Summary
שיטה אמינה ומתוכעת בקלות להכנת הפונקציונל, הקרוב-אינפרא-אדום פולט ננו אשכולות זהב והגילוי הישיר שלהם בתוך תאי הלה על ידי הזרמת cy, ומיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד מתוארת.
Abstract
במהלך העשור האחרון, ננואשכולות זהב פלורסנט (אונמcs) היו עדים הפופולריות גדל ביישומים ביולוגיים ומאמצים עצומים הוקדשה התפתחותם. בפרוטוקול זה, שיטה מפותחת, שפותחה לאחרונה להכנת מסיסים במים, מתאימות ביולית ויציבה כמעט באינפרא-אדום, הנמצאות בפירוט. זו טמפרטורה החדר, מלמטה למעלה סינתזה כימית מספק בקלות פונקציונל הכתיר עם חומצה thioctic ואת thiol שונה פוליאתילן גליקול הפתרון מימית. הגישה הסינתטית אינה מצריכה ממיסים אורגניים או ליגניות או החלפת ידע נרחבת בכימיה סינתטית להתרבות. כתוצאה ממנה מציעה החברה החופשית לפני השטח, אשר ניתן לתפקד באמצעות מולקולות ביולוגיות שונות הנושאות קבוצת אמין חופשית מבלי להשפיע לרעה על המאפיינים של האוטוליומינטונים. הליך מהיר ואמין לעיבוד הקוונאוטומטריות והדמיה של מיקרוסקופים של ספיגת AuNC על ידי תאי הלה גם כן תוארו. בשל השינוי הגדול סטוקס, הגדרה נכונה של מסננים באמצעות cy, מיקרוסקופ הזרימה הנדרשת לאיתור יעיל של photoluמיניואומיורפולוגיה ליד אינפרא אדום.
Introduction
בעשור האחרון, ultrasmall (≤ 2 nm) פוטולומינטאוסטרים זהב ננואשכולות (PL) הופיעו כבדיקות מבטיחות עבור מחקר בסיסי ויישומים מעשיים1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. המאפיינים הרצויים הרבים שלהם כוללים באיכות גבוהה של פוטויציבות, פליטת מעטה מקסימה, אורך חיים של פליטה ארוכה, שינויי סטוקס גדולים, רעילות נמוכה, biocompatibility טובה, סיווג כליות וביוקוניוגציה. הארגון יכול לספק פוטוטולוי מכחול לאזור הספקטרלי הקרוב לאינפרא-אדום (ניר), בהתאם למספר האטומים בתוך האשכול11 ולאופי המשטח של ליגאן ו-12. ניר (650-900 nm) פולט האוננים מבטיחים במיוחד לטווח ארוך בתוך מבחנה ובvivo הדמיה של תאים ורקמות, כפי שהם מציעים יחס אות לרעש גבוה עקב חפיפה מינימלית עם התאמה אוטומטית פנימית, פיזור חלש וקליטה, וחדירה רקמות גבוהות של ניר אור13,14.
בשנים האחרונות פותחו גישות שונות המנצלים את מגוון האינטראקציות הקוולניות של האו, כדי להכין את ניר-PL הכתיר במגוון רחב של ליגנדס13,15,16,17. עבור יישומים ביו-רפואיים, יש לתפקד באמצעות מרכיב ביולוגי כדי להקל על אינטראקציות מחייבות. לפיכך, האתר מהווה את היציבות הגבוהה ביותר הניתן לפונקציונליות של ממסים מימית. המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לתאר את ההכנה שדווחה בעבר ב-18 הכנות של הארגון עם מכלול של חומצה בעלת פונקציונליות של החברה הקיימת על פני השטח על-ידי שימוש בחומצה thioctic ו פוליאתילן גליקול (פג) בסביבה מימית בפירוט והקוניוגתן עם מולקולות הנושאות אמין ראשי בעקבות בגלל הקלות של סינתזה והתחנון גבוהה, פרוטוקול זה יכול לשמש ומותאם על ידי חוקרים מרקע שאינו כימיה.
אחד הדרישות המרכזיות עבור יישומים של מחקר של ה-אונcs במחקר ביו-רפואי היא היכולת להתבונן ולמדוד את ה-אונcs בתאים. בין השיטות הזמינות כדי לפקח על ספיגת ננו-חלקיק על ידי תאים, זרימה cy try (fcm) ו קונפוקלית וקד לייזר סריקת מיקרוסקופ (clsm) להציע חזק, תפוקה גבוהה שיטות המאפשרות מדידות מהירות של הפנמה של ננו פלורסנט במספר גדול של תאים19. כאן, FCM ו-CLSM שיטה למדידה ישירה וניתוח של הכלא PL בתוך תאים, ללא צורך בצבעים נוספים, הוצגו גם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מיכל הפליטה הכמעט-אינפרא-אדום (1)
- הוסף 7.8 מ"ג (37.8 μm) thioctic חומצה (TA) ו 60 μl של 2 מ naoh כדי 23.4 mL של מים אלקטרופורזה (שקעים 18.2 MΩ. cm ב -25 ° c) ומערבבים (לפחות 1,000 rpm) עד שהוא מתמוסס לחלוטין (~ 15-20 דקות). לפירוק מהיר יותר של TA, sonicate התערובת. עבור הסינתזה, מומלץ לפתרון ה-TA הטרי.
- הוסף 10.2 μL של האוקלרנית4· 3h2O (470 mg/mL) של פתרון מימית לפתרון.
- לאחר 15 דקות, להוסיף 480 μL של NaBH4 (1.9 Mg/mL) תחת זע נמרץ (לפחות 1,000 rpm) ומערבבים את תערובת התגובה תחת אותם תנאים בלילה.
הערה: הכינו את התמיסה של ה-NaBH4 במים הקרים במיוחד בקרח והוסיפו לתערובת הריאקציה מיד לאחר ההכנה.
הערה: הסינתזה של האוקליקס מדרגית בקלות. עד 2 ליטר של הקבוצה היה מסונתז באצווה אחת, ללא כל שינוי במאפיינים האופטיים של החלקיקים. - קריטי למחרת, לטהר את הפתרון על ידי החלת שלושה מחזורים של צנטריפוגה/סינון באמצעות מכשיר סינון קרום עם משקל מולקולרי חתך של 3 kDa. ללא הליך טיהור זה, השלב הבא אינו פועל כראוי.
- הוסף את thiol-הסתיים פוליאתילן גליקול (MW 2,000; 15.6 mg; 7.8 μמול) לפתרון, להתאים את ה-pH ל -7-7.5 ולערבב את התערובת לילה כדי לקבל 1. לטהר את הפיזור על ידי החלת שלושה מחזורים של צנטריפוגה/סינון באמצעות מכשיר סינון קרום עם משקל מולקולרי לגזור של 3 kDa.
הערה: התאמת ה-pH ל -7-7.5 מאוד חשובה. PH גבוה יכול לגרום לשינוי כחול של פליטה מקסימה.
2. הקוניוגציה של 3-(aminopropyl) triphenylphosphonium ברומיד (TPP) על פני השטח של 1
- לערבב את 1 פתרון (24 מ ל) הכין בשלב הקודם ו 3-(aminopropyl) triphenylphosphonium ברומיד (12 מ"ג, ~ 30 μמול). להתאים את ה-pH ל 4.5 עם HCl 1 M.
הערה: 3-(Aminopropyl) triphenylphosphonium (TPP) מלח ברומיד הוכן כמתואר בספרות20. - התחל את התגובה על ידי הוספת עודף של N-(3-diמתיל-aminopropyl)-N′-הידרוכלקרבודיאימיד (edc · HCl) (60 מ"ג, 312 μמול). ה-pH של הפתרון יגדל ואסור לו לעבור מעבר ל -6. עקוב אחר החומציות של תערובת התגובה בשעה הראשונה. אם ה-pH עולה מעל 6, להקטין את זה 4.5 – 6 על ידי הוספת הHCl 1 M.
- מערבבים את תערובת התגובה ללילה בטמפרטורת החדר.
- לטהר את הפיזור על ידי החלת שלושה מחזורים של צנטריפוגה/סינון באמצעות מכשיר סינון קרום עם משקל מולקולרי לגזור-off של 3 kDa כדי להשיג 2. לדלל 2 השיג כאן עם מים באולטרסאונד לנפח הראשוני של 24 מ ל. הריכוז של Au בפתרון הוא 200 μg/mL.
3. תרבית תאים
- תרבות הלה בתאי (התרבות HPA אוסף) ב שונה בינונית הנשר של מדיום שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי ב 5% CO2 ב 37 ° c.
- פצל ומעבר את התאים כאשר הם מגיעים ~ 80% זרימה. כדי למזער את הרכישה של מוטציות חדשות, מספר הפרוקות של התא לא צריך לחרוג מ-30.
4. הפנמה לתאי הלה
- הזרע את התאים בצלחת 12-באר בצפיפות של 20,000 תאים/mL (1 מ"ל/טוב). המטרה היא להשיג ~ 50% המפגש לאחר 48 h.
- ב 48 h לאחר זריעה, משאכל את בינוני התרבות ולהוסיף 400 μL של בינוני התרבות השלמה (עבור פקדים לא מטופלים) או 500 μg של חלקיקים ב 400 μL של מדיום מלאה תרבותי (עבור דגימות מטופלים) לכל טוב. החזר את התרבויות לאינקובטור של 37 ° c.
הערה: הוספת כרכים גבוהים של פתרון AuNC משפיעה לרעה על הכדאיות של התא. פתרונות AuNC צריכים להיות מרוכזים. כך 2 התקבלו בשלב 2.4 מרוכזים 100 פעמים. 40 mL AuNC היה מרוכז 400 μL. 25 μL של פתרון מרוכז זה התווסף ל-400 μL של תרבות תא מדיה כדי לקבל את הריכוז הרצוי AuNC. - לאחר 2 שעות של הפנמה, נתק את התאים באמצעות טריסיזציה סטנדרטית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- לאסוף את הדגימות בצינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g ב 4 ° c.
- להכין את מאגר FCM הבאים: לפני מקורר פוספט באגירה מלוחים (PBS; 137 מ"מ היאl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2hpo4, 1.47 mm נה2PO4, pH 7.4) שיושלם עם 2% בסרום שופחות ב 4 ° c.
- לשטוף את כדורי עם 1 מ ל של מאגר FCM ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g ב 4 ° c.
- להשעות מחדש את הגלולה ב 500 μL של מאגר FCM ולאחסן דגימות ב 4 ° צ' לפני ניתוח.
5. ניתוח הציטוקימטריה לזרימה
- מסננים את כל הדגימות באמצעות פוליסטירן מוקצף באורך 5 מ ל עם כובע תא מסננת.
- לפני רכישת נתונים באמצעות תוכנת המכשיר, לציין את תצורת cytometer.
- עיצוב כל מגרשים והיסטגרמות עבור ' רכישות '.
- התווה מגרש של שני פרמטרים של אזור פיזור הקדמי (FSC-A) ואזור פיזור הצד (המרכז לתקשורת המקומית-א) כדי להציג הפצת תאים. כדי לא לכלול doublets, צור מגרש שתי פרמטרים של נקודות בגובה FSC (FSC-H) לעומת FSC-A. כדי לנטר את עוצמת הזריחה היחסית בדוגמה, התווה היסטוגרמה של פרמטר יחיד עבור אזור ערוץ הפלורסנט (FL-A). השתמש בקנה מידה ליניארי כדי לתאר נתוני FSC ו-, וקנה מידה לוגריתמי עבור כל פרמטרי הפלורסנט.
- לרכוש מדגם לא מטופל (ללא ננו-חלקיקים) בקצב זרימה נמוכה כדי למזער אירועים האירוע (אם מותר על ידי המכשיר). במהלך הרכישה, כוונן את צינור המתח הפוטומטרי (PMT), כדי לקבל את האוכלוסיה האינה מטופלת בקנה מידה בחלקה של FSC לעומת העלילה. במקרה הצורך, התאימו את המתח של PMT לערוץ FL כדי למקם את האוכלוסיה הבלתי מוכתמת בפינה השמאלית של ההיסטוגרמה.
- בחר את "הכרטיסייה שער" הספציפית בתוכנה וצייר שער מתאים מסביב לאוכלוסיה הרצויה. תאים בתוך השער. עוברים לנקודת הביקורת הבאה
- שיא 10,000 אירועים לכל דוגמה.
- הקלט את כל הדגימות תחת אותן הגדרות מכשירים.
- השתמש בתוכנית המתאימה כדי לנתח את הזרם cy, לנסות את הנתונים.
הערה: יישומים מסוימים עשויים לדרוש התקנה מותאמת אישית של מסננים. עבור חילופי מסננים, פעל תמיד על-ידי המלצות הייצור במדריך למשתמש.
הערה: ניתן לשמור את הניסוי ולטעון מחדש כדי לשמר את הגדרות המכשיר ולעבור על האסטרטגיה.
הערה: ניתן להשתמש בחלקה של גובה פיזור צדדי (מקום הרחקה-H) לעומת אזור פיזור (מקום לפני השטח של האס. סוג זה של מעבר יכול להיות רגיש יותר כמו גלאי FSC הוא בדרך כלל לא PMT.
6. הפנמה 2 לתאי הלה למיקרוסקופיה בלייזר (CLSM)
- הזרע את התאים על 4-חדר בתחתית זכוכית 35 מילימטר צלחת בצפיפות של 250,000 תאים/mL (0.5 mL/קאמרית). לשמור על החדר בחממה 37 ° c עם 5% CO2 אווירה. המטרה היא להשיג ~ 50% זרימה לאחר 24 שעות.
- ב 24 h לאחר זריעה, להוסיף 100 μg של 2 (או 10 μl מפתרון המניה של 10 מ"ג/mL) לכל תא מאכל המכיל 0.5 mL של בינוני עם התאים (עבור דגימות מטופלים).
- . החזר את המנה לאינקובטור תנו לתאים להפנים את הדודות למשך 24 שעות לפני השימוש בהם עבור CLSM.
- לאחר תקופת הפנמה, למחוק את המדיום ולשטוף את התאים עם בינונית מחומם מראש טרי עבור 5 דקות. חזור על צעד הכביסה פעם נוספת. ואז למלא כל חדר עם 800 μL של מדיום טרי.
7. CLSM הדמיה של תאי הלה חיים המסומנים עם 2
- עבור הדמיה מיקרוסקופית, השתמש בשמן 63 x (n = 1.518) המטרה עדשה (NA = 1.4) במיקרוסקופ קונפוקלית וקד עם תוכנית-apochromat.
- הר את הצלחת על הבמה ההפוכה מיקרוסקופ עם החדר מחומם 37 ° c וסיפק עם מחולל מלחות 5% CO2 האווירה.
- כדי לאתר את הפניפנזה, השתמש ב-405 לייזר ננומטר להגדיר ב 2% כוח עם מפצל קרן מתאים. להגדיר את טווח אורכי גל של זיהוי בין 650 ו 760 nm.
- הגדר את רזולוציית התמונה ל-2048 x 2048 פיקסלים. בהגדרת מהירות הרכישה, המטרה לשכון פיקסל זמן סביב 4 μs. לרכוש את התמונה עם ממוצע של 2x (מצב קו, חישוב ממוצע של שיטה). הגדר את החור מנקב 1 יחידה אוורירית (עבור אור 405 ננומטר). לרגישות גבוהה יותר, השתמש במצב ספירת פוטון.
- לתאורה נכונה באור משודר עם ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC), השתמש בהגדרת המנה של העבה ובעצירת השדה. לרכישת האור המשודר, השתמש בלייזר 488 ננומטר בעוצמה של 0.7% ללא כל גלאי הקרינה הפלואורסצנטית שהוקצה. הגדר מפצל קרן מתאים לאורך הגל הלייזר.
- השג שתי תמונות עבור כל רצועה (פלואורסצנטית אדום ו-DIC). עקוב אחר האתר על ידי הזריחה האדומה שלהם; גבולות התא נקבעים בקלות באור המשודר עם תמונות DIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניר PL הוכנו מ-Au3 + בנוכחות TA, ולאחר מכן thiol-הסתיים פג (MW 2,000) היה מאוגד על משטח aunc כדי לקבל 1 בעקבות זרימת העבודה המוצגת באיור 1. צימוד אמאידיג בין 1 ל -3-(aminopropyl) triphenylphosphonium (tpp) ברומיד בתנאי 2. כצפוי, ספקטרום הקליטה (איור 2a) הראהכי ב-דודות 1 ו- 2 אין מאפיינים מסוימים של משטח הפלסטיק ומציגים פליטה רחבה מ 550 nm ל 850 ננומטר (איור 2a). לאחר ההחזקה של TPP על פני השטח של 1, PL גדל בחוזקה. פליטה מ-אונcs הייתה גלויה גם תחת אור UV (365 ננומטר, איור 2b הזחה). הפליטה מ-אונcs יציבה ופליטת אורך הגל אינה תלויה באורך גל עירור (איור 2 ג). עם זאת, עוצמת הפליטה היא מקסימלית בעת התרגשות עם אור UV.
2 זוהה בתוך התאים הלה על ידי ניטור PL על הזרימה cytometer. תאי הלה היו מודבטים עבור 2 שעות עם 2 ב ריכוזי מדיה בין 0.5 Mg/ml ו 2 מ"ג/ml. נתונים FCM מאושר ספיגה של 2 על ידי תאים הלה. הקרינה הפלואורסצנטית ניר (> 720 ננומטר) היה תלוי בשני הזמנים (איור 3a) וריכוז של 2 (איור 3a). העוצמה המקסימלית נצפתה עם מסנן 780/60 bandpass.
הארגון בתוך תאים השתמש במיקרוסקופ סריקה בלייזר סטנדרטי. איור 4 מראה את התמונה הקונקלית של תאי הלה מוכתם 2 (200 μg/mL). לאחר 24 שעות של דגירה בהיר אדום פוטולומיניסנציה של 2 בתוך התאים נצפתה.
איור 1: סינתזה של ננו אשכולות זהב. זרימת עבודה של הכנת 1 ו- 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תכונות אופטיות של ננו אשכולות זהב. ספקטרום מנורמל (a) קליטת (שיבוץ: צילום של פתרונות מימית של 1 ו 2 תחת אור לבן) ו (ב) פוטולומיניסצנטי ספקטרום של 200 μg/mL פתרונות מימית של 1 ו 2 (שיבוץ: צילום של פתרונות aunc תחת אור UV (365 nm)). (ג) עירור-פליטת PL מפה של 2. הריגוש מוזז על ידי 10 שלבים ננומטר. השיא פליטה סביב 750 ננומטר הוא יציב מאוד (לא משמרת עם עירור) ומראה משמרת סטוקס עצום מתוך עירור. העירור היעיל ביותר מתרחשת סביב 340 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי ננו אשכולות זהב בתוך התאים של הלה על ידי שהזרים cy, לנסות. הפנמה של 2 לתאי הלה נחקרה באמצעות fcm. מופע היסטגרמות (a)-זמן-ו-(ב) ספיגת הריכוז של ה-"אוקרי הבית" של תאי הלה. בניסוי תלוי הזמן, תאי הלה לא טופלו (שליטה; 0 h) או מטופלים עם 1.28 mg/mL 2 ו-מודב ב 37 ° c עבור הזמנים המצוינים. התאים נשטפו לאחר מכן עם PBS ונותחו על ידי FCM. בניסוי תלוי ריכוז, תאי הלה לא טופלו (שליטה; 0 מ"ג/mL) או מטופלים עם הריכוזים המצוין של 2 ו מעובד באותו אופן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה CLSM של תאי הלה מתויג עם ננו אשכולות זהב. תאי הלה היו מודבטים עם 2 (200 μg/mL) עבור 24 שעות והתמונה עם clsm. (א) מייצג ערוץ הזריחה האדומה (650-760 ננומטר); (ב) ערוץ אור ששודר (DIC) ו-(ג) הוא כיסוי של (א) ו-(ב). סרגל קנה מידה, 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: בדיקת יציבות של 1. ספקטרום photoluminescence 1 ב 1 מ ' הנאגל ב 0 h ואחרי 72 h. האינטנסיביות הייתה מנורמלת למקסימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניר-פולט מסונתז באמצעות גישה מלמטה-למעלה שבה מטופלת התמיסה המקודבת הזהב (HAuCl4) עם ליגניות מתאימות, ולאחריה הפחתה של Au3 +. הפחתה של יוני מתכת בתמיסה מימית נוטים לצבור ותוצאות חלקיקים גדולים במקום באולטרסאונד NCs21. כדי להכין בדיקת אולטרה-סאונד (≤ 2 ננומטר) PL, התנאים הסינתטיים הותאמו כדי למנוע היווצרות של חלקיקים גדולים ולקדם היווצרות של אשכולות באולטרהקטנים. אופי הליטרים ששימשו לכיסוי משטח ה-aunc גם ממלא תפקיד חשוב בהשפעה על המבנה, התכונות האלקטרוניות והאופטיות של החלקיקים12,22,23,24,25,26,27,28,29,30. לפיכך, בחירת ליגניות מתאימות המסוגלת לייצב אשכולות קטנים במיוחד היא המפתח להשגת האואוסצנט מאוד. Thiol-המכיל ליגניות הם המייצבים הנפוצים ביותר בסינתזה של האוקולנדס, בשל הקשר הבין-קוולנטי החזק בין הטולים לזהב. הדו ח הקודם31 מעיד על כך שליגניות מבוססות על מולטיתירול מעולים על מונתיול ליגניות בייצוב של מחלקה PL. מולטי-thiol מספק יציבות משופרת של מדעי האזור בגלל המספר הגבוה יותר של אתרי קשירה בין המשטח לבין ligands AuNC. בידנאט תיול TA שימש לסינתזה של ניר PL האוקולנדס משום שהוא מספק יציבות משופרת הרבה יותר לבית השימוש ב-"אונקס" על פני מגוון רחב של תנאים שאינם לעומת מונתיול ליגנדס32. ת. א. גם מספקת צמיחה מימית שלב של חלקיקים עם שליטה בגודל דיסקרטית, והכי חשוב, הוא מציע קבוצה של חומצה קרבוקסילית על פני השטח של חלקיקים שיכולים להיות מנוצל עבור בניינים של מולקולות רלוונטיות ביולוגית33,34.
מייצב ה-TA של הקבוצה באמצעות דחייה אלקטרוסטטית הנגרמת על ידי קבוצות carboxylate מתחת לפני השטח35. עם זאת, בפתרונות חומציים, ה-TA המוגן של הארגון, הופכים לבלתי יציבים כתוצאה מפרוטונציה של קבוצת הcarboxylate אוחרת. חלקיקי חלקיקים ניתן לייצב בצורה אלקטרוסטטית, במקום אלקטרוסטטי לחלוטין. גישה זו מספקת ייצוב מצבי, גם בנוכחות ריכוזי מלח גבוהים ושינויי pH, החשובים עבור יישומים ביו-רפואיים. כדי להיוועץ בייצוב אלקטרוסטרי לת א-אונקס, האשכולות הינם פונקציונל לאחר מכן ביחס ל-"פג" המסתיימת ב-thiol (MW 2,000) ב-5:1, מניב 1 (איור 1). כדי לקבל החזקה מוצלחת של פג הסתיימה, TA-אונcs חייב להיות מטוהר. הפונקציונליזציה של AuNC עם פג שיפרה את מסיסות מימית ב-pH חומצי ועלייה ביציבות קולאידית במדיה של חוזק יוניים גבוהה. חשוב כי הקובץ המצורף של thiol-הסתיים פג מבוצעת ב-pH 7.0-7.5. PH גבוה יגרום לשינוי כחול של הפליטה מקסימה. ליגרים לא מאוגדים הוסרו על ידי צנטריפוגה/סינון באמצעות מכשיר סינון קרום עם משקל מולקולרי חתך של 3 kDa. הליטים כי הם קשורים לחוויה חלקיקים משמעותיים קו הרחבת ב 1H nmr לעומת ליגנדס חינם, אשר יכול להסתיר משימות שיא ואינטגרציה36. רחבה באופן משמעותי 1H nmr שיא הקשורים בחומצה thioctic ו-thiol שונה פוליאתילן גליקול מציע ליגניות מאוגדים משטח aunc והסרה של ליגנדס חינם18. שילוב מוצלח של כלאונקס זורח בסביבה ביולוגית דורש יציבות על פני התנאים, כגון חוזק יוניים גבוה, משום שהמדיה הביולוגית עשירה בעודף יונים. היציבות של 1 אומתה על ידי ניטור פוטולומיניסנציה שנת 1 M הנאל בתקופה של 72 h. אין שינוי משמעותי בתכונות הפוטוטולוי ב-1 M הנאל מעיד על יציבות גבוהה של ה-"הסמולוז" (איור משלים 1). המקום היה יציב בפתרון באגירה למעלה משנה ללא כל ראיה למשקעים (הנתונים אינם מוצגים).
1 מציעה חומצה קרבוקסילית על פני השטח. קרבודיומיד מבוסס על מצמד ריאגנטים משמשים רבות כדי לקשר באופן מידי חומצות קרבוקסילית כדי אמינים באמצעות היווצרות של amide בונד37. בשימוש הנפוץ ביותר קרבודימיד מבוסס צימוד מגיב בתמיסה מימית הוא 1-אתיל-3-(dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד הידרוכלוריד (EDC ∙ HCl). EDC ∙ HCl שימש צימוד קוולנטי של TPP ברומיד עם 1 כדי להשיג 2. אחד היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הוא בניינים של מולקולות עם קבוצת אמין העיקרי באמצעות היווצרות קשר אמיד מבלי להתפשר על היציבות של הקרינה הפלואורסצנטית. מיקרוסקופ אלקטרוני ברזולוציה גבוהה (HRTEM) האפיון הראה כי הדודות 1 ו- 2 יש קוטר ממוצע של 1.15 ± 0.2 nm, אשר מציין את הצימוד הפונקציונלי לא לשנות את גודל הליבה של האונcs18. לחילופין, ניתן להפעיל את קבוצות קרבוקסילי ללא תשלום באמצעות edc ו-sulfo-38. פתרונות של 1 ו -2 נרגש עם מנורה UV (365 nm) זרוח וארת אדום (איור 1b, שיבוץ), בעוד הם מופיעים צהוב בהיר תחת תאורת הסביבה (איור 1b, שיבוץ). הקוניוגציה TPP מגדילה את AuNC PL בגלל מתכת-to-ליגציה ואת דמי העברה (MLCT)18.
חלקיקים יכולים לגרום לתופעות ביולוגיות שליליות אשר יכול להגביל את היישומים שלהם בביולוגיה. כדי להעריך את הרעילות של 2 על תאי הלה, xtt (נתרן 2, 3-bis (2-מתיונין-4-ניטרו-5-sulfophenyl)-5-[(פנילאמינו)-2h-טטרזויום המלח הפנימי) שיטת הכדאיות של התא בוצעה. תאי הלה שטופלו 2 (200 μg/mL) עבור 48 h לא הראה אובדן הכדאיות של התא בהשוואה לתאי הבקרה. ההתבוננות הזאת מצביעה על כך שהדודות מותאמת לשימוש ביולוגי, מה שהופך אותם למבטיחים מועמדים כבדיקות פלורסנט ליישום במחקר ביולוגי.
כאשר מתרגש עם לייזר nm 405, 2 מספק פליטה רחבה עם מקסימום סביב ~ 750 nm. משמרת סטוקס גדול מאוד (~ 350 ננומטר) מאפשר לאור הנפלט להיות מכובד באופן אמין מן המקור אור מרגש; עם זאת, הגדרת המסנן FCM צריכה להיות מוגדרת כראוי. עבור 2, מסנן ה-bandpass 780/60 ננומטר הינו אידיאלי בשל הרחבה של המסנן והעובדה שהפליטה המרבית של היחידה של היחידה היא באותו אזור. חשוב מאוד להשתמש מסננים רחב bandpass באזור של פליטה מקסימה לאיתור יעיל של PL39,40,41,42. הזמן והמינון תלויי הזריחה מתאים שטופלו ב- 2 עולה כי fcm ניתן להשתמש כדי לפקח בנוחות לימודי תאים באמצעות ה-אונcs. כאשר זמן הדגירה הוגדלה כדי 24 שעות, a 40 μg/mL ריכוז של 2 היה מספיק כדי לזהות את ה-אונcs על ידי הזריחה ב fcm (נתונים לא מוצגים). עם זאת, עבור זמני דגירה קצרים (1-2 h), ריכוזים גבוהים יותר של הדודות יש צורך. שיטה זו מזהה את האות הפלואורסצנטית על ידי ניר משדר עם הזרימה הסטנדרטית של הסייטומטר תסייע להרחיב את היישומים הפוטנציאליים של הסוכנות הרפואית במדעי הביו. הגישה המתוארת כאן יכול לשמש כדי להעריך שיעורי ומנגנונים של קליטה תאית14, יחסים בין ננו-חלקיק ריכוז והרעלה הסלולר, או השפעות של כימיה פני השטח על ספיגת nanocluster בצורה מהירה וכמותית באמצעות fcm.
ספיגת הסלולר של 2 על ידי תאי הלה היתה התמונה על ידי clsm. לאחר 24 שעות של דגירה הפליטה אדום בהיר של 2 זוהה על עירור עם 405 ננומטר לייזר. עם זאת, a 405 לייזר ננומטר גם מלהיב את fluorophores הפנימי בתוך התאים. כדי להבדיל את האות של AuNC מ-פלואורסצנטית אוטומטי, הפליטה מ-AuNC נאסף מעל 650 ננומטר. התכונות האטרקטיביות, כגון תאורת בהירות באור אינפרא-אדום, יציבות גבוהה, ביותאימות טובה ותוצאות מעלה מדגימות כי ה-אונcs מבטיחים סוכני דימות ליישומי דימות ביו-רפואיים וסלולריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
חלקים מסוימים של השיטות והתוצאות הוצגו בעבר במאמר על ידי Pramanik ואח '18 כאן, שיטות אלה הומרו לפרוטוקולים מעשיים של נקודה אחר נקודה. המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה על Alzbeta Magdolenova עבור עזרתה עם cy, הזרמת לזרום. המחברים מכירים בתמיכה הפיננסית מפרויקט GACR Nr. 18-12533S. המיקרוסקופיה בוצעה במעבדה של המיקרוסקופיה ומיקרוסקופית הפלואורסצנטית במימון הקרן האירופית לפיתוח האזור ותקציב המדינה של צ'כיה, פרויקטים לא. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 ו-CZ. 2.16/3.1.00/21515, ונתמך על-ידי הפרוייקט הצ-ביודמיה הגדולות של project LM2015062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
References
- Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
- Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
- Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
- Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
- Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
- Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
- Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
- Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
- Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
- Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
- Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
- Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
- Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
- Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
- Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
- Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
- Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
- Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
- Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
- Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
- Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
- Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
- Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
- Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
- Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
- Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
- Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
- Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
- Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
- Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
- Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
- Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
- Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
- Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
- Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
- Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
- Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
- Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).
