسيم ومرور الخلايا عندما تصل إلى ~ 80٪ التقاء. ولتقليل اقتناء المسوخ الجديدة، ينبغي ألا يتجاوز عدد عمليات انتشار الخلايا 30.

4. استيعاب AuNC في خلايا HeLa

  1. بذر الخلايا في لوحة 12 بئر بكثافة 20,000 خلية /مل (1 مل/بئر). والهدف هو تحقيق ~ 50 ٪ التقاء بعد 48 ساعة.
  2. في 48 ساعة بعد البذر، يستنشق وسط الثقافة وإضافة 400 ميكرولتر من الثقافة الكاملة المتوسطة (للضوابط غير المعالجة) أو 500 ميكروغرام من الجسيمات النانوية في 400 ميكرولتر من المتوسط المثقف الكامل (للعينات المعالجة) إلى كل بئر. إعادة الثقافات إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: إضافة كميات كبيرة من حل AuNC يؤثر سلباً على صلاحية الخلية. وينبغي تركيز حلول الاتحاد الوطني الافريقي. لذلك 2 يُحصل عليها في الخطوة 2.4 تتركز 100 أوقات. وتركزت 40 مل AuNC إلى 400 ميكرولتر. وأضيف 25 ميكرولتر أليوت من هذا المحلول المركز إلى 400 ميكرولتر وسائط ثقافة الخلية للحصول على تركيز AuNC المطلوب.
  3. بعد 2 ساعة من الاستيعاب، فصل الخلايا عن طريق trypsinization القياسية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. جمع العينات في أنابيب الطرد المركزي الدقيق البولي بروبلين والطرد المركزي لمدة 5 دقيقة عند 350 × غرام عند 4 درجات مئوية.
  5. إعداد المخزن المؤقت FCM التالية: قبل المبردة الفوسفات العازلة المالحة (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM نا2HPO4,1.47 mM NaH2PO4,pH 7.4) تكملها 2% الزلم المصل البقري في 4 °C.
  6. اغسل الكريات بـ 1 مل من المخزن المؤقت والطرد المركزي لـ 5 دقيقة عند 350 × ز عند 4 درجات مئوية.
  7. إعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FCM وتخزين العينات في 4 درجة مئوية قبل التحليل.

5. تدفق تحليل قياس الخلايا

  1. تصفية جميع العينات باستخدام أنبوب ربع متر البوليسترين مستديرة القاع مع غطاء مصفاة الخلية.
  2. قبل الحصول على البيانات باستخدام برنامج الصك، حدد تكوين مقياس الخلايا.
  3. تنسيق جميع المؤامرات النقطية والمخططات البيانية لـ "عمليات الاستحواذ".
  4. رسم قطعة نقطة من نقطتين للمنطقة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) والجانب مبعثر المنطقة (SSC-A) لإظهار توزيع الخلايا. لاستبعاد الازدواج، قم بإنشاء قطعة أرض نقطة ثنائية المعلمة لارتفاع FSC (FSC-H) مقابل FSC-A. لمراقبة شدة الفلورسان النسبية في العينة، قم برسم مخطط بياني أحادي المعلمة لمنطقة القناة الفلورية (FL-A). استخدم مقياسًا خطيًا لتصوير بيانات FSC وSSC، ومقياس لوغاريتمي لجميع معلمات الفلورسنت.
  5. الحصول على عينة غير المعالجة (بدون جسيمات نانوية) بمعدل تدفق منخفض لتقليل الأحداث المتزامنة (إذا سمحت بها الأداة). أثناء الاستحواذ، قم بضبط الفولتية الأنبوبية الضوئية (PMT) للحصول على السكان غير المعالجين على نطاق واسع على مؤامرة FSC مقابل SSC. إذا لزم الأمر، ضبط الفولتية PMT لقناة FL لوضع السكان غير الملطخة على الزاوية اليسرى من الرسم البياني.
  6. حدد "علامة التبويب البوابة" المحددة في البرنامج ورسم بوابة مناسبة حول السكان المطلوبين. الخلايا داخل البوابة ستنتقل إلى نقطة التفتيش التالية.
  7. سجل 10,000 حدث لكل عينة.
  8. تسجيل كافة العينات تحت إعدادات الأداة نفسها.
  9. استخدم برنامجًا مناسبًا لتحليل بيانات قياس الخلايا المتدفقة.
    ملاحظة: قد تتطلب بعض التطبيقات إعداد مخصص للفلاتر. لتبادل تصفية دائما اتبع توصيات التصنيع في دليل المستخدم.
    ملاحظة: يمكن حفظ التجربة وإعادة تحميلها للحفاظ على إعدادات الأداة واستراتيجية الجاتينغ.
    ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام ارتفاع مبعثر الجانب (SSC-H) مقابل منطقة مبعثر الجانب (SSC-A) مؤامرة لاستبعاد مزدوج. هذا النوع من الجاتينغ يمكن أن تكون أكثر حساسية كما كاشف FSC ليس عادة PMT.

6. استيعاب 2 في خلايا هيلا لمسح الليزر الكونكونت (CLSM)

  1. بذر الخلايا على طبق زجاجي من 4 غرف 35 مم بكثافة 250,000 خلية/مل (0.5 مل/غرفة). احتفظ بالغرفة في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو CO2 بنسبة 5٪. والهدف هو تحقيق ~ 50 ٪ التقاء بعد 24 ساعة.
  2. في 24 ساعة بعد البذر، إضافة 100 ميكروغرام من 2 (أو 10 ميكرولتر من محلول الأسهم من 10 ملغ /مل) إلى كل غرفة طبق تحتوي على 0.5 مل من المتوسط مع الخلايا (للعينات المعالجة).
  3. أعد الطبق إلى الحاضنة. السماح للخلايا استيعاب AuNCs لمدة 24 ساعة قبل استخدامها لCLSM.
  4. بعد فترة الاستيعاب، تخلص من الوسط واغسل الخلايا بمتوسطة طازجة مُدفئة مسبقًا لمدة 5 دقيقة. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى. ثم ملء كل غرفة مع 800 ميكرولتر من المتوسط الطازج.

7. CLSM التصوير من خلايا هيلا الحية وصفت مع 2

  1. للتصوير المجهري، استخدم 63x زيت (n = 1.518) عدسة موضوعية (NA = 1.4) في مجهر بؤري مع بلان-أبوكرومات.
  2. قم بتركيب الطبق على المجهر المقلوب مع حرارة الغرفة إلى 37 درجة مئوية وتزويدهابغلاف جوي مرطب من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
  3. للكشف عن AuNC داخلي، استخدم مجموعة ليزر 405 نانومتر في قوة 2٪ مع مقسم شعاع المناسبة. تعيين نطاق الأطوال الموجية الكشف بين 650 و 760 نانومتر.
  4. تعيين دقة الصورة إلى 2048 × 2048 بكسل. في إعداد سرعة الاستحواذ ، الهدف لبكسل يسكن الوقت حول 4 μs. الحصول على الصورة مع متوسط 2x (وضع الخط ، متوسط متوسط طريقة المتوسط). تعيين الثقب إلى 1 وحدة Airy (ل405 نانومتر ضوء). للحصول على حساسية أعلى، استخدم وضع عد الفوتون.
  5. للإضاءة الصحيحة في الضوء المرسل مع تباين التداخل التفاضلي (DIC)، استخدم إعداد Köhler للمكثف وتوقف الحقل. للحصول على الضوء المرسل، استخدم ليزر 488 نانومتر بقوة 0.7٪ دون تعيين أي كاشف للفلورسينس. تعيين مقسم شعاع المناسبة لطول موجة الليزر.
  6. الحصول على صورتين لكل مسار (الفلورسينس الأحمر وDIC). تتبع AuNCs من الفلورسال الأحمر؛ يتم تحديد حدود الخلية بسهولة في الضوء المرسل مع صور DIC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إعداد NIR PL AuNCs من Au3+ في وجود TA ، ثم تم ربط PEG (MW 2000) على سطح AuNC للحصول على 1 بعد سير العمل المبين في الشكل 1. قدم اقتران أميديك بين 1 و 3-(أمينوبروبيل) ثلاثي الفينيل فوسفونيوم (TPP) بروميد 2. كما هو متوقع ، أشارت أطياف الامتصاص(الشكل 2a)إلى أن AuNCs 1 و 2 ليس لديهم نطاق بلازمون سطح مميز وتظهر انبعاثات واسعة من 550 نانومتر إلى 850 نانومتر(الشكل 2b). بعد تعلق TPP على سطح 1، زاد PL بقوة. الانبعاثات من AuNCs كانت مرئية أيضا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر، الشكل 2b inset). الانبعاثات من AuNCs مستقرة والطول الموجي للانبعاثات مستقل عن الطول الموجي الإثارة(الشكل 2c). ومع ذلك، فإن كثافة الانبعاثات هي أقصى حد عندما متحمس مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

تم الكشف عن 2 داخل خلايا هيلا عن طريق رصد PL على مقياس التدفق الخلوي. تم احتضان خلايا HeLa لمدة ساعتين مع 2 في تركيزات وسائل الإعلام بين 0.5 ملغ / مل و 2 ملغ / مل. أكدت بيانات FCM الالتقاط من 2 من قبل خلايا هيلا. كان مفلورة NIR (>720 نانومتر) تعتمد على كلا الوقتين(الشكل 3a)وتركيز 2 (الشكل 3b). لوحظ تشدة قصوى مع مرشح ممر الفرقة 780/60.

تم تصوير AuNCs داخل الخلايا بشكل غير جراحي باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري القياسي. ويبين الشكل 4 الصورة المحورية لخلايا هيلا الملطخة بـ 2 (200 ميكروغرام/مل). بعد 24 ح من الحضانة الحمراء الزاهية photoluminescence من 2 داخل الخلايا لوحظ.

Figure 1
الشكل 1: توليف المجموعات النانوية الذهبية. سير العمل لإعداد 1 و 2. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الخصائص البصرية للمجموعات النانوية الذهبية. تطبيع(أ)أطياف امتصاص (Inset: صورة للحلول المائية من 1 و 2 تحت الضوء الأبيض) و(ب)أطياف photoluminescent من 200 ميكروغرام / مل حلول مائي من 1 و 2 (Inset: صورة من حلول AuNC تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر)). (ج)الإثارة والانبعاثات PL خريطة من 2. يتم نقل الإثارة بمقدار 10 نانومتر خطوات. ذروة الانبعاثات حول 750 نانومتر مستقرة جدا (لا تتحول مع الإثارة) ويظهر تحولا هائلا ستوكس من الإثارة. الإثارة الأكثر كفاءة يحدث حوالي 340 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الكشف عن مجموعات نانوية ذهبية داخل خلايا HeLa عن طريق قياس الخلايا المتدفقة. تمت دراسة استيعاب 2 في خلايا HeLa باستخدام FCM. تظهر المخططات البيانية(أ)الوقت و(ب)الالتقاط المعتمد على التركيز من AuNCs بواسطة خلايا HeLa. في التجربة المعتمدة على الوقت ، كانت خلايا HeLa غير معالجة (التحكم ؛ 0 ح) أو عولجت بـ 1.28 ملغم / مل 2 واحتضنت عند 37 درجة مئوية للأوقات المشار إليها. ثم تم غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتحليلها من قبل FCM. في التجربة التي تعتمد على التركيز ، كانت خلايا HeLa غير معالجة (التحكم ؛ 0 ملغ / مل) أو تعامل مع التركيزات المشار لها من 2 ومعالجتها بنفس الطريقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصوير CLSM لخلايا هيلا الموسومة بمجموعات النانو الذهبية. تم احتضان خلايا HeLa بـ 2 (200 ميكروغرام/مل) لمدة 24 ساعة وصورتها باستخدام CLSMa. (ب) قناة الضوء المرسلة (DIC) و(ج)هي تراكب(أ)و(ب). شريط مقياس، 50 ميكرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: اختبار الاستقرار من 1. أطياف الفوتولوميسينس من 1 في 1 M NaCl في 0 ساعة وبعد 72 ساعة. تم تطبيع كثافة إلى أقصى حد. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تصنيع AuNCs الباعثة للنير باستخدام نهج من أسفل إلى أعلى حيث تم التعامل مع محلول السلائف الذهبية (HAuCl4)مع ليغاند اتيول مناسبة ، تليها تخفيض Au3 +. الحد من الأيونات المعدنية في محلول مائي تميل إلى تجميع والنتائج في الجسيمات النانوية الكبيرة بدلا من NCs صغيرة جدا21. لإعداد فائقة الصغر (≤ 2 نانومتر) PL AuNCs ، تم تعديل الشروط الاصطناعية لمنع تكوين الجسيمات الكبيرة وتعزيز تشكيل مجموعات صغيرة جدًا. طبيعة ligands المستخدمة لغطاء سطح AuNC يلعب أيضا دورا هاما في التأثير على هيكل والخصائص الإلكترونية والبصرية للجسيمات12،22 ،23،2324،25,،26،27،28،29،30. لذلك ، فإن اختيار ligands المناسبة القادرة على تثبيت مجموعات صغيرة جدًا هو المفتاح للحصول على AuNCs فلورية للغاية. الليغاندات المحتوية على الثيول هي المثبتات الأكثر استخداما في توليف AuNCs ، بسبب الترابط القوي بين الثيولز والذهب. يشير تقرير سابق31 إلى أن الليغاندات القائمة على التعدد ية أعلى بكثير من ligands أحادية الأونيال في تثبيت الـ PL AuNCs. توفر الليغاندات متعددة الثيول استقرارًا غروانيًا معززًا لـ AuNCs بسبب ارتفاع عدد مواقع الربط بين سطح ligand وAuNC. تم استخدام Bidentate thiol TA لتركيب NIR PL AuNCs لأنه يوفر استقرار ًا غروانيًا محسّنًا كثيرًا لـ AuNCs على مدى مجموعة واسعة من الظروف المعاكسة مقارنة ً بـ ligands أحادي ة المدى32. TA كما يوفر نمو المرحلة المائية من الجسيمات النانوية مع التحكم في حجم منفصلة، والأهم من ذلك، فإنه يقدم مجموعة حمض الكربوكسيليك على سطح الجسيمات النانوية التي يمكن استخدامها لاقتران الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا33،,34.

TA يستقر AuNCs عن طريق التنافر الكهربائي الناجم عن مجموعات carboxylate deprotonated على السطح35. ومع ذلك ، في الحلول الحمضية ، تصبح AuNCs المحمية من TA غير مستقرة بشكل غرواني بسبب البروتونات لمجموعة carboxylate. يمكن تثبيت الجسيمات النانوية بقوائم انتخابية ، بدلاً من الكهرباء البحتة. يوفر هذا النهج تثبيت ًا غروانيًا حتى في وجود تركيزات ملح عالية وتغيرات في درجة الحموضة ، وهو أمر مهم للتطبيقات الطبية الحيوية. لمنح تثبيت electlistic إلى TA-AuNCs ، تم في وقت لاحق وظيفية المجموعات مع PEG التي تم إنهاؤها من thiol (MW 2000) بنسبة 5:1 من الأضرار TA:PEG ، مما أسفر عن 1 (الشكل 1). للحصول على التعلق الناجح من PEG التي تم إنهاؤها من thiol ، يجب تنقية TA-AuNCs. وقد تحسنت الكفاءة في AuNC مع PEG الذوبان المائية في درجة الحموضة الحمضية وزيادة في الاستقرار الغرواني في وسائل الإعلام قوة عالية الأيونية. من المهم أن يتم إرفاق PEG التي تم إنهاؤها من thiol عند درجة الحموضة 7.0-7.5. ارتفاع درجة الحموضة سيؤدي إلى التحول الأزرق من الحد الأقصى للانبعاثات. تمت إزالة ligands غير المنضمة عن طريق الطرد المركزي / الترشيح باستخدام جهاز ترشيح غشاء مع قطع الوزن الجزيئي من 3 كيلو دا. الليغاندات التي ترتبط مع الجسيمات النانوية تجربة خط كبير توسيع في 1H NMR بالمقارنة مع ligands الحرة، والتي يمكن أن تحجب المهام الذروة والتكامل36. واسعة بشكل ملحوظ 1H NMR الذروة المرتبطة حمض الثيوتيك والبولي ايثيلين المعدلة ثيول جليكول يشير إلى أن ligands ملزمة إلى سطح AuNC وإزالة ليغاندس الحرة18. يتطلب الاندماج الناجح للمركبات المضيئة في بيئة بيولوجية الاستقرار على الظروف، مثل القوة الأيونية العالية لأن الوسائط البيولوجية غنية بما يزيد على الأيونات. تم التحقق من استقرار 1 من خلال رصد الإضاءة الضوئية في 1 M NaCl على مدى فترة 72 ساعة. لا يوجد تغيير كبير في خصائص اللوميناتات في 1 M NaCl يشير إلى استقرار عال من AuNCs(الشكل التكميلي 1). كانت مراكز النُكُف مستقرة في محلول مؤقت لأكثر من عام دون أي دليل على هطول الأمطار (لم تظهر البيانات).

1 يقدم حمض الكربوكسيليك على السطح. Carbodiimide القائمة على الكواشف اقتران تستخدم على نطاق واسع لربط مغص أحماض الكربوكسيليك إلى الأمينات عن طريق تشكيل السندات amide37. الأكثر استخداما carbodiimide القائم على الكاشف اقتران في محلول مائي هو 1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) هيدروكلوريد كاربوميد (EDC•HCl). وقد استخدمت EDC•HCl للاقتران covalent من بروميد TPP مع 1 للحصول على 2. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هو اقتران الجزيئات مع مجموعة الأمين الأولية عن طريق تكوين السندات أميدي دون المساس الفلورسية والاستقرار الغرواني. أظهر توصيف المجهر الإلكتروني عالي الاستبانة (HRTEM) أن كلاً من AuNCs 1 و 2 يبلغ متوسط قطره 1.15 ± 0.2 نانومتر، مما يشير إلى أن الاقتران الوظيفي لا يغير الحجم الأساسي لـ AuNCs18. بدلا من ذلك، يمكن تنشيط مجموعات كاربوكسيلي الحرة باستخدام EDC وSulfo-NHS38. حلول 1 و 2 متحمس مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) الفلورس الأحمر الساطع(الشكل 1b، inset)، في حين أنها تظهر صفراء فاتحة تحت الإضاءة المحيطة(الشكل 1a، inset). اقتران TPP يزيد من AuNC PL بسبب نقل الرسوم المعدنية إلى ligand (MLCT)18.

يمكن أن تسبب الجسيمات النانوية آثارًا بيولوجية ضارة يمكن أن تحد من تطبيقاتها في علم الأحياء. لتقييم السمية الخلوية من 2 على خلايا هيلا, XTT (الصوديوم 2, 3-bis (2-ميثوكسي-4-نيترو-5-sulfophenyl)-5-(الفينيلامينو)-carbonyl]-2H-tetrazolium الملح الداخلي) تم تنفيذ صلاحية الخلية القدرة على البقاء. لم تظهر خلايا HeLa المعالجة بـ 2 (200 ميكروغرام/مل) لمدة 48 ساعة أي فقدان لصلاحية الخلية مقارنة بخلايا التحكم. وتشير هذه الملاحظة إلى أن مراكز الإن إن متوافقة بيولوجياً، مما يجعلها واعدة بالمرشحين كتحقيقات فلورية لتطبيقها في البحوث البيولوجية.

عندما متحمس مع ليزر 405 نانومتر، 2 يوفر انبعاثات واسعة مع الحد الأقصى حوالي 750 نانومتر. التحول ستوكس كبيرة للغاية (~ 350 نانومتر) يسمح للضوء المنبعث أن تكون متميزة بشكل موثوق من مصدر الضوء مثيرة; ومع ذلك، يجب تكوين إعداد عامل تصفية FCM بشكل مناسب. بالنسبة لـ 2، يعد فلتر ممر النطاق 780/60 نانومتر مثاليًا نظرًا لاتساع الفلتر وحقيقة أن الحد الأقصى للانبعاثات من AuNCs موجود في نفس المنطقة. من المهم جدا استخدام مرشحات باندباس واسعة في منطقة الانبعاثات ماكسيما للكشف الفعال من PL39،40،41،42. تشير إشارة الفلورسيز المعتمدة على الوقت والجرعة من الخلايا المعالجة بـ 2 إلى أنه يمكن استخدام FCM لمراقبة دراسات الخلايا بسهولة باستخدام AuNCs. وعندما زاد وقت الحضانة إلى 24 ساعة، كان تركيز 40 ميكروغرام/مل قدره 2 كافياً للكشف عن الفلورات عن طريق الفلورسفية في FCM (البيانات غير مبينة). ومع ذلك، بالنسبة لفترات الحضانة القصيرة (1-2 ساعة)، هناك حاجة إلى تركيزات أعلى من AuNCs. وهذه الطريقة في الكشف عن AuNCs بواسطة إشارة الفلور سفلورس مع مقياس تدفق قياسي يساعد على زيادة توسيع التطبيقات المحتملة للأوانكفيس في العلوم الطبية الحيوية. ويمكن استخدام النهج الموصوف هنا لتقييم معدلات وآليات التناول الخلوي14، والعلاقات بين تركيز الجسيمات النانوية والسمية الخلوية ، أو آثار الكيمياء السطحية على المدى النانوي بطريقة سريعة وكمية باستخدام FCM.

تم التقاط الخلوية من 2 من قبل خلايا هيلا تم التقاطها من قبل CLSM. بعد 24 ح من الانبعاثات الحمراء الزاهية من 2 تم الكشف عن الإثارة مع ليزر 405 نانومتر. ومع ذلك ، ليزر 405 نانومتر يثير أيضا الفلوروفوريات الجوهرية داخل الخلايا. وللتمييز بين إشارة أوكون وأوفلورسينس، تم جمع الانبعاثات من نظام AuNC فوق 650 نانومتر. الخصائص الجذابة ، مثل مشرق تحت الحمراء تحت الحمراء الإنارة ، وارتفاع الاستقرار الغرواني ، والتوافق البيولوجي جيدة والنتائج أعلاه تثبت أن AuNCs هي وكلاء التصوير واعدة لتطبيقات التصوير الطبية الحيوية والخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد سبق عرض بعض أجزاء الأساليب والنتائج في المقال الذي قدمه برامانيك وآخرون18 هنا، وقد حُولت هذه الأساليب إلى بروتوكولات عملية من نقطة بنقطة. ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

المؤلفون ممتنون لAlzbeta Magdolenova لمساعدتها في تدفق قياس الخلايا. ويعترف المؤلفون بالدعم المالي المقدم من مشروع GACR Nr. 18-12533S. وقد أُجري الفحص المجهري في مختبر الكونكورت والتنظير المجهري للفلورسينس الذي شارك في تمويله صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي وميزانية الدولة للجمهورية التشيكية، وهي مشاريع رقم 1000.100. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 و CZ.2.16/3.1.00/21515، وبدعم من مشروع جمهورية تحرير جمهورية التشيك-BioImaging الكبيرة LM2015062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
  2. Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  3. Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
  4. Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
  5. Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
  6. Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
  7. Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
  8. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
  9. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
  10. Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
  11. Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
  12. Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
  13. Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
  14. Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
  15. Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
  16. Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
  17. Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
  18. Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
  19. Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
  20. Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
  21. Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
  22. Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
  23. Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
  24. Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
  25. Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
  26. Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
  27. Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
  28. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
  29. Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
  30. Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
  31. Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
  32. Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
  33. Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
  34. Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
  35. Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
  36. Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
  37. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  38. Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
  39. Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
  40. Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
  41. Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
  42. Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 157، النانوكتلة الذهبية، Photoluminescent، شبه الأشعة تحت الحمراء، ارتفاع الكم العائد، تدفق القياس الخلوي، المجهر الكونكونتر
تركيب مجموعات نانوية ذهبية قريبة من الأشعة تحت الحمراء للتطبيقات البيولوجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pramanik, G., Keprova, A., Valenta,More

Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter