Summary
İşlevselleştirilebilir, yakın kızılötesi yayan fotolüminesan altın nanokümelerin hazırlanması ve bunların hela hücrelerinin içinde akış sitometrisi ve konfokal lazer tarama mikroskopisi ile doğrudan saptanması için güvenilir ve kolay tekrarlanabilir bir yöntem tanımlanmıştır.
Abstract
Son on yılda, floresan altın nanokümeler (AuNcs) biyolojik uygulamalarda artan popülaritesi tanık olmuş ve büyük çabalar onların gelişimine ayrılmıştır. Bu protokolde, suda çözünür, biyouyumlu ve kolloid olarak kararlı yakın kızılötesi yayan AuNC'ların hazırlanması için yeni geliştirilmiş, kolaybir yöntem ayrıntılı olarak tanımlanmıştır. Bu oda sıcaklığı, aşağıdan yukarıya kimyasal sentez, sulu çözeltide tiyotik asit ve tiyol modifiye polietilen glikol ile kapatılan kolay işlevselauNC'lar sağlar. Sentetik yaklaşım ne organik çözücüler veya ek ligand değişimi ne de üremek için sentetik kimya geniş bilgi gerektirir. Ortaya çıkan AuNCs ücretsiz yüzey karboksilik asitler sunuyoruz, hangi auncs fotolüminesan özellikleri olumsuz etkilemeden serbest amin grubu taşıyan çeşitli biyolojik moleküller ile işlevsel olabilir. HeLa hücreleri tarafından AVuF alımının akış sitometrik nicelleştirme ve konfokal mikroskobik görüntüleme için hızlı ve güvenilir bir prosedür de tanımlanmıştır. Büyük Stokes kayması nedeniyle, AÜ'lerin yakın kızılötesi fotolüminesansının etkin bir şekilde saptanması için akış sitometrisi ve konfokal mikroskopideki filtrelerin doğru şekilde ayarlanması gereklidir.
Introduction
Son on yılda, ultrasmall (≤ 2 nm) fotolüminesan altın nanokümeler (PL AuNCs) hem temel araştırma ve pratik,uygulamalar,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10için umut verici problar olarak ortaya çıkmıştır ., Onların birçok arzu özellikleri yüksek fotostabilite dahil, tunable emisyon maxima, uzun emisyon ömürleri, büyük Stokes vardiya, düşük toksisite, iyi biyouyumluluk, böbrek temizliği ve kolay biyokonjugasyon. PL AuNCs yakın kızılötesi (NIR) spektral bölgeye mavi fotolüminesans sağlayabilir, küme içindeki atomların sayısına bağlı olarak11 ve yüzey ligand12doğasına . NIR (650-900 nm) yayan AuNCs özellikle uzun vadeli in vitro ve hücre ve dokuların in vivo görüntüleme için umut verici, onlar içsel otofloresans ile minimum örtüşme nedeniyle yüksek sinyal-gürültü oranı sunuyoruz, zayıf saçılma ve emilimi, ve NIR ışık yüksek doku penetrasyonu13,14.
Son yıllarda, Au-S kovalent etkileşimleri yararlanmak çeşitli yaklaşımlar nir-PL AuNCs tiyol içeren ligands13,15,,16,17çeşitli ile kaplı hazırlamak için geliştirilmiştir. Biyomedikal uygulamalar için AuNC'ler bağlayıcı etkileşimleri kolaylaştırmak için biyolojik bir bileşenle işlevsel hale getirilmelidir. Bu nedenle, sulu çözücüde kolayca işlevsel hale getirilebilen yüksek kolloidal stabiliteye sahip AuNC'lar son derece arzu edilir. Mevcut protokolün genel amacı, tiyotik asit ve polietilen glikol (PEG) ayrıntılı olarak sulu bir ortamda istihdam ederek yüzeyde işlevselkarboksilik asit grubu ile AuNCs daha önce bildirilen18 hazırlık ve asit-amin kaplin yöntemi aşağıdaki birincil amin taşıyan moleküller ile bunların konjugasyon tanımlamaktır. Sentez kolaylığı ve yüksek tekrarlanabilirlik nedeniyle, bu protokol kimya dışı geçmişe sahip araştırmacılar tarafından kullanılabilir ve uyarlanabilir.
AuNC'lerin biyomedikal araştırmalardaki uygulamaları için en önemli gerekli durumlardan biri, hücrelerin içindeki AuNC'leri gözlemleme ve ölçme yeteneğidir. Hücreler tarafından nanopartikül alımını izlemek için mevcut yöntemler arasında, akış sitometri (FCM) ve konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) hücrelerin çok sayıda floresan nanomalzemelerin içselleştirilmesi hızlı ölçümler sağlayan sağlam, yüksek iş sahibi yöntemleri sunuyoruz19. Burada, ek boyalara gerek kalmadan hücrelerin içindeki PL AuNC'lerin doğrudan ölçümü ve analizi için FCM ve CLSM yöntemi de sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yakın kızılötesi yayan AuNCs hazırlanması (1)
- 7.8 mg (37.8 μmol) tiyotik asit (TA) ve 60 μL 2M NaOH 23.4 mL ultrasaf su (direnç 18.2 MΩ.cm 25 °C) ekleyin ve tamamen eriyene kadar karıştırın (en az 1,000 rpm). TA'nın daha hızlı çözülmesi için karışımı sonicate. Sentez için taze hazırlanmış TA çözeltisi önerilir.
- Çözeltiye 10,2 μL HAuCl4·3H2O (470 mg/mL) sulu çözelti ekleyin.
- 15 dakika sonra, 480 μL NaBH4 (1.9 mg/mL) kuvvetli karıştırma altında (en az 1.000 rpm) ekleyin ve bir gecede aynı koşullar altında reaksiyon karışımı karıştırın.
NOT: NaBH4 çözeltisini buz gibi ultra saf suda taze olarak hazırlayın ve hazırlandıktan hemen sonra reaksiyon karışımına ekleyin.
NOT: AuNCs sentezi kolayca ölçeklenebilir. 2 L'ye kadar AuNC, parçacıkların optik özelliklerinde herhangi bir değişiklik olmaksızın tek bir toplu iş halinde sentezlendi. - (Kritik) Ertesi gün, 3 kDa moleküler ağırlık kesme ile bir membran filtrasyon cihazı kullanarak santrifüj / filtrasyon üç döngü uygulayarak çözeltiarındırın. Bu temizleme yordamı olmadan, aşağıdaki adım düzgün çalışmaz.
- Çözeltiye tiyol lesonlu polietilen glikol (MW 2,000; 15.6 mg; 7.8 μmol) ekleyin, pH'ı 7-7.5'e ayarlayın ve karışımı bir gecede karıştırın ve 1elde etmek için karışımı karıştırın. 3 kDa moleküler ağırlık kesme ile bir membran filtrasyon cihazı kullanarak santrifüj / filtrasyon üç döngü uygulayarak dağılım arındırın.
NOT: pH'ın 7-7.5'e ayarlamı son derece önemlidir. Daha yüksek pH emisyon maksimasının mavi kaymasına neden olabilir.
2. 3-(aminopropil)triphenylphosphonium bromür (DPP) 1 yüzeyinde konjugasyon
- Bir önceki adımda hazırlanan 1 çözeltiyi (24 mL) ve 3-(aminopropil)triphenylphosphonium bromür (12 mg, ~30 μmol) karıştırın. 1 M HCl ile pH'ı 4,5'e ayarlayın.
NOT: 3-(Aminopropil)triphenylfosfonium (TPP) bromür tuzu literatürde açıklandığı gibi20. - N-(3-dimethyl-aminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidroklorür (EDC· HCl) (60 mg, 312 μmol). Çözeltinin pH'ı artacak ve 6'yı geçmesine izin verilmemelidir. Reaksiyon karışımının pH'ını ilk saat boyunca izleyin. PH 6'nın üzerine çıkarsa, 1 M HCl ekleyerek 4.5-6'ya düşürün.
- Oda sıcaklığında bir gecede reaksiyon karışımını karıştırın.
- 2elde etmek için 3 kDa moleküler ağırlık kesme ile bir membran filtrasyon cihazı kullanarak santrifüj / filtrasyon üç döngü uygulayarak dağılım arındırın . 24 mL başlangıç hacmine ultrasaf su ile burada elde edilen seyreltme 2. Çözeltideki Au konsantrasyonu 200 μg/mL'dir.
3. Hücre kültürü
- Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's Medium'undaki Culture HeLa hücreleri (HPA kültür koleksiyonu) 37 °C'de %5 CO2'de %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir.
- Hücreleri ~%80'e ulaştıklarında bölve geçiş. Yeni mutantların edinimi en aza indirmek için, hücre yayılımı sayısı 30'u geçmemelidir.
4. AuNC hela hücrelerine içselleştirme
- Hücreleri 20.000 hücre/mL (1 mL/kuyu) yoğunluğunda 12 kuyulu bir plakaya yerleştirin. Amaç 48 saat sonra ~ % 50 birleşme elde etmektir.
- 48 saat tohumlama sonrası, kültür ortamıaspire ve tam kültür ortamı 400 μL ekleyin (işlenmemiş kontroller için) veya nano tanecikleri 500 μg tam kültürlü orta 400 μL (tedavi örnekleri için) her kuyuya. Kültürleri 37 °C'lik bir kuluçka makinesine geri döndürün.
NOT: Yüksek hacimli AuNC çözeltisinin eklenmesi hücrenin canlılığını olumsuz etkiler. AuNC çözümlerinin konsantre edilmesi gerekir. Böylece 2.4 basamaklı 2 adet elde edilen 100 kez konsantre edilir. 40 mL AuNC 400 μL'ye konsantre edildi. İstenilen AuNC konsantrasyonu elde etmek için 400 μL hücre kültürü ortamına bu konsantre çözeltinin 25 μL aliquot'u eklendi. - 2 saat dahilileştirmeden sonra, hücreleri üreticinin protokolüne göre standart tripsinizasyon ile ayırın.
- 4 °C'de 350 x g'de 5 dk boyunca polipropilen mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj de numuneleri toplayın.
- Aşağıdaki FCM tamponunu hazırlayın: önceden soğutulmuş fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM NaH2PO4, pH 7.4) 4 °C'de %2 büyükbaş serum albumini ile desteklenir.
- 4 °C'de 350 x g'de 5 dk FCM tampon ve santrifüj 1 mL ile peletleri yıkayın.
- 500 μL FCM tamponundaki peleti yeniden askıya alın ve analizden önce numuneleri 4 °C'de saklayın.
5. Akış sitometri analizi
- Tüm numuneleri hücre süzgeci kapağı olan 5 mL polistiren yuvarlak alt tüp kullanarak filtreleyin.
- Enstrüman yazılımını kullanarak veri almadan önce sitometre yapılandırmasını belirtin.
- Tüm nokta çizimlerini ve histogramları 'Satın Almalar' için biçimlendirin.
- Hücrelerin dağılımını göstermek için ileri dağılım alanının (FSC-A) ve yan dağılım alanının (SSC-A) iki parametrelik nokta çizimini çizin. Doublets'ı dışlamak için, FSC yüksekliği (FSC-H) ile FSC-A arasında iki parametrelik nokta çizimi oluşturun. Örnekteki göreceli floresan yoğunluğunu izlemek için floresan kanal alanı (FL-A) için tek parametreli bir histogram çizin. FSC ve SSC verilerini göstermek için doğrusal bir ölçek ve tüm floresan parametreler için logaritmik ölçek kullanın.
- Tesadüfi olayları en aza indirmek için (cihaz tarafından izin verilirse) düşük akış hızında işlenmemiş numune (nano partiküller olmadan) edinin. Satın alma sırasında, FSC vs SSC arsa üzerinde ölçekte işlenmemiş nüfus almak için fotoçarpan tüp (PMT) voltajayarlayınayarlayın. Gerekirse, fl kanalı için PMT voltajlarını ayarlayarak lekesiz popülasyonu histogramın sol köşesine yerleştirin.
- Yazılımdaki belirli 'kapı sekmesini' seçin ve istenilen popülasyonun etrafına uygun bir kapı çizin. Geçitteki hücreler bir sonraki kontrol noktasına hareket edecek.
- Örnek başına 10.000 olay kaydedin.
- Tüm örnekleri aynı alet ayarları altında kaydedin.
- Akış sitometri verilerini analiz etmek için uygun bir program kullanın.
NOT: Bazı uygulamalar, filtrelerin özelleştirilmiş şekilde düzenesi gerektirebilir. Filtre değişimi için her zaman kullanım kılavuzunda üretim önerileri izleyin.
NOT: Deneme kaydedilebilir ve enstrüman ayarlarını ve gating stratejisini korumak için yeniden yüklenebilir.
NOT: Yan dağılım yüksekliği (SSC-H) ve yan dağılım alanı (SSC-A) çizimi de doublet dışlama için kullanılabilir. FSC dedektörü genellikle bir PMT olmadığı için bu tür bir gating daha hassas olabilir.
6. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) için HeLa hücrelerine 2 dahiliyet
- Hücreleri 250.000 hücre/mL (0.5 mL/hazret) yoğunluğunda 4 odalı cam alt 35 mm çanağa yerleştirin. Odayı %5 CO2 atmosferine sahip 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde tutun. Amaç 24 saat sonra ~ % 50 birleşme elde etmektir.
- 24 saat sonra tohumlama da, hücrelerle birlikte 0,5 mL orta içeren her bir çanak odasına 100 μg 2 (veya 10 μL stok çözeltisinden 10 μL) ekleyin (tedavi edilen numuneler için).
- Tabağı kuvöze geri ver. Hücrelerin CLSM için kullanmadan önce AUNC'leri 24 saat içselleştirmesine izin verin.
- İçselleştirme döneminden sonra ortayı atın ve hücreleri önceden ısıtılmış taze orta ile 5 dk yıkayın. Daha sonra her odayı 800 μL taze orta ile doldurun.
7. 2 ile etiketlenmiş canlı Hela hücrelerinin CLSM Görüntüleme
- Mikroskobik görüntüleme için Plan-Apochromatlı bir konfokal mikroskopta 63x yağ (n = 1.518) nesnel lens (NA = 1.4) kullanın.
- 37 °C'ye ısıtılmış ve nemlendirilmiş %5 CO2 atmosferi ile birlikte mikroskop ters sahne üzerine çanak monte.
- İçselleştirilmiş AuNC'yi tespit etmek için, uygun bir ışın ayırıcısı ile %2 güçte 405 nm lazer seti kullanın. Algılama dalga boylarının aralığını 650 ile 760 nm arasında ayarlayın.
- Görüntünün çözünürlüğünü 2048 x 2048 piksel olarak ayarlayın. Edinme hızı ayarında, yaklaşık 4 μs civarında bir piksel dinginlik süresi hedefleyin. İğne deliğini 1 Havadar üniteye (405 nm ışık için) ayarlayın. Daha yüksek hassasiyet için foton sayma modunu kullanın.
- Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ile iletilen ışıkta doğru aydınlatma için Köhler'in kondansatör ayarı ve alan durmasını kullanın. İletilen ışığın elde edilmesi için, herhangi bir floresan dedektörü atanmadan %0,7 güçte 488 nm lazer kullanın. Lazer dalga boyu için uygun bir ışın ayırıcı ayarlayın.
- Her parça için iki görüntü (kırmızı floresan ve DIC) edinin. AuNC'ları kırmızı floresanlarıyla takip edin; hücre sınırları DIC resimleri ile iletilen ışıkta kolayca belirlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NIR PL AuNC'ler AU3+'tan TA varlığında hazırlandı ve daha sonra thiol ile sonlandırılan PEG (MW 2,000) AuNC yüzeyine bağlandı ve Şekil 1'degösterilen iş akışını takiben 1 elde edildi. 1 ve 3-(aminopropil) trihenylphosphonium (TPP) bromür arasında Amidik kaplin sağlanan 2. Beklendiği gibi, soğurma spektrumları(Şekil 2a)AuNCs 1 ve 2 karakteristik bir yüzey plazmon bandına sahip olmadığını ve 550 nm ile 850 nm arasında geniş emisyon gösterdiğini göstermiştir(Şekil 2b). DYP'nin 1yüzeyine bağlanmasından sonra PL güçlü bir şekilde artmıştır. AuNCs gelen emisyon da UV ışığı altında görülebilir (365 nm, Şekil 2b inset). AuNCs gelen emisyon kararlı ve emisyon dalga boyu uyarma dalga boyu bağımsızdır(Şekil 2c). Ancak UV ışığı ile heyecanlandığında emisyon yoğunluğu maksimaldır.
2 bir akış sitometre üzerinde PL izleyerek HeLa hücreleri içinde tespit edildi. HeLa hücreleri 0.5 mg/mL ile 2 mg/mL arasında ortam konsantrasyonlarında 2 ile 2 saat kuluçkaya yatırıldı. FCM verileri HeLa hücreleri tarafından 2 alımı doğruladı. NIR floresans (>720 nm) her iki zamana(Şekil 3a)ve 2 konsantrasyonuna bağlıydı (Şekil 3b). 780/60 bandpass filtresi ile maksimal yoğunluk gözlendi.
Hücrelerdeki AUNC'ler standart konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak non-invaziv olarak görüntülendi. Şekil 4, 2 (200 μg/mL) ile boyanmış HeLa hücrelerinin konfokal görüntüsünü gösterir. 24 saat kuluçkadan sonra hücrelerin içinde 2 adet parlak kırmızı fotolüminesans gözlendi.
Şekil 1: Altın nanokümelerin sentezi. 1 ve 2'ninhazırlanmasının iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Altın nanokümelerin optik özellikleri. Normalleştirilmiş (a) soğurma spektrumları (Inset: Beyaz ışık altında 1 ve 2 sulu çözeltilerin fotoğrafı) ve (b) fotolüminesan spektrum 200 μg/mL sulu çözeltiler 1 ve 2 (Inset: UV ışığı altında AuNC çözeltilerinin fotoğrafı (365 nm)). (c) Uyarma-emisyon PL harita 2. Uyarma 10 nm adım da kaydırılır. 750 nm civarındaki emisyon zirvesi çok kararlıdır (uyarma ile kaymaz) ve uyarma muazzam bir Stokes kayma gösterir. En verimli uyarma yaklaşık 340 nm oluşur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HeLa hücrelerinin içindeki altın nanokümelerin akış sitometrisi ile saptanması. FCM kullanılarak 2'nin HeLa hücrelerine dahiliyeti incelendi. Histogramlar AVuST'ların HeLa hücreleri tarafından konsantrasyona bağımlı alımınıgösterir. Zamana bağlı deneyde HeLa hücreleri tedavi edilmedi (kontrol; 0 saat) veya 1.28 mg/mL 2 ile tedavi edildi ve belirtilen süreler için 37 °C'de kuluçkaya yatırıldı. Hücreler daha sonra PBS ile yıkandı ve FCM tarafından analiz edildi. Konsantrasyona bağımlı deneyde, HeLa hücreleri tedavi edilmedi (kontrol; 0 mg/mL) veya belirtilen konsantrasyonları ile tedavi edildi 2 ve aynı şekilde işlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Altın nanokümelerle etiketlenmiş HeLa hücrelerinin CLSM görüntülemesi. HeLa hücreleri 24 saat boyunca 2 (200 μg/mL) ile kuluçkaya yatırıldı ve CLSM ilegörüntülendi. (a) Kırmızı floresan kanalını (650-760 nm) temsil eder; (b) iletilen ışık kanalı (DIC) ve (c) (a) ve (b)yerindir. Ölçek çubuğu, 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Stabilite testi 1. Fotolüminesans spektrum1 1 M NaCl 0 h ve sonra 72 saat. Yoğunluk maxima'ya normalleştirildi. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NIR yayan AuNCs altın öncül çözeltisi (HAuCl4)uygun tiyol ligands ile tedavi edildi bir aşağıdan yukarıya bir yaklaşım kullanılarak sentezlenmiş, Au3 azalmatakip . Sulu çözeltideki metal iyonlarının azaltılması, ultra küçük NC'ler21yerine büyük nano partiküller ile sonuçlanma eğilimindedir. Ultra küçük (≤2 nm) PL AuNC'ları hazırlamak için, sentetik koşullar büyük parçacıkların oluşumunu önlemek ve ultra küçük kümelerin oluşumunu teşvik etmek için ayarlandı. AÜNC yüzeyini kaplamak için kullanılan ligandların doğası da12, 22,,23,,24,25,26,27,28,29,30parçacıkların yapısını, elektronik ve optik özelliklerini etkileyen önemli bir rol oynar.22 Bu nedenle, ultra küçük kümeleri stabilize yeteneğine sahip uygun ligands seçimi yüksek floresan AuNCs elde etmek için anahtardır. Tiol içeren ligandlar, tiyoller ve altın arasındaki güçlü kovalent bağ sayesinde AuNC sentezinde en sık kullanılan stabilizatörlerdir. Bir önceki rapor31 multitiol bazlı ligands pl AuNCs stabilizasyonu monotiol ligands çok daha üstün olduğunu göstermektedir. Multi-tiol ligands ligand ve AuNC yüzeyi arasında bağlayıcı sitelerin daha yüksek sayıda nedeniyle AuNCs gelişmiş kolloidal stabilite sağlar. Bidentate thiol TA NIR PL AuNCs sentezi için kullanılmıştır çünkü monothiol ligands göre olumsuz koşullar geniş bir yelpazede AuNCs için çok gelişmiş kolloidal stabilite sağlar32. TA da ayrık boyut kontrolü ile nano tanecikleri sulu faz büyüme sağlar, ve en önemlisi, biyolojik olarak ilgili moleküllerin konjugasyonu için kullanılabilir nano tanecikleri yüzeyinde bir karboksilik asit grubu sunuyor33,34.
TA yüzeyde deprotonated karboksiat gruplarının neden olduğu elektrostatik itme ile AuNCs stabilize35. Ancak, asidik çözeltilerde, TA korumalı AuNCs karboksilat grubunun protonasyonu nedeniyle kolloid olarak kararsız hale gelir. Nano tanecikleri tamamen elektrostatik değil, elektrosterik olarak stabilize edilebilir. Bu yaklaşım, biyomedikal uygulamalar için önemli olan yüksek tuz konsantrasyonları ve pH değişiklikleri varlığında bile kolloidal stabilizasyon sağlar. ELEKTROSTErik stabilizasyonu TA-AuNC'lara vermek için kümeler daha sonra tiyol sonlandırılmış PEG (MW 2,000) ile 5:1 molar oranı olan TA:PEG ile işlevselleştirilmiştir ve 1(Şekil 1). Tiyol sonlandırılmış PEG'in başarılı bir şekilde bağlanması için TA-AuNC'lerin saflaştırılması gerekir. AuNC'nin PEG ile işlevselleştirilmesi asidik pH'daki sulu çözünürlüğü ve yüksek iyonik mukavemetli ortamda kolloidal stabilitede artış geliştirilmiştir. Thiol-terminated PEG eki pH 7.0-7.5 yapılır önemlidir. Daha yüksek pH emisyon maksimasının mavi kaymasına neden olur. Bağlanmamış ligandlar 3 kDa moleküler ağırlık kesme ile bir membran filtrasyon cihazı kullanılarak santrifüj/filtrasyon ile çıkarıldı. Nano tanecikleri ile ilişkili ligands deneyim önemli çizgi genişletme 1H NMR serbest ligands ile karşılaştırıldığında, hangi zirve atamaları ve entegrasyon belirsiz36. Önemli ölçüde geniş 1H NMR tepe tiyotik asit ve tiyol modifiye polietilen glikol ile ilişkili ligands AuNC yüzeyine bağlı ve serbest ligandların kaldırılması18. Parlak AuNC'lerin biyolojik bir ortama başarılı bir şekilde entegrasyonu, biyolojik ortam iyonların fazlalığı açısından zengin olduğundan, yüksek iyonik mukavemet gibi koşullar üzerinde istikrar gerektirir. 1'in stabilitesi, 72 saat lik bir süre içinde 1 M NaCl'deki fotolüminesansın izlenmesiyle doğrulandı. 1 M NaCl'deki fotolüminesans özelliklerinde önemli bir değişiklik olmaması AuNCC'lerin yüksek stabilitesini gösterir (Ek Şekil 1). AuNCs yağış herhangi bir kanıt olmadan bir yıldan fazla tamponlu çözelti kararlı (veriler gösterilmedi).
1 yüzeyinde karboksilik asit sunar. Karbodiimid bazlı kaplin reaktifleri yaygın olarak kovalent olarak karboksilik asitleri aminlere amid bağı37'ninoluşumu yoluyla bağlamak için kullanılır. Sulu çözeltide en sık kullanılan karbodiimid bazlı kaplin reaktifi 1-etil-3-(dimethylaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC'HCl) dir. EDC'HCl, DYP bromürünün kovalent kaplini için 1 ile 2elde etmek için kullanılmıştır. Bu protokolün en önemli avantajlarından biri, floresan ve kolloidal stabiliteden ödün vermeden amide bağ oluşumu yoluyla primer amin grubu ile moleküllerin konjugasyonudur. Yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskobu (HRTEM) karakterizasyonu, AuNC'lerin 1 ve 2'nin ortalama çapının 1,15 ± 0,2 nm olduğunu gösterdi, bu da fonksiyonel bağlantının AuNC'lerin çekirdek boyutunu değiştirmediğini gösteriyor18. Alternatif olarak, ücretsiz karboksil grupları EDC ve Sulfo-NHS38kullanılarak etkinleştirilebilir. Bir UV lambası ile heyecanlı 1 ve 2 Çözümleri (365 nm) floresan parlak kırmızı(Şekil 1b, inset), onlar ortam aydınlatması altında açık sarı görünürken(Şekil 1a, inset). DYP konjugasyonu, metalden lige şarj transferi (MLCT)18nedeniyle AuNC PL'yi arttırır.
Nano partiküller biyolojideki uygulamalarını sınırlandırabilen olumsuz biyolojik etkilere neden olabilir. HeLa hücrelerinde 2'nin sitotoksiteliğini değerlendirmek için XTT (sodyum 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)-karbonil]-2H-tetrazolyum iç tuz) hücre canlılığı tayini yapıldı. 48 saat boyunca 2 (200 μg/mL) ile tedavi edilen HeLa hücreleri kontrol hücrelerine göre hücre canlılığı kaybı göstermedi. Bu gözlem AuNCs biyouyumlu olduğunu göstermektedir, hangi biyolojik araştırma uygulama için floresan problar olarak umut verici adaylar yapar.
405 nm lazer ile heyecanlandığında, 2 ~ 750 nm civarında maksimum geniş bir emisyon sağlar. Son derece büyük Stokes kayması (~350 nm) yayılan ışığın heyecan verici ışık kaynağından güvenilir bir şekilde ayırt edilmesine olanak sağlar; ancak, FCM filtre ayarı uygun şekilde yapılandırılması gerekir. 2 için, 780/60 nm bandpass filtresi, filtrenin genişliği ve AuNC'lerin emisyon maksimumunun aynı bölgede olması nedeniyle idealdir. PL39,40,,41,42verimli tespiti için emisyon maxima bölgesinde geniş bandpass filtreleri kullanmak çok önemlidir. 2 ile tedavi edilen hücrelerden gelen zaman ve doza bağlı floresan sinyali, FCM'nin AuNCs kullanarak hücre çalışmalarını rahatlıkla izlemek için kullanılabileceğini düşündürmektedir. Kuluçka süresi 24 saate yükseltildiğinde, FCM'de 40 μg/mL konsantrasyonu 2'ye yükseltildiğinde, AUNC'lerin FCM'de floresan tarafından saptanması yeterliydi (veriler gösterilmedi). Ancak, kısa kuluçka süreleri için (1-2 saat), AuNCs yüksek konsantrasyonlarda gereklidir. NiR floresan sinyali ile AuNCs tespit Bu yöntem standart bir akış sitometresi ile auncs potansiyel uygulamaları daha da genişletilmesine yardımcı olacaktır biyomedikal bilim. Burada açıklanan yaklaşım oranları ve hücresel alım mekanizmaları değerlendirmek için kullanılabilir14,nanopartikül konsantrasyonu ve hücresel toksisite arasındaki ilişkiler, ya da nanoküme alımı yüzey kimyası etkileri fcm kullanarak hızlı ve nicel bir şekilde.
HeLa hücreleri tarafından 2 hücresel alımı CLSM tarafından görüntülendi. 24 saat kuluçkadan sonra 405 nm lazer ile uyarma sonrasında 2'lik parlak kırmızı emisyon saptandı. Ancak, bir 405 nm lazer de hücrelerin içinde içsel floropores heyecanlandırır. AuNC sinyalini otofloresan ayırt etmek için AuNC'den gelen emisyon 650 nm'nin üzerinde toplandı. Parlak yakın kızılötesi parlaklık, yüksek kolloidal stabilite, iyi biyouyumluluk ve yukarıdaki sonuçlar gibi çekici özellikleri AuNCs biyomedikal ve hücresel görüntüleme uygulamaları için görüntüleme ajanları umut verici olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yöntem ve sonuçların bazı bölümleri daha önce Pramanik ve ark.18 Burada, bu yöntemler pratik nokta-nokta protokoller dönüştürülmüştür makalede sunulmuştur. Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Yazarlar alzbeta Magdolenova akış sitometri ile ona yardım için minnettarız. Yazarlar GACR proje Nr. 18-12533S mali destek kabul. Mikroskopi, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu ve Çek Cumhuriyeti'nin devlet bütçesi tarafından ortaklaşa finanse edilen Konfokal ve Floresan Mikroskopi Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 ve CZ.2.16/3.1.00/21515 ve Çek-BioImaging büyük RI projesi LM2015062 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
References
- Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
- Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
- Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
- Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
- Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
- Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
- Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
- Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
- Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
- Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
- Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
- Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
- Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
- Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
- Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
- Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
- Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
- Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
- Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
- Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
- Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
- Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
- Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
- Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
- Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
- Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
- Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
- Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
- Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
- Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
- Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
- Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
- Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
- Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
- Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
- Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
- Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
- Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).
