Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese af nær-infrarøde udsender guld nanoklynger til biologiske anvendelser

Published: March 22, 2020 doi: 10.3791/60388
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4, 3, 1
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics, Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University, 4First Faculty of Medicine, Charles University

Summary

En pålidelig og let reproducerbar metode til fremstilling af funktionaliserbare, nær-infrarøde udsender fotoluminescerende guld nanoclusters og deres direkte detektion inde HeLa celler ved flow cytometri og konfokal laser scanning mikroskopi er beskrevet.

Abstract

I løbet af det seneste årti har fluorescerende guld nanoclusters (AuNCS) været vidne til stigende popularitet i biologiske applikationer og enorme indsats har været afsat til deres udvikling. I denne protokol er en nyligt udviklet, letkøbt metode til fremstilling af vandopløselige, biokompatible og i daglige stabile nær-infrarøde udleder AuNC'er blevet beskrevet i detaljer. Denne rum-temperatur, bottom-up kemisk syntese giver let funktionsdygtige AuNC'er udjævnet med thioctisk syre og thiol-modificeret polyethylenglycol i vandig opløsning. Den syntetiske tilgang kræver hverken organiske opløsningsmidler eller yderligere ligandudveksling eller omfattende viden om syntetisk kemi for at reproducere. De resulterende AuNC'er tilbyder gratis overfladecarboxylsyrer, som kan funktionaliseres med forskellige biologiske molekyler, der bærer en gratis amingruppe uden at påvirke AuNC'ernes fotoluminescerende egenskaber negativt. En hurtig, pålidelig procedure for flow cytometrisk kvantificering og konfokal mikroskopisk billeddannelse af AuNC optagelse af HeLa celler også blevet beskrevet. På grund af den store Stokes skift, korrekt indstilling af filtre i flow cytometri og konfokal mikroskopi er nødvendig for effektiv påvisning af nær-infrarød fotoluminescens af AuNC'er.

Introduction

I det seneste årti har ultrasmå (≤ 2 nm) fotoluminescerende guldnanoklynger (PL AuNC'er) vist sig at være lovende sonder til både grundforskning og praktiske anvendelser1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Deres mange ønskelige egenskaber omfatter høj fotostabilitet, afstemmelige emissionsmaksima, lange emissionslevetider, store Stokes skift, lav toksicitet, god biokompatibilitet, nyreclearance og letkøbt biokonjugering. PL AuNC'er kan levere fotoluminescens fra det blå til det nær-infrarøde (NIR) spektrale område, afhængigt af antallet af atomer i klyngen11 og overfladens art ligand12. NIR (650-900 nm) udsender AuNC'er er særligt lovende for langsigtede in vitro og in vivo billeddannelse af celler og væv, da de tilbyder høj signal-støj-forhold på grund af minimal overlapning med iboende autofluorescens, svagere spredning og absorption, og høj væv penetration af NIR lys13,14.

I de senere år er der udviklet forskellige tilgange , der udnytter Au-S's kovalente interaktioner til at forberede NIR-PL AuNCs udjævnet med en række thiolholdige ligander13,15,16,17. Til biomedicinske anvendelser skal AuNC'er funktionaliseres med en biologisk komponent for at lette bindende interaktioner. Således aunccs med høj kolloid stabilitet, der er let funktionsdygtige i vandigopløsningsmiddel er meget ønskeligt. Det overordnede mål med den nuværende protokol er at beskrive et tidligere rapporteret18 præparat af AuNC'er med en funktionaliserbar carboxylsyregruppe på overfladen ved at anvende thioctisk syre og polyethylenglycol (PEG) i et vandigt miljø og deres bøjning med molekyler, der bærer en primær amin efter syreaminkoblingsmetoden. På grund af den lette syntese og høje reproducerbarhed, kan denne protokol bruges og tilpasses af forskere fra ikke-kemiske baggrunde.

En af de vigtigste forudsætninger for anvendelse af AuNC'er i biomedicinsk forskning er evnen til at observere og måle AuNC'er inde i celler. Blandt de metoder til rådighed til at overvåge nanopartikel optagelse af celler, flow cytometri (FCM) og konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) tilbyder robuste, høj-throughput metoder, som giver mulighed for hurtige målinger af internalisering af fluorescerende nanomaterialer i stort antal celler19. Her er FCM- og CLSM-metoden til direkte måling og analyse af PL AuNC'er i celler, uden behov for yderligere farvestoffer, også blevet præsenteret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af nær-infrarøde udsender AuNC'er (1)

  1. Der tilsættes 7,8 mg (37,8 μmol) thioctisk syre (TA) og 60 μL på 2 M NaOH til 23,4 ml ultrarent vand (resistivitet 18,2 MΩ.cm ved 25 °C) og omrøres (mindst 1.000 omdr./min.), indtil det opløses helt (~15-20 min). For hurtigere opløsning af TA, sonikere blandingen. Til syntesen anbefales frisklavet TA-opløsning.
  2. 10,2 μL HAuCl4·3H2O (470 mg/ml) af vandig opløsning tilopløsningen.
  3. Efter 15 min tilsættes 480 μL NaBH4 (1,9 mg/ml) under kraftig omrøring (mindst 1.000 rpm) og der omrøres under de samme forhold natten over.
    BEMÆRK: NaBH4-opløsningen tilberedes frisk i iskoldt ultrarent vand, og der tilsættes den umiddelbart efter klargøringen.
    BEMÆRK: Syntesen af AuNC'er er let skalerbar. Op til 2 L AuNC'er blev syntetiseret i et enkelt parti uden nogen ændring i partiklernes optiske egenskaber.
  4. (Kritisk) Den næste dag renses opløsningen ved at anvende tre cyklusser af centrifugering/filtrering ved hjælp af en membranfiltreringsanordning med en molekylvægtsafskæring på 3 kDa. Uden denne rensningprocedure fungerer følgende trin ikke korrekt.
  5. Der tilsættes thiolafsluttet polyethylenglycol (MW 2.000; 15,6 mg; 7,8 μmol) til opløsningen, pH justeres til 7-7,5, og blandingen omrøres natten over for at opnå 1. Dispersionen renses ved anvendelse af tre centrifugerings-/filtreringscyklusser ved hjælp af en membranfiltreringsanordning med en molekylvægtsafskæring på 3 kDa.
    BEMÆRK: Justering af pH til 7-7,5 er yderst vigtig. Højere pH kan resultere i en blå skift af emission maxima.

2. Konjugering af 3-(aminopropyl)triphenylphosphonium bromid (TPP) på overfladen af 1

  1. 1 opløsning (24 ml) fremstillet i det foregående trin og 3-(aminopropyl)triphenylphosphonium bromid (12 mg, ~30 μmol). PH justeres til 4,5 med 1 M HCl.
    BEMÆRK: 3-(Aminopropyl)triphenylphosphonium (TPP) bromid salt blev udarbejdet som beskrevet i litteraturen20.
  2. Start reaktionen ved at tilføje et overskud på N-(3-dimethyl-aminopropyl)-N′-ethylcarbodimidhydrochlorid (EDC· HCl) (60 mg, 312 μmol). PH-værdien af opløsningen vil stige og bør ikke have lov til at gå ud over 6. Vog reaktionsblandingens pH-værdien i den første time. Hvis pH stiger over 6, reducere det til 4,5-6 ved at tilføje 1 M HC.
  3. Rør reaktionsblandingen natten over ved stuetemperatur.
  4. Dispersionen renses ved anvendelse af tre centrifugerings-/filtreringscyklusser ved hjælp af en membranfiltreringsanordning med en molekylvægtsafskæring på 3 kDa for at opnå 2. Fortyndes 2 her med ultrarent vand til det oprindelige rumfang på 24 ml. Koncentrationen af Au i opløsningen er 200 μg/ml.

3. Cellekultur

  1. Kultur HeLa celler (HPA kultur indsamling) i Dulbecco's modificerede Eagle's Medium suppleret med 10% føtale kvæg serum i 5% CO2 ved 37 °C.
  2. Split og passage cellerne, når de når ~ 80% sammenløb. For at minimere erhvervelsen af nye mutanter bør antallet af celleformeringer ikke overstige 30.

4. AuNC internalisering i HeLa celler

  1. Frø cellerne i en 12-brøndplade ved en massefylde på 20.000 celler/ml (1 ml/brønd). Målet er at opnå ~ 50% sammenløb efter 48 h.
  2. Ved 48 timers postsåning skal dyrkningsmediet aspireres, og der tilsættes 400 μL komplet dyrkningsmedium (til ubehandlede kontroller) eller 500 μg nanopartikler i 400 μL komplet dyrket medium (for behandlede prøver) til hver brønd. Kulturindvendes til en 37 °C-inkubator.
    BEMÆRK: Tilsætning af store mængder AuNC-opløsning påvirker cellens levedygtighed negativt. AuNC-opløsninger skal koncentreres. Således 2 opnået i trin 2.4 er koncentreret 100 gange. 40 ml AuNC var koncentreret til 400 μL. En 25 μL aliquot af denne koncentrerede opløsning blev tilsat til 400 μL cellekulturmedier for at opnå den ønskede AuNC-koncentration.
  3. Efter 2 timers internalisering, frigøre cellerne ved standard trypsinisering i henhold til producentens protokol.
  4. Prøverne udtages i mikrocentrifugerør af polypropylen og centrifugeres i 5 min ved 350 x g ved 4 °C.
  5. Fremstille følgende FCM-buffer: forkølet fosfatbuffer (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM NaH2PO4, pH 7,4) suppleret med 2% kvægserumalbumin ved 4 °C.
  6. Pillerne vaskes med 1 ml FCM-buffer og centrifugeres i 5 min ved 350 x g ved 4 °C.
  7. Pelletsen suspenderes i 500 μL FCM-buffer og prøverne opbevares ved 4 °C før analyse.

5. Flow cytometri analyse

  1. Alle prøver filtreres ved hjælp af et 5 ml polystyrenrundt underlag med cellesihætte.
  2. Før du henter data ved hjælp af instrumentsoftwaren, skal du angive cytometerkonfigurationen.
  3. Formateralle dot-plots og histogrammer for 'Acquisitions'.
  4. Plot et punktområde med to parametre af det forreste punktområde (FSC-A) og sidespredningsområdet (SSC-A) for at vise fordelingen af celler. Hvis du vil udelukke doublets, skal du oprette et punktplot med to parametre af FSC-højde (FSC-H) vs. FSC-A. For at overvåge prøvens relative fluorescensintensitet afbildes et histogram med en enkelt parameter for det fluorescerende kanalområde (FL-A). Brug en lineær skala til at vise FSC- og SSC-data og en logaritmisk skala for alle fluorescerende parametre.
  5. Der anskafuviet ubehandlet prøve (uden nanopartikler) med lav strømningshastighed for at minimere sammenfaldende hændelser (hvis det er tilladt af instrumentet). Under erhvervelsen justeres fotomultiplikatorrørets (PMT) spændinger for at få den ubehandlede befolkning på skalaen på FSC vs SSC-plottet. Hvis det er nødvendigt, justerePMT spændinger for FL kanal til at placere den ubefarvede befolkning på venstre hjørne af histogrammet.
  6. Vælg den specifikke 'gate tab' i softwaren og tegne en passende port omkring den ønskede befolkning. Celler inde i porten vil flytte til det næste checkpoint.
  7. Optag 10.000 hændelser pr. eksempel.
  8. Registrer alle prøver under de samme instrumentindstillinger.
  9. Brug et passende program til at analysere flowcytometridataene.
    BEMÆRK: Nogle programmer kræver muligvis tilpasset opsætning af filtre. For filterudveksling skal du altid følge producentens anbefalinger i brugervejledningen.
    BEMÆRK: Eksperimentet kan gemmes og genindlæses for at bevare instrumentindstillingerne og gatingstrategien.
    BEMÆRK: En side punkthøjde (SSC-H) vs side scatter område (SSC-A) plot kan også bruges til dobbeltt udelukkelse. Denne type gating kan være mere følsom, da FSC-detektoren normalt ikke er en PMT.

6. Internalisering af 2 i HeLa-celler til konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM)

  1. Cellerne frøs på en 4-kammers glasbund på 35 mm ved en massefylde på 250.000 celler/ml (0,5 ml/kammer). Hold kammeret i en 37 °C inkubator med 5% CO2 atmosfære. Målet er at opnå ~ 50% sammenløb efter 24 timer.
  2. Ved 24 timers postsåning tilsættes 100 μg 2 (eller 10 μL fra stamopløsningen på 10 mg/ml) til hvert skålkammer, der indeholder 0,5 ml medium med cellerne (for behandlede prøver).
  3. Returner skålen til kuvøsen. Lad cellerne internalisere AuNC'erne i 24 timer, før de anvendes til CLSM.
  4. Efter internaliseringsperioden kasseres mediet, og cellerne vaskes med forvarmet frisk medium i 5 min. Gentag vasketrinnet igen. Fyld derefter hvert kammer med 800 μL frisk medium.

7. CLSM Billeddannelse af levende Hela-celler mærket med 2

  1. Til mikroskopisk billeddannelse anvendes 63x olie (n = 1,518) objektivlinse (NA = 1,4) i et konfokalmikroskop med Plan-Apochromat.
  2. Monter skålen på mikroskopet omvendt fase med kammeret opvarmet til 37 °C og leveres med befugtet 5% CO2 atmosfære.
  3. For at detektere internaliseret AuNC skal du bruge en 405 nm laser, der er indstillet til 2% effekt med en passende strålesplitter. Indstil bølgelængderne mellem 650 og 760 nm.
  4. Indstil billedets opløsning til 2048 x 2048 pixel. I indstillingen for anskaffelseshastighed skal du sigte efter en pixeldvæletid på ca. 4 μs. Anskaf billedet med et gennemsnit på 2x (linjetilstand, gennemsnitsmetodegennemsnit). Indstil pinhole til 1 luftig enhed (for 405 nm lys). Brug fotontællingstilstand for at få større følsomhed.
  5. For korrekt belysning i transmitteret lys med differentialinterferenskontrast (DIC) skal du bruge Köhlers indstilling af kondensatoren og feltstoppet. Til erhvervelse af transmitteret lys, bruge en 488 nm laser ved 0,7% magt uden fluorescens detektor tildelt. Indstil en passende strålesplitter til laserbølgelængden.
  6. Anskaf to billeder for hvert spor (rød fluorescens og DIC). Spor AuNC'er ved deres røde fluorescens; cellegrænser kan nemt bestemmes i det transmitterede lys med DIC-billeder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NIR PL AuNCs blev udarbejdet fra Au3+ i overværelse af TA, og derefter thiol-opsagt PEG (MW 2.000) var bundet på AuNC overfladen for at opnå 1 efter arbejdsgangen vist i figur 1. Amidisk kobling mellem 1 og 3-(aminopropyl) triphenylphosphonium (TPP) bromid forudsat 2. Som forventet viste absorptionsspektre (figur 2a), at AuNC1 1 og 2 ikke har et karakteristisk plasmonbånd på overfladen og udviser bred emission fra 550 nm til 850 nm ( figur2b). Efter fastgørelse af TPP til overfladen af 1, PL steget kraftigt. Emission fra AuNC'er var også synlig under UV-lys (365 nm, figur 2b indsat). Emissionen fra AuNC'er er stabil, og emissionsbølgelængden er uafhængig af excitationsbølgelængde (figur 2c). Men emissionsintensiteten er maksimal, når den er spændt med UV-lys.

2 blev opdaget inde hela celler ved at overvåge PL på et flow cytometer. HeLa-cellerne blev inkuberet i 2 timer med 2 i mediekoncentrationer mellem 0,5 mg/ml og 2 mg/ml. FCM data bekræftet optagelse af 2 af HeLa celler. NIR-fluorescens (>720 nm) var afhængig af både tid (figur 3a) og koncentration en af 2 (figur 3b). Maksimal intensitet blev observeret med 780/60 bandpass filter.

AuNC'er i celler blev afbildet ikke-invasivt ved hjælp af en standard konfokal laser scanning mikroskop. Figur 4 viser det konfokale billede af HeLa-celler, der er plettet med 2 (200 μg/ml). Efter 24 timers inkubation blev der observeret lyse røde fotoluminescens af 2 inde i cellerne.

Figure 1
Figur 1: Syntese af guldnanoklyngerne. Arbejdsgang for udarbejdelse af 1 og 2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Optiske egenskaber af guld nanoclusters. Normaliseret (a) absorptionsspektre (Indsat: Fotografi af de vandige opløsninger af 1 og 2 under hvidt lys) og (b) fotoluminescerende spektre med 200 μg/ml vandige opløsninger på 1 og 2 (Indsat: fotografi af AuNC-opløsningerne under UV-lys (365 nm)). cc) Pl-ekstruderingsemission med 2 . Excitation er flyttet med 10 nm trin. Emissionen peak omkring 750 nm er meget stabil (ikke skifter med excitation) og viser en enorm Stokes skift fra excitation. Den mest effektive excitation sker omkring 340 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Påvisning af guld nanoclusters inde i HeLa celler ved flow cytometri. Internalisering af 2 i HeLa celler blev undersøgt ved hjælp af FCM. Histogrammerne viser (a)bkoncentrationsafhængig optagelse af AuNC-celler i koncentrationsafhængige celler. I det tidsafhængige forsøg blev HeLa-cellerne ubehandlet (kontrol; 0 h) eller behandlet med 1,28 mg/ml 2 og inkuberet ved 37 °C for de angivne tidspunkter. Cellerne blev derefter vasket med PBS og analyseret af FCM. I det koncentrationsafhængige forsøg blev HeLa-cellerne ubehandlet (kontrol; 0 mg/ml) eller behandlet med de angivne koncentrationer på 2 og forarbejdet på samme måde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: CLSM-billeddannelse af HeLa-celler mærket med guldnanoklyngerne. HeLa-celler blev inkuberet med 2 (200 μg/ml) i 24 timer og afbildet med CLSM. (a) Repræsenterer rød fluorescenskanal (650-760 nm); b) transmitteret lyskanal (DIC) ogc) er overlejring af (a) ogb). Skalabar, 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Stabilitetstest af 1. Fotoluminescensspektre på 1 ud af 1 M NaCl ved 0 timer og efter 72 timer. Intensiteten blev normaliseret til maksima. Klik her for at downloade dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NIR-udsender AuNC'er blev syntetiseret ved hjælp af en bottom-up-metode, hvor guldprækursoropløsningen (HAuCl4) blev behandlet med egnede thiolligands efterfulgt af en reduktion af Au3+. Reduktion af metalioner i vandig opløsning har tendens til at samle og resulterer i store nanopartikler i stedet for ultrasmå NCs21. For at forberede ultrasmå (≤2 nm) PL AuNC'er blev de syntetiske forhold justeret for at forhindre dannelse af store partikler og fremme dannelsen af ultrasmå klynger. Arten af de ligander , der anvendes til at lægge loft over AuNC-overfladen , spiller også en vigtig rolle med hensyn til at påvirke partiklernes struktur , elektroniske og optiske egenskaber12,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Derfor vælger egnede ligander i stand til at stabilisere ultrasmå klynger er nøglen til at opnå meget fluorescerende AuNC'er. Thiol-holdige ligander er de mest almindeligt anvendte stabilisatorer i syntesen af AuNC'er, på grund af den stærke kovalente binding mellem thioler og guld. En tidligere rapport31 viser, at multithiol-baserede ligander er langt bedre end monothiol ligands i stabilisering af Plc'er. Multi-thiol ligands giver forbedret kolloid stabilitet til AuNC'er på grund af det højere antal bindingssteder mellem ligand og AuNC overflade. Bidentate thiol TA blev anvendt til syntese af NIR PL AuNC'er, fordi det giver meget forbedret kolloid stabilitet til AuNC'er over en bred vifte af ugunstige forhold i forhold til monothiol ligands32. TA giver også vandig fase vækst af nanopartikler med diskret størrelse kontrol, og vigtigst af alt, det giver en carboxylsyre gruppe på overfladen af nanopartikler, der kan udnyttes til bøjning af biologisk relevante molekyler33,34.

TA stabiliserer AuNC'er ved elektrostatisk frastødning forårsaget af deprotonerede karboxylater grupper på overfladen35. I sure opløsninger bliver TA-beskyttede AuNC'er imidlertid i koled ustabile på grund af protonation af carboxylategruppen. Nanopartikler kan stabiliseres electrosterically, snarere end rent elektrostatisk. Denne tilgang giver kolloid stabilisering selv i overværelse af høje saltkoncentrationer og pH-ændringer, hvilket er vigtigt for biomedicinske anvendelser. For at give elektrosterisk stabilisering til TA-AuNC'erne blev klyngerne efterfølgende funktionaliseret med thiol-afsluttet PEG (MW 2.000) ved et 5:1 molarforhold mellem TA:PEG, hvilket gav 1 (Figur 1). For vellykket fastgørelse af thiol-opsagt PEG, TA-AuNCCs skal renses. Funktionalisering af AuNC med PEG har forbedret den vandige opløselighed ved sur pH og en stigning i kolloid stabilitet i medier med høj ionisk styrke. Det er vigtigt, at fastgørelsen af thiol-afsluttet PEG udføres ved pH 7.0-7.5. Højere pH ville resultere i blå skift af emission maksima. Ubundne ligander blev fjernet ved centrifugering/filtrering ved hjælp af en membranfiltreringsanordning med en molekylvægtsafskæring på 3 kDa. De ligander, der er forbundet med nanopartikler, oplever en betydelig linjeudvidelse i 1H NMR sammenlignet med frie ligander, hvilket kan skjule spidsbelastningsopgaver og integration36. Betydeligt bred 1H NMR peak forbundet med thioctic syre og thiol-modificeret polyethylenglycol tyder på ligander er bundet til AuNC overfladen og fjernelse af frie ligander18. En vellykket integration af selvlysende AuNC'er i et biologisk miljø kræver stabilitet over forhold, såsom høj ionisk styrke, fordi biologiske medier er rige på over ioner. Stabiliteten af 1 blev verificeret ved at overvåge fotoluminescensen i 1 M NaCl over en periode på 72 timer. Ingen signifikant ændring i fotoluminescensegenskaberne i 1 M NaCl indikerer høj stabilitet af AuNC'erne (supplerende figur 1). AuNC'erne var stabile i bufferopløsning i mere end et år uden tegn på nedbør (data ikke vist).

1 tilbyder carboxylsyre på overfladen. Carbodiimide baserede kobling reagenser er almindeligt anvendt til kovalent link carboxylsyrer til aminer via dannelse af amid binding37. Det mest anvendte carbodiimid-baserede koblingsreagens i vandig opløsning er 1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC∙H∙Cl). EDC∙HCl er blevet anvendt til kovalent kobling af TPP bromid med 1 for at opnå 2. En af de største fordele ved denne protokol er bøjning af molekyler med en primær amin gruppe via amid binding dannelse uden at kompromittere fluorescens og kolloid stabilitet. Hrtem-karakterisering (Høj opløsningstransmissionselektronmikroskopi) viste, at AuNC'erne 1 og 2 begge har en gennemsnitlig diameter på 1,15 ± 0,2 nm, hvilket indikerer, at den funktionelle kobling ikke ændrer kernestørrelsen af AuNC'erne18. Alternativt kan de gratis carboxylgrupper aktiveres ved hjælp af EDC og Sulfo-NHS38. Opløsninger af 1 og 2 ophidset med en UV-lampe (365 nm) fluorescere lyse rødt (Figur 1b, indsat), mens de vises lysegul under omgivende belysning ( Figur1a, indsat). TPP-konjugering øger AuNC PL på grund af metal-til-ligand afgiftsoverførsel (MLCT)18.

Nanopartikler kan forårsage negative biologiske virkninger, som kan begrænse deres anvendelser i biologi. For at vurdere cytotoksiciteten af 2 på HeLa-celler blev der udført XTT-cellelevedygtighedsanalyse (natrium 2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt). HeLa-celler behandlet med 2 (200 μg/ml) i 48 timer viste ingen tab af cellelevedygtighed sammenlignet med kontrolceller. Denne observation tyder auncis er biokompatible, hvilket gør dem lovende kandidater som fluorescerende sonder til anvendelse i biologisk forskning.

Når ophidset med en 405 nm laser, 2 giver en bred emission med et maksimum omkring ~ 750 nm. Den ekstremt store Stokes skift (~ 350 nm) gør det muligt for udsendte lys, der skal pålideligt skelnes fra den spændende lyskilde; FCM-filterindstillingen skal dog konfigureres korrekt. For 2 er 780/60 nm bandpass filterideelt på grund af filterets bredeste og det faktum, at emissionsmaksimum for AuNC'er er i samme region. Det er meget vigtigt at anvende brede båndpasfiltre i emissionsområdet til effektiv detektering af PL39,40,41,42. Det tids- og dosisafhængige fluorescenssignal fra celler behandlet med 2 tyder på, at FCM kan bruges til bekvemt at overvåge celleundersøgelser ved hjælp af AuNC'er. Når inkubationstiden blev øget til 24 timer, var en koncentration på 40 μg/ml på 2 tilstrækkelig til at detektere AuNC'er ved fluorescens i FCM (data ikke vist). For korte inkubationstider (1-2 timer) er der imidlertid behov for højere koncentrationer af AuNC'er. Denne metode til påvisning af AuNC'er ved NIR fluorescenssignal med et standardflowcytometer vil bidrage til yderligere at udvide de potentielle anvendelser af AuNC'er i biomedicinsk videnskab. Den tilgang, der er beskrevet her, kan anvendes til at vurdere rater og mekanismer for cellulær optagelse14,forholdet mellem nanopartikelkoncentration og cellulær toksicitet eller virkninger af overfladekemi på nanoklyngeoptagelse på en hurtig og kvantitativ måde ved hjælp af FCM.

Cellulær optagelse af 2 af HeLa celler blev afbildet af CLSM. Efter 24 h inkubation lyse rød emission af 2 blev opdaget ved excitation med 405 nm laser. Men en 405 nm laser også ophidser iboende fluorophores inde i cellerne. For at skelne aunc-signalet fra autofluorescens blev emissionen fra AuNC indsamlet over 650 nm. De attraktive egenskaber, såsom lyse nær-infrarød luminescens, høj kolloid stabilitet, god biokompatibilitet og ovenstående resultater viser, at AuNC'er er lovende billeddannelsesmidler til biomedicinske og cellulære billeddannelseapplikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nogle dele af metoderne og resultaterne blev tidligere præsenteret i artiklen af Pramanik et al.18 Her er disse metoder blevet omdannet til praktiske punkt-for-punkt-protokoller. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for Alzbeta Magdolenova for hendes hjælp med flow cytometri. Forfatterne anerkender den finansielle støtte fra GACR-projektet Nr. 18-12533S. Mikroskopi blev udført i laboratoriet for konfokal og fluorescens mikroskopi medfinansieret af Den Europæiske Fond for Regionaludvikling og den tjekkiske statsbudget, projekter nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 og CZ.2.16/3.1.00/21515, og støttet af det tjekkiske BioImaging store RI-projekt LM2015062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
  2. Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  3. Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
  4. Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
  5. Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
  6. Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
  7. Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
  8. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
  9. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
  10. Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
  11. Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
  12. Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
  13. Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
  14. Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
  15. Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
  16. Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
  17. Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
  18. Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
  19. Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
  20. Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
  21. Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
  22. Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
  23. Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
  24. Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
  25. Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
  26. Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
  27. Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
  28. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
  29. Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
  30. Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
  31. Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
  32. Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
  33. Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
  34. Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
  35. Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
  36. Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
  37. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  38. Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
  39. Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
  40. Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
  41. Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
  42. Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).

Tags

Bioengineering Gold Nanocluster Fotoluminescerende Nær-infrarød højt kvanteudbytte flowcytometri konfokal mikroskopi
Syntese af nær-infrarøde udsender guld nanoklynger til biologiske anvendelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pramanik, G., Keprova, A., Valenta,… More

Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter