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Bioengineering

Síntesis de nanoclusters de oro de emisión de infrarrojo cercano para aplicaciones biológicas

Published: March 22, 2020 doi: 10.3791/60388
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4, 3, 1
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics, Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University, 4First Faculty of Medicine, Charles University

Summary

Se describe un método fiable y fácilmente reproducible para la preparación de nanocúmulos de oro fotoluminiscente de emisión de infrarrojo cercano funcional y y su detección directa dentro de las células de HeLa mediante citometría de flujo y microscopía de escaneo láser confocal.

Abstract

Durante la última década, los nanoclusters de oro fluorescente (AuNCs) han sido testigos de una creciente popularidad en aplicaciones biológicas y se han dedicado enormes esfuerzos a su desarrollo. En este protocolo, se ha descrito en detalle un método fácil recientemente desarrollado para la preparación de AuNCs de emisión de infrarrojo cercano solubles en agua, biocompatibles y coloidialmente estables. Esta síntesis química de temperatura ambiente y de abajo hacia arriba proporciona ACN fácilmente funcionalizables tapados con ácido tiotable y polietilenglicol modificado con tio en solución acuosa. El enfoque sintético no requiere disolventes orgánicos ni intercambio de ligandos adicionales ni un amplio conocimiento de la química sintética para reproducirse. Los AuNC resultantes ofrecen ácidos carboxílicos de superficie libre, que se pueden funcionalizar con varias moléculas biológicas que llevan un grupo libre de aminas sin afectar negativamente a las propiedades fotoluminiscentes de los ACN. También se describió un procedimiento rápido y fiable para la cuantificación citométrica de flujo y la toma microscópica confocal de la toma de AuNC por las células de HeLa. Debido al gran cambio de Stokes, es necesario ajustar adecuadamente los filtros en la citometría de flujo y la microscopía confocal para la detección eficiente de fotoluminiscencia de infrarrojo cercano de los ACN.

Introduction

En la última década, nanoclusters de oro fotoluminiscente ultrapequeños (2 nm) han surgido como sondas prometedoras tanto para la investigación fundamental como para aplicaciones prácticas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Sus muchas características deseables incluyen alta fotoestabilidad, máxima de emisión ajustable, largos ciclo de emisión, grandes cambios Stokes, baja toxicidad, buena biocompatibilidad, aclaramiento renal y bioconjugación fácil. Los AuNC PL pueden proporcionar fotoluminiscencia desde el azul hasta la región espectral de infrarrojo cercano (NIR), dependiendo del número de átomos dentro del cluster11 y la naturaleza del ligando superficial12. Los ANAC emisores de NIR (650-900 nm) son particularmente prometedores para las imágenes in vitro e in vivo a largo plazo de células y tejidos, ya que ofrecen una alta relación señal-ruido debido a una mínima superposición con autofluorescencia intrínseca, dispersión y absorción más débiles y alta penetración de tejido de la luz NIR13,14.

En los últimos años, se han desarrollado diversos enfoques que aprovechan las interacciones covalentes de Au-S para preparar Los ACN NIR-PL tapados con una variedad de ligandos que contienen tiol13,,15,,16,,17. Para aplicaciones biomédicas, los ACN deben ser funcionalizados con un componente biológico para facilitar las interacciones vinculantes. Por lo tanto, los AuNCs con alta estabilidad coloidal que son fácilmente funcionalizables en disolvente acuoso son altamente deseables. El objetivo general del protocolo actual es describir una preparación previamente notificada deLos AuNC con un grupo de ácido carboxílico funcionalizable en la superficie mediante el uso de ácido tiojal y polietilenglicol (PEG) en un entorno acuoso en detalle y su conjugación con moléculas que llevan una amina primaria siguiendo el método de acoplamiento ácido-amina. Debido a la facilidad de síntesis y alta reproducibilidad, este protocolo puede ser utilizado y adaptado por investigadores de orígenes no químicos.

Uno de los requisitos clave para las aplicaciones de los ACN en la investigación biomédica es la capacidad de observar y medir los ACN dentro de las células. Entre los métodos disponibles para monitorear la absorción de nanopartículas por células, la citometría de flujo (FCM) y la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) ofrecen métodos robustos y de alto rendimiento que permiten mediciones rápidas de la internalización de nanomateriales fluorescentes en un gran número de células19. Aquí, el método FCM y CLSM para la medición directa y el análisis de los AuNC PL dentro de las células, sin la necesidad de disteantes adicionales, también se han presentado.

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Protocol

1. Preparación de ACN emisores de infrarrojo cercano (1)

  1. Añadir 7,8 mg (37,8 m) de ácido tiojal (TA) y 60 ml de NaOH de 2 M a 23,4 ml de agua ultrapura (resistividad de 18,2 M a 25 oC) y agitar (al menos 1.000 rpm) hasta que se disuelva por completo (15-20 min). Para una disolución más rápida de TA, sonicar la mezcla. Para la síntesis, se recomienda la solución TA recién preparada.
  2. Añadir 10,2 ml de HAuCl4x 3H2O (470 mg/ml) de solución acuosa a la solución.
  3. Después de 15 min, añadir 480 ml de NaBH4 (1,9 mg/ml) bajo agitación vigorosa (al menos 1.000 rpm) y remover la mezcla de reacción en las mismas condiciones durante la noche.
    NOTA: Recién preparar la solución NaBH4 en agua ultrapura helada y añadir a la mezcla de reacción inmediatamente después de la preparación.
    NOTA: La síntesis de AuNCs es fácilmente escalable. Hasta 2 L de AuNCs se sintetizaron en un solo lote, sin ningún cambio en las propiedades ópticas de las partículas.
  4. (Crítico) Al día siguiente, purificar la solución aplicando tres ciclos de centrifugación/filtración utilizando un dispositivo de filtración por membrana con un corte de peso molecular de 3 kDa. Sin este procedimiento de purificación, el siguiente paso no funciona correctamente.
  5. Añadir el polietilenglicol terminado tiol (MW 2.000; 15,6 mg; 7,8 mm) a la solución, ajustar el pH a 7-7,5 y agitar la mezcla durante la noche para obtener 1. Purificar la dispersión aplicando tres ciclos de centrifugación/filtración utilizando un dispositivo de filtración por membrana con un corte de peso molecular de 3 kDa.
    NOTA: El ajuste del pH a 7-7.5 es extremadamente importante. Un pH más alto puede dar lugar a un cambio azul de la emisión máxima.

2. Conjugación de 3-(aminopropyl)bromuro de trifenilffosfano (TPP) en la superficie de 1

  1. Mezclar la 1 solución (24 ml) preparada en el paso anterior y el bromuro de trifenilfosfano 3(aminopropyl)(12 mg, 30 omol). Ajuste el pH a 4,5 con 1 M HCl.
    NOTA: 3-(Aminopropyl)triphenylphosphonium (TPP) bromuro se preparó como se describe en la literatura20.
  2. Iniciar la reacción añadiendo un exceso de N-(3-dimetil-aminopropyl)-N-etilcarbodiimide clorhidrato (EDC - HCl) (60 mg, 312 omol). El pH de la solución aumentará y no se debe permitir que vaya más allá de 6. Controlar el pH de la mezcla de reacción durante la primera hora. Si el pH aumenta por encima de 6, reducirlo a 4.5–6 mediante la adición de 1 M HCl.
  3. Revuelva la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente.
  4. Purificar la dispersión aplicando tres ciclos de centrifugación/filtración utilizando un dispositivo de filtración por membrana con un corte de peso molecular de 3 kDa para obtener 2. Diluir 2 obtenido aquí con agua ultrapura al volumen inicial de 24 ml. La concentración de Au en la solución es de 200 g/ml.

3. Cultivo celular

  1. Células HeLa de cultivo (colección de cultivos HPA) en el medio de águila modificado de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal en 5% CO2 a 37 oC.
  2. Divida y desvíe las celdas cuando alcancen el 80 % de confluencia. Para minimizar la adquisición de nuevos mutantes, el número de propagaciones celulares no debe exceder de 30.

4. Internalización de AuNC en las células de HeLa

  1. Sembrar las células en una placa de 12 pocillos a una densidad de 20.000 celdas/ml (1 ml/pozo). El objetivo es lograr una confluencia del 50 % después de 48 h.
  2. A 48 h de post-sembrado, aspirar el medio de cultivo y añadir 400 l de medio de cultivo completo (para controles no tratados) o 500 g de nanopartículas en 400 oL de medio cultivado completo (para muestras tratadas) a cada pocto. Devolver las culturas a una incubadora de 37oC.
    NOTA: La adición de grandes volúmenes de solución AuNC afecta negativamente a la viabilidad celular. Las soluciones De AuNC deben concentrarse. Así, 2 obtenidos en el paso 2.4 se concentra n.o 100 veces. 40 ml de AuNC se concentró a 400 oL. Se añadió una alícuota de 25 l de esta solución concentrada a los medios de cultivo celular de 400 ml para obtener la concentración de AuNC deseada.
  3. Después de 2 h de internalización, separar las células por trippsinización estándar de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  4. Recoger las muestras en tubos de microcentrífuga de polipropileno y centrífuga durante 5 min a 350 x g a 4 oC.
  5. Preparar el siguiente búfer FCM: solución salina tamponada de fosfato preenfriado (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM NaH2PO4,pH 7.4) complementada con 2% de albúmina sérica bovina a 4 oC.
  6. Lavar los pellets con 1 ml de tampón FCM y centrífuga durante 5 min a 350 x g a 4 oC.
  7. Resuspenda el pellet en 500 ml de búfer FCM y almacene las muestras a 4 oC antes del análisis.

5. Análisis de citometría de flujo

  1. Filtrar todas las muestras utilizando un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con una tapa de colador de celda.
  2. Antes de adquirir datos utilizando el software del instrumento, especifique la configuración del catómetro.
  3. Formatee todas las gráficas de puntos e histogramas para "Adquisiciones".
  4. Trazar una gráfica de puntos de dos parámetros del área de dispersión hacia delante (FSC-A) y el área de dispersión lateral (SSC-A) para mostrar la distribución de las celdas. Para excluir dobletes, cree una gráfica de puntos de dos parámetros de altura FSC (FSC-H) frente a FSC-A. Para supervisar la intensidad relativa de la fluorescencia en la muestra, trace un histograma de un solo parámetro para el área del canal fluorescente (FL-A). Utilice una escala lineal para representar los datos FSC y SSC, y una escala logarítmica para todos los parámetros fluorescentes.
  5. Adquirir muestra no tratada (sin nanopartículas) a un caudal bajo para minimizar los eventos coincidentes (si el instrumento lo permite). Durante la adquisición, ajuste los voltajes del tubo fotomultiplicador (PMT) para obtener la población no tratada a escala en la gráfica FSC vs SSC. Si es necesario, ajuste los voltajes PMT para que el canal FL coloque la población no manchada en la esquina izquierda del histograma.
  6. Seleccione la "pestaña de puerta" específica en el software y dibuje una puerta apropiada alrededor de la población deseada. Las celdas dentro de la puerta se moverán al siguiente punto de control.
  7. Registre 10.000 eventos por muestra.
  8. Grabe todas las muestras en la misma configuración del instrumento.
  9. Utilice un programa adecuado para analizar los datos de citometría de flujo.
    NOTA: Algunas aplicaciones pueden requerir una configuración personalizada de los filtros. Para el intercambio de filtros, siga siempre las recomendaciones del fabricante en la guía del usuario.
    NOTA: El experimento se puede guardar y volver a cargar para conservar la configuración del instrumento y la estrategia de gating.
    NOTA: Una gráfica de altura de dispersión lateral (SSC-H) frente a área de dispersión lateral (SSC-A) también se puede utilizar para la exclusión de doblete. Este tipo de gating puede ser más sensible, ya que el detector FSC no suele ser una PMT.

6. Internalización de 2 en las células HeLa para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM)

  1. Sembrar las células en un plato inferior de 4 cámaras de 35 mm a una densidad de 250.000 células/ml (0,5 ml/cámara). Mantener la cámara en una incubadora de 37oC con un 5% de atmósfera deCO2. El objetivo es lograr una confluencia del 50 % después de las 24 h.
  2. A 24 h de postsiembra, añadir 100 g de 2 (o 10 l de la solución en stock de 10 mg/ml) a cada cámara de plato que contenga 0,5 ml de medio con las células (para muestras tratadas).
  3. Devuelva el plato a la incubadora. Deje que las celdas internalicen los AuNC durante 24 horas antes de usarlas para CLSM.
  4. Después del período de internalización, deseche el medio y lave las celdas con un medio fresco precalentado durante 5 min. Repita el paso de lavado una vez más. A continuación, llene cada cámara con 800 ml de medio fresco.

7. CLSM Imaging de células Hela vivas etiquetadas con 2

  1. Para las imágenes microscópicas, utilice la lente objetivo de aceite 63x (n a 1.518) (NA a 1,4) en un microscopio confocal con Plan-Apochromat.
  2. Montar el plato en la etapa invertida del microscopio con la cámara calentada a 37 oC y suministrada con una atmósfera humidificada de 5%CO2.
  3. Para detectar AuNC internalizado, utilice un láser de 405 nm a una potencia del 2% con un divisor de haz adecuado. Establezca el rango de longitudes de onda de detección entre 650 y 760 nm.
  4. Establezca la resolución de la imagen en 2048 x 2048 píxeles. En el ajuste de velocidad de adquisición, apunte a un tiempo de permanencia de píxeles alrededor de 4 s. Adquiera la imagen con un promedio de 2 veces (modo de línea, media del método de promediación). Ajuste el agujero en 1 unidad airy (para luz de 405 nm). Para una mayor sensibilidad, utilice el modo de recuento de fotones.
  5. Para una correcta iluminación en la luz transmitida con contraste de interferencia diferencial (DIC), utilice el ajuste del condensador y el tope de campo de la marca de campo. Para la adquisición de luz transmitida, utilice un láser de 488 nm a una potencia del 0,7% sin ningún detector de fluorescencia asignado. Establezca un divisor de haz adecuado para la longitud de onda láser.
  6. Adquirir dos imágenes para cada pista (fluorescencia roja y DIC). Rastrear AuNCs por su fluorescencia roja; los límites de las células se determinan fácilmente en la luz transmitida con imágenes DIC.

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Representative Results

Los AuNC NIR PL se prepararon a partir de Au3+ en presencia de TA, y luego PEG terminado tiol (MW 2.000) se asolidó en la superficie AuNC para obtener 1 siguiendo el flujo de trabajo que se muestra en la Figura 1. Acoplamiento amida entre 1 y 3-(aminopropyl) bromuro de trifenilffosfano (TPP) proporcionado 2. Como era de esperar, los espectros de absorción(Figura 2a) indicaron que los ACN 1 y 2 no tienen una banda de plasmón superficial característica y muestran una amplia emisión de 550 nm a 850 nm(Figura 2b). Después de la fijación de TPP a la superficie de 1, el PL aumentó fuertemente. La emisión de AuNCs también era visible bajo la luz UV (365 nm, Figura 2b recuadro). La emisión de AuNCs es estable y la longitud de onda de emisión es independiente de la longitud de onda de excitación(Figura 2c). Sin embargo, la intensidad de emisión es máxima cuando se excita con la luz UV.

2 se detectó dentro de las células de HeLa mediante el monitoreo del PL en un catómetro de flujo. Las células de HeLa se incubaron durante 2 horas con 2 a concentraciones de medios entre 0,5 mg/ml y 2 mg/ml. Los datos fcM confirmaron la toma de 2 por las células de HeLa. La fluorescencia NIR (>720 nm) dependía tanto del tiempo(Figura 3a)como de la concentración de 2 (Figura 3b). Se observó una intensidad máxima con el filtro de paso de banda 780/60.

Los AuNAC dentro de las células se crearon imágenes no invasivas mediante el uso de un microscopio de exploración láser confocal estándar. La Figura 4 muestra la imagen confocal de las células de HeLa teñidas con 2 (200 g/ml). Después de 24 h de incubación se observó fotoluminiscencia roja brillante de 2 dentro de las células.

Figure 1
Figura 1: Síntesis de los nanoclusters de oro. Flujo de trabajo de la preparación de 1 y 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Propiedades ópticas de los nanoclusters de oro. Espectros de absorción normalizados(a) (Inset: Fotografía de las soluciones acuosas de 1 y 2 bajo luz blanca) y (b) espectros fotoluminiscentes de 200 g/ml de soluciones acuosas de 1 y 2 (Inset: fotografía de las soluciones AuNC bajo luz UV (365 nm)). (c) Mapa PL de emisión de excitación de 2. La excitación se desplaza por pasos de 10 nm. El pico de emisión alrededor de 750 nm es muy estable (no cambia con excitación) y muestra un enorme cambio Stokes de la excitación. La excitación más eficiente ocurre alrededor de 340 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Detección de nanoclusters de oro dentro de las células de HeLa por citometría de flujo. La internalización de 2 en las células de HeLa se estudió utilizando FCM. Los histogramas muestran(ab) la adopción dependiente de la concentración de las aunics dependientes de la concentración por las células de HeLa. En el experimento dependiente del tiempo, las células de HeLa no fueron tratadas (control; 0 h) o tratadas con 1,28 mg/ml 2 e incubadas a 37oC durante los tiempos indicados. Las células fueron lavadas con PBS y analizadas por FCM. En el experimento dependiente de la concentración, las células de HeLa no fueron tratadas (control; 0 mg/ml) o tratadas con las concentraciones indicadas de 2 y procesadas de la misma manera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes CLSM de células HeLa etiquetadas con los nanoclusters de oro. Las células de HeLa se incubaron con 2 (200 g/ml) durante 24 h y se crearon imágenes con CLSM. (a ) Representa el canal de fluorescencia roja (650-760 nm); (b) el canal de luz transmitido (DIC) y (c) es superpuesto de(a ) y (b). Barra de escala, 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Prueba de estabilidad de 1. Espectros de fotoluminiscencia de 1 de cada 1 M de NaCl a 0 h y después de 72 h. La intensidad se normalizó al máximo. Haga clic aquí para descargar esta figura.

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Discussion

Los AuNc emisores de NIR se sintetizaron utilizando un enfoque de abajo hacia arriba en el que la solución precursora de oro (HAuCl4) fue tratada con ligandos tiol adecuados, seguido de una reducción de Au3+. La reducción de los iones metálicos en la solución acuosa tiende a agregar y da como resultado nanopartículas grandes en lugar de NCs ultrapequeños21. Para preparar AuNCs PL ultrapequeños (2 nm), se ajustaron las condiciones sintéticas para evitar la formación de partículas grandes y promover la formación de racimos ultrapequeños. La naturaleza de los ligandos utilizados para tapar la superficie AuNC también juega un papel importante en la influencia de la estructura, las propiedades electrónicas y ópticas de las partículas12,,22,,23,24,,25,,26,27,,28,29,30. Por lo tanto, elegir ligandos adecuados capaces de estabilizar los racimos ultrapequeños es la clave para obtener AuNCs altamente fluorescentes. Los ligandos que contienen tilo son los estabilizadores más utilizados en la síntesis de AuNCs, debido a la fuerte unión covalente entre los tioles y el oro. Un informe anterior31 indica que los ligandos basados en multithiol son muy superiores a los ligandos monothiol en la estabilización de los AuNC PL. Los ligandos multithiol proporcionan una mayor estabilidad coloidal a los AuNC debido al mayor número de sitios de unión entre el ligando y la superficie AuNC. Bidentate thiol TA se utilizó para la síntesis de NIR PL AuNCs porque proporciona una estabilidad coloidal mucho mejor a los AuNCs en una amplia gama de condiciones adversas en comparación con los ligandos monothiol32. TA también proporciona crecimiento en fase acuosa de nanopartículas con control de tamaño discreto, y lo más importante, ofrece un grupo de ácido carboxílico en la superficie de las nanopartículas que se pueden utilizar para la conjugación de moléculas biológicamente relevantes33,,34.

TA estabiliza los ACN por repulsión electrostática causada por grupos de carboxilato desprotonados en la superficie35. Sin embargo, en soluciones ácidas, los ACN protegidos por TA se vuelven coloidos mente inestables debido a la protonación del grupo de carboxilato. Las nanopartículas se pueden estabilizar electrostericamente, en lugar de puramente electrostáticamente. Este enfoque proporciona estabilización coloidal incluso en presencia de altas concentraciones de sal y cambios de pH, lo cual es importante para aplicaciones biomédicas. Para conferir estabilización electrosterica a los TA-AuNCs, los racimos se funcionaron posteriormente con PEG tiol terminado (MW 2.000) a una relación molar de 5:1 de TA:PEG, con un rendimiento de 1 (Figura 1). Para una fijación exitosa de PEG tiol-terminado, TA-AuNCs deben ser purificados. La funcionalización de AuNC con PEG ha mejorado la solubilidad acuosa al pH ácido y un aumento de la estabilidad coloidal en medios de alta resistencia iónica. Es importante que la fijación de la PEG terminada en tiol se lleve a cabo en pH 7.0-7.5. Un pH más alto daría lugar a un desplazamiento azul de la máxima de emisión. Los ligandos no unidos se eliminaron mediante centrifugación/filtración utilizando un dispositivo de filtración por membrana con un corte de peso molecular de 3 kDa. Los ligandos asociados con las nanopartículas experimentan un ensanchamiento significativo de la línea en 1Rmn H en comparación con los ligandos libres, que pueden oscurecer las asignaciones máximas y la integración36. Un pico de RMN de 1H significativamente amplio asociado con ácido tiotico y polietilenglicol modificado con tio sugiere que los ligandos están unidos a la superficie AuNC y la eliminación de ligandos libres18. La integración exitosa de los ACN luminiscentes en un entorno biológico requiere estabilidad sobre las condiciones, como la alta resistencia iónica porque los medios biológicos son ricos en exceso de iones. La estabilidad de 1 se verificó mediante el seguimiento de la fotoluminiscencia en 1 M NaCl durante un período de 72 h. Ningún cambio significativo en las propiedades de la fotoluminiscencia en 1 M NaCl indica una alta estabilidad de los ANC(Figura Suplementaria 1). Los AuNC stuvieron estables en solución tamponada durante más de un año sin ninguna evidencia de precipitación (datos no mostrados).

1 ofrece ácido carboxílico en la superficie. Los reactivos de acoplamiento a base de carbodiimida se utilizan ampliamente para vincular covalentemente los ácidos carboxílicos a las aminas a través de la formación de unión deamida 37. El reactivo de acoplamiento a base de carbodiimide más utilizado en solución acuosa es el clorhidrato de carbodiimida 1-etil-3-(dimetilaminopropyl) (EDC-HCl). EDC-HCl se ha utilizado para el acoplamiento covalente de bromuro TPP con 1 para obtener 2. Una de las principales ventajas de este protocolo es la conjugación de moléculas con un grupo de aminas primarias a través de la formación de enlaces de amida sin comprometer la fluorescencia y la estabilidad coloidal. La caracterización de la microscopía electrónica de transmisión de 1 alta resolución (HRTEM) mostró que los AuNC1 y 2 tienen un diámetro medio de 1,15 a 0,2 nm, lo que indica que el acoplamiento funcional no altera el tamaño del núcleo de los AuNC1.18 Alternativamente, los grupos de carboxilo gratuitos se pueden activar utilizando EDC y Sulfo-NHS38. Soluciones de 1 y 2 excitadas con una lámpara UV (365 nm) fluorescencia de color rojo brillante(Figura 1b, inserción),mientras que aparecen de color amarillo claro bajo la iluminación ambiental(Figura 1a, inserción). La conjugación TPP aumenta el AuNC PL debido a la transferencia de carga de metal a ligado (MLCT)18.

Las nanopartículas pueden causar efectos biológicos adversos que pueden limitar sus aplicaciones en biología. Para evaluar la citotoxicidad de 2 en las células de HeLa, se realizó el ensayo de viabilidad celular XTT (sal interna de 2H-tetrazolium(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenilo)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium). Las células de HeLa tratadas con 2 (200 g/ml) durante 48 h no mostraron pérdida de viabilidad celular en comparación con las células de control. Esta observación sugiere que los ACN son biocompatibles, lo que los convierte en candidatos prometedores como sondas fluorescentes para su aplicación en la investigación biológica.

Cuando se excita con un láser de 405 nm, 2 proporciona una emisión amplia con un máximo de alrededor de 750 nm. El cambio de Stokes extremadamente grande (350 nm) permite distinguir de forma fiable la luz emitida de la emocionante fuente de luz; sin embargo, la configuración del filtro FCM necesita ser configurada apropiadamente. Para 2, el filtro de paso de banda de 780/60 nm es ideal debido a la amplitud del filtro y al hecho de que el máximo de emisión de AuNCs está en la misma región. Es muy importante utilizar filtros de paso de banda amplios en la región de las máximas de emisión para la detección eficiente de PL39,,40,41,42. La señal de fluorescencia dependiente del tiempo y la dosis de las células tratadas con 2 sugiere que la FCM se puede utilizar para monitorear convenientemente los estudios celulares utilizando AuNCs. Cuando el tiempo de incubación se incrementó a 24 h, una concentración de 40 g/ml de 2 fue suficiente para detectar los ACN por fluorescencia en FCM (datos no mostrados). Sin embargo, para tiempos de incubación cortos (1-2 h), se necesitan concentraciones más altas de AuNCs. Este método de detección de ANuenes por señal de fluorescencia NIR con un catómetro de flujo estándar ayudará a ampliar aún más las aplicaciones potenciales de los ACN en la ciencia biomédica. El enfoque descrito aquí podría utilizarse para evaluar las tasas y mecanismos de la utilización celular14,las relaciones entre la concentración de nanopartículas y la toxicidad celular, o los efectos de la química superficial en la ingesta de nanoclústeres de una manera rápida y cuantitativa utilizando FCM.

La aceptación celular de 2 células de HeLa fue imageificada por CLSM. Después de 24 h de incubación se detectó una emisión de color rojo brillante de 2 en el momento de la excitación con láser de 405 nm. Sin embargo, un láser de 405 nm también excita los fluoróforos intrínsecos dentro de las células. Para distinguir la señal de AuNC de la autofluorescencia, la emisión de AuNC se recogió por encima de 650 nm. Las propiedades atractivas, como la luminiscencia brillante de infrarrojo cercano, la alta estabilidad coloidal, la buena biocompatibilidad y los resultados superiores demuestran que los ANAC son agentes de imagen prometedores para aplicaciones de imágenes biomédicas y celulares.

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Disclosures

Algunas partes de los métodos y resultados fueron presentados previamente en el artículo por Pramanik et al.18 Aquí, estos métodos se han convertido en protocolos prácticos punto por punto. Los autores no declaran intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores están agradecidos a Alzbeta Magdolenova por su ayuda con la citometría de flujo. Los autores reconocen el apoyo financiero del proyecto GACR Nr. 18-12533S. La microscopía se realizó en el Laboratorio de Microscopía Confocal y Fluorescencia cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y el presupuesto estatal de la República Checa, proyectos no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 y CZ.2.16/3.1.00/21515, y con el apoyo del proyecto de ri2015062 de ri grande Checo-BioImaging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223

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Bioingeniería Número 157 Nanocluster de Oro Fotoluminiscente Infrarrojo Cercano Alto Rendimiento Cuántico Citometría de Flujo Microscopía Confocal
Síntesis de nanoclusters de oro de emisión de infrarrojo cercano para aplicaciones biológicas
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Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).

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