Summary
हमने सेल आधारित उपचारों के लिए स्टेम सेल के इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन के प्रभाव और सुरक्षा का परीक्षण करने के लिए बाएं परिरफ्लेक्स धमनी रुकावट और तेजी से पेसिंग से प्रेरित दिल की विफलता का एक सूअर मॉडल स्थापित करने की मांग की।
Abstract
हालांकि मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) के बाद हार्ट फेलियर (एचएफ) के इलाज में प्रगति हासिल की गई है, लेकिन एमआई के बाद एचएफ दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता के प्रमुख कारणों में से एक बना हुआ है । एमआई के बाद कार्डियक रिपेयर और लेफ्ट वेंट्रिकुलर फंक्शन में सुधार के लिए सेल-आधारित उपचारों ने काफी ध्यान आकर्षित किया है। तदनुसार, इन सेल प्रत्यारोपण की सुरक्षा और प्रभावकारिता का परीक्षण नैदानिक उपयोग से पहले एचएफ के एक पूर्व नैदानिक बड़े पशु मॉडल में किया जाना चाहिए। सूअर व्यापक रूप से हृदय के आकार और कोरोनरी शरीर रचना विज्ञान के मामले में मनुष्यों के लिए अपनी समानता के कारण हृदय रोग अनुसंधान के लिए उपयोग किया जाता है । इसलिए, हमने बाईं परिधि धमनी (एलसीएक्स) के बंद-छाती कोरोनरी गुब्बारे ऑक्सीकरण का उपयोग करके एक पोर्सिन क्रोनिक एचएफ मॉडल की स्थापना के लिए एक प्रभावी प्रोटोकॉल पेश करने की मांग की, जिसके बाद पेसमेकर प्रत्यारोपण के साथ प्रेरित रैपिड वेंट्रिकुलर पेसिंग किया गया। आठ हफ्ते बाद स्टेम सेल को पेरी-इंफार्ट क्षेत्र में इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन से प्रशासित किया गया । फिर इनफार्क आकार, सेल सर्वाइवल, और लेफ्ट वेंट्रिकुलर फंक्शन (इकोकार्डियोग्राफी, हेमोडायनामिक पैरामीटर्स और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सहित) का मूल्यांकन किया गया। यह अध्ययन स्टेम सेल उपचार के लिए एक स्थिर प्रीक्लिनिकल बड़े पशु एचएफ मॉडल स्थापित करने में मदद करता है।
Introduction
हृदय रोग, कोरोनरी धमनी रोग (सीएडी) विशेष रूप से, हांगकांग और दुनिया भर में 1 में रुग्णता और मृत्यु दर का प्रमुख कारण बनेहुएहैं । हांगकांग में, अस्पताल प्राधिकरण के तहत इलाज किए गए सीएडी रोगियों की संख्या में 2012 से 2017 तक26%की वृद्धि का अनुमान लगाया गया था। सभी सीएडी में, तीव्र मायोकार्डियल इंफेक्शन (एमआई) मृत्यु और बाद की जटिलताओं का एक प्रमुख कारण है, जैसे कि हार्ट फेलियर (एचएफ)। ये महत्वपूर्ण चिकित्सा, सामाजिक और वित्तीय बोझ में योगदान देते हैं। एमआई के साथ रोगियों में, थ्रोम्बोलिटिक थेरेपी या प्राथमिक percutaneous कोरोनरी हस्तक्षेप (पीसीआई) जीवन के संरक्षण में एक प्रभावी चिकित्सा है, लेकिन इन उपचारों केवल एमआई के दौरान कार्डियोमायोसाइट (सीएम) नुकसान को कम कर सकते हैं । उपलब्ध उपचार सीएम के स्थायी नुकसान की भरपाई करने में असमर्थ हैं, जो कार्डियक फाइब्रोसिस, मायोकार्डियल रिमॉडलिंग, कार्डियक अतालता और अंततः दिल की विफलता की ओर जाता है। 1 साल के बाद एमआई पर मृत्यु दर 20% से अधिक एचएफ 3 विकसित रोगियों के साथलगभग 7%है । अंत चरण एचएफ रोगियों में, हृदय प्रत्यारोपण ही उपलब्ध प्रभावी चिकित्सा है, लेकिन यह उपलब्ध अंगों की कमी से सीमित है । एमआई एचएफ के बाद के विकास को रिवर्स करने के लिए उपन्यास चिकित्सा आवश्यक हैं। नतीजतन, सेल आधारित चिकित्सा को एमआई के बाद एचएफ में बिगड़ा हुआ सीएम की मरम्मत और बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) समारोह में सुधार करने के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण माना जाता है। हमारे पिछले अध्ययनों में एमआई4,5के छोटे पशु मॉडलों में सीधे इंट्रामायोकार्डियल प्रत्यारोपण के बाद स्टेम सेल प्रत्यारोपण हृदय कार्य सुधार के लिए फायदेमंद पाया गया । इस प्रकार नैदानिक उपयोग से पहले स्टेम सेल प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता और सुरक्षा का परीक्षण करने के लिए मानकीकृत प्रीक्लिनिकल बड़े पशु एचएफ प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।
हाल के दशकों में स्टेम सेल थेरेपी के लिए हृदय अनुसंधान में सूअरों के व्यापक उपयोग देखा है । एचएफ सूअर हृदय के आकार, वजन, ताल, समारोह, और कोरोनरी धमनी शरीर रचना विज्ञान के मामले में मनुष्यों के लिए उनकी समानता के कारण अनुवाद अनुसंधान का एक आशाजनक मॉडल हैं । इसके अलावा, पोर्सिन एचएफ मॉडल सीएम मेटाबोलिज्म, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों और न्यूरोएंडोक्राइन परिवर्तनों के संदर्भ में पोस्ट-एमआई एचएफ रोगियों की नकल कर सकतेहैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल इस तरह के एक मानकीकृत सुअर एचएफ मॉडल का उपयोग करता है, जो बाईं परिधि धमनी (एलसीएक्स) के एक बंद छाती कोरोनरी गुब्बारे ऑक्सीकरण को नियोजित करता है जिसके बाद पेसमेकर प्रत्यारोपण द्वारा प्रेरित तेजी से पेसिंग होती है। यह अध्ययन एमआई एचएफ के बाद के उपचार के लिए स्टेम सेल के इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन के मार्ग का भी अनुकूलन करता है । इसका उद्देश्य क्रोनिक मायोकार्डियल इंफार्क्शन का एक पोर्सिन पशु मॉडल का उत्पादन करना है जिसका उपयोग गंभीर सीएडी वाले रोगियों के लिए चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक उपचार विकसित करने के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया गया अमेरिका के स्वास्थ्य और हांगकांग विश्वविद्यालय के विनियमों के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रकाशित, और प्रोटोकॉल हांगकांग विश्वविद्यालय में शिक्षण और अनुसंधान (CULTAR) में लाइव जानवरों के उपयोग पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
नोट: 35-40 किलो (9-12 महीने पुराना) वजनी मादा खेत सूअरों का इस्तेमाल इस अध्ययन के लिए किया गया था । इस प्रयोग का प्रवाह चित्र 1में दिखाया गया है .
1. सर्जिकल प्रक्रिया
- संज्ञाहरण और जानवर की तैयारी
- 12 घंटे के लिए जानवरों को उपवास करें और प्रयोग से पहले 4 घंटे के लिए पानी के अभाव के अधीन रहें।
- सामान्य खारा के 20 एमएल में तैयार तिलेटामाइन + जोलेजेपम (2-7 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (0.5-1 मिलीग्राम/किलो) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के माध्यम से सूअरों को एनेस्थेटाइज करें । जानवर की पालपेब्रल सजगता की निगरानी तब तक करें जब तक कि वे अनुपस्थित न हों।
- सुअर के बालों को हटा दें और 1.3-1.5 वर्गों के लिए गर्दन और कमर पर त्वचा को निष्फल करें। 70% इथेनॉल और बीटाडीन के साथ ऑपरेशन क्षेत्र 3x को कीटाणुरहित करें।
- पोर्सिन श्वासनली में 7 मिमी एंडोट्रेक्ल ट्यूब रखें और कान वेना में 22 ग्राम वेनस इंडवेलिंग सुई रखें।
- ऑपरेटिंग टेबल पर सुअर ले जाएँ और एक रीढ़ की स्थिति में जगह है। एंडोट्रेक्ल ट्यूब को श्वसन यंत्र और यांत्रिक रूप से हवादार (प्रेरणादायक/एक्सपायरी समय अनुपात 1:2) आइसोफ्लाणे (1.5%-2.0% साँस लेने) और ऑक्सीजन (0.5-1.5 एल/मिनट साँस लेना) के साथ जानवर को कनेक्ट करें।
- सतह इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम और रक्तचाप की निगरानी करें, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग सिस्टम के माध्यम से हृदय गति, हृदय ताल और धमनी रक्तचाप की लगातार निगरानी करें।
- इकोकार्डियोग्राफी
- सुअर को बाएं पार्श्व डेकुबिटस स्थिति में ले जाएं और मेज पर ठीक करें।
- परिकार्डियल क्षेत्र पर जांच रखो और 2D और एम मोड इमेजिंग सहित धारावाहिक इकोकार्डियोग्राफी, एक उच्च संकल्प इकोकार्डियोग्राफिक प्रणाली और बेसलाइन पर एक 3-9 मेगाहर्ट्ज ट्रांसड्यूसर का उपयोग कर, सेल प्रत्यारोपण से पहले और सेल प्रत्यारोपण के बाद 8 सप्ताह(पूरक चित्रा 1)।
- वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सभी प्राप्त छवियों का विश्लेषण करें। एलवी एंड-डायस्टोलिक आयाम (एलवीईडी), एलवी एंड-सिस्टोलिक आयाम (एलवीएएसडी), एलवी एंड-डायस्टोलिक वॉल्यूम (एलवीईडीवी), एलवी एंड-सिस्टोलिक वॉल्यूम (एलवीवीवी), एलवी इजेक्शन अंश (एलवीईएफ) और मानक इकोकार्डियोग्राफिक छवियों के बाद दीवार की मोटाई की गणना करें।
नोट: सभी ऑफ लाइन विश्लेषण एक कंप्यूटर वर्कस्टेशन का उपयोग कर एक और स्वतंत्र ऑपरेटर द्वारा आयोजित किए गए थे । विभिन्न पर्यवेक्षकों के बीच माप की परिवर्तनशीलता 20 दोहराया यादृच्छिक छवियों के आधार पर 4% था । सभी इकोकार्डियोग्राफिक माप अमेरिकन सोसायटी ऑफ इकोकार्डियोग्राफी सिफारिशों के अनुसार किए गए थे।
- पेसमेकर प्रत्यारोपण
- सुअर को रीढ़ की स्थिति में ले जाएं और पट्टियों के साथ मेज पर सुअर के अंगों को ठीक करें।
- कैरोटिड त्रिकोण में सही कैरोटिड धमनी और जुगुलर नस का पता लगाएं (स्टर्नोकलिडोमास्टोइड के पीछे और स्टाइलोयोयोइड, डिगास्ट्रिक मांसपेशी और ओमोयोइड से घिरा हुआ) और बाँझ परिस्थितियों(पूरक चित्रा 2)के तहत हेममोस्टेटिक संदंश के साथ सही कैरोटिड धमनी और जुगुलर नस को अलग करें। सही कैरोटिड धमनी और जुगुलर नस के डिस्टल एंड को लिगेट करें। 2-0 Vicryl के साथ दो मांसपेशियों सीना।
- एक एंजियोकथ के साथ सही जुगुलर नस को कैनुलेट करें और एक्स-रे मार्गदर्शन(चित्रा 2)के तहत सही वेंट्रिकल के लिए पेसमेकर लीड डालें।
- संदंश का उपयोग कर स्टर्नोक्लेइडोमास्टोइड और पूर्वकाल स्केलेन मांसपेशी को अलग करें। दो मांसपेशियों के बीच एक पेसमेकर प्रत्यारोपण और 2-0 रेशम के साथ दो मांसपेशियों सीना। पेसमेकर को लीड से कनेक्ट करें।
- प्रत्यारोपण के बाद पेसमेकर जनरेटर द्वारा पेसमेकर को बैकअप वीवीआई मोड (35 बीपीएम) के लिए रीप्रोग्राम करें।
- एमआई इंडक्शन के 4 सप्ताह बाद पेसमेकर जनरेटर द्वारा एचएफ को प्रेरित करने के लिए रैपिड वेंट्रिकुलर पेसिंग (150 बीट्स/मिनट) लागू करें। फिर पेसमेकर को 8 सप्ताह में बैकअप वीवीआई मोड पर वापस सेट करें।
- इनवेसिव प्रेशर वॉल्यूम लूप एनालिसिस
नोट: बेसलाइन पर आक्रामक हेमोडायनामिक मूल्यांकन करें, सेल प्रत्यारोपण से पहले और एलवी समारोह में परिवर्तन का आकलन करने के लिए सेल प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद।- फीमोरल त्रिकोण में सही फीमोरल धमनी और फीमोरल नस को अलग करें (इंगिनल स्नायु, सरटोरियस मांसपेशी, और एडुकेक्टर लॉन्गस मांसपेशी से घिरा हुआ)(पूरक चित्रा 2)।
- एक एंजियोकथ के साथ सही फेमोरल धमनी को कैनुलेट करें और एंजियोकथ के माध्यम से धमनी में एक गाइडवायर रखें। एंजियोकथ निकालें और गाइडवायर के मार्गदर्शन में धमनी में एक 9F म्यान कैनुलेट। गाइडवायर निकालें।
- चरण 1.4.2 में वर्णित 12F म्यान के साथ सही नैतिक नस को कैनुलेट करें। एक्स-रे मार्गदर्शन के तहत अवर वेना कावा (आईवीसी) में रखा 12F म्यान से एक गुब्बारा कैथेटर डालें।
- पीवी सिग्नल प्रोसेसर के साथ आइसोटोनिक नमकीन में 7 एफआर प्रेशर-वॉल्यूम (पीवी) कैथेटर को कैलिब्रेट करें।
- एक्स-रे मार्गदर्शन के तहत रखा 9F म्यान से एलवी शीर्ष में पीवी कैथेटर डालें। वेंटिलेशन को निलंबित करें और पीवी सिग्नल प्रोसेसर के साथ बाएं वेंट्रिकुलर मैक्सिमल पॉजिटिव प्रेशर डेरिवेटिव (+डीपी/डीटी), एंड-सिस्टोलिक प्रेशर (ईएसपी), और एंड-डायस्टोलिक प्रेशर (ईडीपी) को मापें।
- आईवीसी के ऑक्लूसेशन के दौरान पीवी सिग्नल प्रोसेसर द्वारा एंड सिस्टोलिक प्रेशर-वॉल्यूम रिलेशनशिप (ईएसपीवीआर) को मापें।
- प्रक्रिया समाप्त होने पर वेंटिलेशन को पुनः आरंभ करें।
- एमआई का इंडक्शन
- नसों में एमिओडारोन (5 मिलीग्राम/किलो नसों में 1 घंटे से अधिक) और लिडोकेन (१.५ मिलीग्राम/किलो नसों में बोलस) को एमआई के शामिल होने से पहले जानवर को प्रशासित करें ताकि वेंट्रिकुलर अतालता को रोका जा सके ।
- चरण 1.4.3 में उल्लिखित 8F म्यान के साथ सही कैरोटिड धमनी को कैनुलेट करें।
- मानक सी आर्म फ्लोरोस्कोपी उपकरण द्वारा निर्देशित रखा म्यान के माध्यम से एक 6F JR4 ओवर-द-वायर गाइडिंग कैथेटर के माध्यम से कोरोनरी एंजियोग्राफी करें।
- एक्स-रे मार्गदर्शन(चित्रा 2)के तहत पेरक्यूटेनियस ट्रांसल्यूमिनल कोरोनरी एंजियोप्लास्टी (पीटीसीए) फैलाव गुब्बारा कैथेटर मुद्रास्फीति के साथ पहली ऑप्टस सीमांत शाखा के लिए बाएं पर्कुफ्लेक्स कोरोनरी धमनी (एलसीएक्स) डिस्टल को ऑक्टेड करें।
- एलसीएक्स को ब्लॉक करने के लिए गुब्बारे कैथेटर के माध्यम से 10 एमएल सिरिंज में तैयार खारा के 3 एमएल के साथ मिश्रित 700 माइक्रोग्राम स्पंज माइक्रोस्फीयर के 1 एमएल इंजेक्ट करें, फिर गुब्बारे को डिफ्लेट करें और ऑक्सक्लूज़न की पुष्टि करने के लिए एंजियोग्राम करें।
- सफल पूर्ण रुकावट प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया दोहराएं।
- हृदय अतालता का पता लगाने के लिए पशु हृदय गति और ताल की निगरानी करें। यदि वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन हुआ, तो 150-300 जे झटके का उपयोग करके एक साइनस लय को फिर से स्थापित करने के लिए एक बाहरी, बिफेसिक डिफिब्रिलेटर का उपयोग करें।
- स्टेम सेल इंजेक्शन
- बेतरतीब ढंग से दिल समारोह की उल्लेखनीय हानि के साथ सभी जानवरों को आवंटित (LVEF & एमआई के प्रेरण के बाद 8 सप्ताह में ४०%) दो अलग-अलग समूहों को: एक जो 2 x 108 मानव प्रेरित प्लूरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मेसेन्चिमल स्टेम सेल (एचआईपीएससी-एमएससी) का इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन प्राप्त करेगा, और दूसरा जो एचिप्ससी-एमएससी प्राप्त नहीं करेगा।
- इंट्रामियोकार्डियल प्रत्यारोपण के लिए सामान्य खारा के 2 एमसीएल में एचइपीएससी-एमएससी तैयार करें। इंट्रामायोकार्डियल हिप्ससी-एमएससी प्रत्यारोपण से पहले धारा 1.1 में उल्लिखित एनेस्थीसिया और पशु तैयारी के कदमों को दोहराएं, इस बार शीर्ष बीट क्षेत्र के चारों ओर 10 सेमी की नसबंदी करें। एक रिट्रैक्टर के साथ 4-5 इंटरकोस्टल अंतरिक्ष में बाएं थोराकोटॉमी का प्रदर्शन करें। इनफार्ड पार्श्व दीवार को बेनकाब करने के लिए पेरिकार्डियोटॉमी करें।
नोट: चीरा की लंबाई 10-12 सेमी थी। - जानवरों के एक समूह या दूसरे समूह (चित्रा 3) को संस्कृति माध्यम(सामग्री की तालिका)का प्रशासन करने के लिए इनफार्क क्षेत्र के आसपास 5-8 इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन (~ 0.3 एमएल प्रति इंजेक्शन)का उपयोग करें। any रक्तस्राव के जोखिम को कम करने के लिए कोरोनरी धमनियों को किसी भी नुकसान से सावधानी से बचें।
- लोहे के तार के साथ इंटरकोस्टल स्पेस को बंद करें और मांसपेशियों की परत को 2-0 रेशम के साथ बंद करें। चमड़े के नीचे के ऊतकों और त्वचा को 2-0 विक्रिल के साथ सीना।
- इंट्राकार्डिएक प्रोग्राम विद्युत उत्तेजना
- सेल प्रत्यारोपण चिकित्सा के बाद वेंट्रिकुलर टैचियाररिथमिया (वीटी) की अदुकिष्ठता का आकलन करने के लिए प्रोग्रामेबल उत्तेजक का उपयोग करके प्रोग्राम विद्युत उत्तेजना को निष्पादित करें।
- सभी जानवरों का त्याग करने से पहले फेमोरल नस के माध्यम से सही वेंट्रिकुलर शीर्ष में एक 6F इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल कैथेटर डालें।
- सतह इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम के साथ इंट्राकार्डियाक रिकॉर्डिंग प्रदर्शित करता है मैं, द्वितीय, और III इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग सिस्टम पर २०० मिमी/s की गति से होता है । एक उत्तेजक का उपयोग कर 2x डायस्टोलिक दहलीज पर एक 2 एमएस पल्स चौड़ाई वितरित करें।
- दो ड्राइव साइकिल लंबाई (200 एमएस और 300 एमएस) पर आठ उत्तेजनाओं (S1) की एक पेसिंग ट्रेन वितरित करें, इसके बाद एक (S2) या दो (S2 और S3) समय से पहले अतिरिक्त उत्तेजनाओं।
- क्रमिक प्रभावी रिफ्रैक्टरी अवधि या अतालता को प्रेरित करने तक युग्मन अंतराल को क्रमिक रूप से छोटा करें। अकांक्षित निरंतर वीटी (>10 s) की उपस्थिति पर ध्यान दें।
2. पश्चात प्रोटोकॉल
- पश्चात दवा
- एचएफ के लिए पारंपरिक औषधीय उपचार करें। संक्षेप में, मौखिक रूप से सभी जानवरों को रोजाना मेटोप्रोल संक्षेप (25 मिलीग्राम) और रामप्रिल (2.5 मिलीग्राम) का प्रशासन करें।
- इंट्रामस्क्युलर रूप से संक्रमण को रोकने और दर्द से राहत पाने के लिए सर्जरी के बाद 1 सप्ताह के लिए सभी जानवरों को एन्रोफ्लोक्सेसिन (5 मिलीग्राम/किलो) और बुप्रेनोरफिन (0.01 मिलीग्राम/किलो) का प्रशासन करते हैं।
- प्रतिरक्षा अस्वीकृति को कम करने के लिए, मौखिक रूप से एक स्टेरॉयड (40 मिलीग्राम/
- इनफाफेक्ट साइज असेसमेंट
- प्रयोग के अंत में डोरमाइनल (पेंटोबार्बिटल सोडियम, 100 मिलीग्राम/किलोग्राम, चतुर्थ) की अधिक मात्रा से जानवरों को इच्छामृत्यु दें।
- छाती खोलें और दिल को इकट्ठा करें। 0.9% खारा में दिल कुल्ला।
- एलवी ट्रांसवर्स दिशा में 1 सेमी मोटाई पर स्केलपेल के साथ क्रमिक अनुभाग एलवी ऊतक नमूने।
- दीवार की मोटाई और इनफार्ट क्षेत्र को मापने के लिए इनफार्टेड मायोकार्डियम वाले स्लाइस के कुछ हिस्सों का चयन करें।
- इन स्लाइस की छवि को कैप्चर करें और वाणिज्यिक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दीवार की मोटाई और इनफार्ट क्षेत्र का मात्रात्मक रूप से विश्लेषण करें।
- एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% फॉर्मलिन में ऊतक को ठीक करें। पैराफिन में इनफार्ट साइटों (~ 1 सेमी2 टुकड़े) के भीतर, आसन्न और रिमोट के ऊतकों को एम्बेड करें। हिस्टोलॉजिकल परीक्षा के लिए माइक्रोटॉम का उपयोग करके 5 माइक्रोन स्लाइस में अनुभाग करें।
- सेल सर्वाइवल
- निर्माता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार एंटी-ह्यूमन न्यूक्लियर एंटीजन (हना) के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला द्वारा प्रत्यारोपित कोशिकाओं के engraftment का पता लगाएं।
- प्रत्येक जानवर में पांच यादृच्छिक क्षेत्रों में तीन अलग-अलग वर्गों में छवि को कैप्चर करें और पेरी-इनफाक्ट क्षेत्र में सकारात्मक कोशिकाओं का मात्रात्मक रूप से विश्लेषण करें।
नोट: छवि कैप्चरिंग सिस्टम और छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग हृदय वर्गों की छवियों को कैप्चर और विश्लेषण करने के लिए किया जाता था।
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Representative Results
मृत्यु दर
इस अध्ययन में कुल 24 सूअरों का इस्तेमाल किया गया। इनमें से तीन की मौत लगातार वीटी के कारण एमआई इंडक्शन के दौरान हुई । घाव से खून बहने की वजह से सेल इंजेक्शन के लिए ओपन हार्ट सर्जरी में एक जानवर की मौत हो गई । गंभीर संक्रमण के कारण दो पशुओं की मौत हो गई। मामूली ईएफ कमी (एलवीईएफ में कमी और बेसलाइन का 40%) के कारण दो जानवरों को बाहर रखा गया था। नतीजतन, 16 जानवरों ने पूरा अध्ययन प्रोटोकॉल पूरा किया।
कार्डियक फंक्शन और रीमॉडलिंग
धारावाहिक इकोकार्डियोग्राफिक परीक्षा से पता चला है कि एलवीईएफ काफी बेसलाइन पर 68.23 ± 3.52% से घटकर 39.37 ± 3.22% हो गया। एलवीईडी में काफी वृद्धि हुई 3.6 ± 0.5 से 4.8 ± 0.4 और एलवीएएसडी ने एमआई के शामिल होने के 8 सप्ताह बाद 2.5 ± 0.3 से 3.9 ± 0.4(चित्रा 4ए)तक काफी वृद्धि की। एलवीईएफ और एलवीएसडी ने प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद हिप्ससी-एमएससी समूह में क्रमशः 52.9 ± 4.27% और 3.3 ±0.3में सुधार किया, जबकि एमआई स्थिति (चित्रा 4ए)की तुलना में।
+dP/dt और ESPVR काफी 1,325 ± 63 mmHg/s और 3.9 ± 0.4 बेसलाइन पर 978 ± 45 mmHg/s और 1.8 ± 0.2 से एमआई के शामिल होने के बाद 8 सप्ताह में कम हो गया। एचआईएससी-एमएससी के इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन ने एमआई स्टेटस(चित्रा4बी)की तुलना में आईपीएससी-एमएससी प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद +dP/DT और ESPVR को 1,127.4 ± 50 एमएमएचजी/एस और 2.6 ± 0.3 तक बढ़ा दिया।
इनफारेक्ट दीवार की मोटाई
औसत एलवी इनफारेक्ट दीवार की मोटाई प्रत्येक जानवर(चित्रा5) में 5-7 सीरियल 1 सेमी मोटाई अनुभाग नमूनों से मापी गई थी। एलवी इंफेक्शन का प्रतिशत 16 ± 2% था।
प्रत्यारोपण के बाद सेल सर्वाइवल
प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद इनफार्क क्षेत्र में इंजेक्शन साइट के आसपास कोई सेल सर्वाइवल नहीं था, लेकिन पेरि-इनफार्क क्षेत्र(चित्रा 6)में कम संख्या में जीवित हिप्ससी-एमएससी दिखाई दे रहे थे ।
अकांक्षित वेंट्रिकुलर अतालता
एचएफ (एमआई के प्रेरण के बाद बेसलाइन बनाम 75% 8 सप्ताह) के साथ जानवरों में प्रारंभिक निरंतर वेंट्रिकुलर टैचिरिथिमियास की घटनाओं को आसानी से बढ़ाया जा सकता है। एचआईपीएससी-एमएससी प्रत्यारोपण एचआईपीएससी-एमएससी, चित्रा 7के इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन के 8 सप्ताह बाद वीटी (एचआईपीएससी-एमएससी समूह में 62.5%) की संवेदनशीलता को कम करने के लिए अंतर्निहित मायोकार्डियल सब्सट्रेट को काफी संशोधित नहीं करता है।
चित्रा 1: प्रयोग का प्रवाह चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: मायोकार्डियल इंफार्क्शन का पोर्सिन मॉडल। मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) के पोर्सिन मॉडल को पहली सीमांत शाखा में बाईं परिष्कार कोरोनरी धमनी (एलसीएक्स, लाल तीर) डिस्टल के एम्बोलाइजेशन से प्रेरित किया गया था। इस कोरोनरी धमनी गुब्बारा मुद्रास्फीति और ७०० μm माइक्रोस्फीयर के एक इंजेक्शन के साथ occluded था । पूर्व एमआई, गुब्बारा मुद्रास्फीति, और पोस्ट-एमआई में कोरोनरी एंजियोग्राफी सही कैरोटिड धमनी के माध्यम से एक 6F JR4 मार्गदर्शक कैथेटर के माध्यम से किया गया था । पेसमेकर लेड को सही वेंट्रिकल वॉल (ब्लू एरो) में डाला गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एमआई के एक पोर्सिन मॉडल में सेल प्रत्यारोपण। बाएं थोराकोटॉमी के दौरान बाएं वेंट्रिकल के इनफार्क्ट क्षेत्र के चारों ओर पार्श्व दीवार पर सेल इंजेक्शन साइटें। नीला तीर पेरी-इनफार्ट एरिया को दिखाता है और लाल तीर इनफार्ट एरिया को दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: एमआई के बाद हार्ट फंक्शन बदलता है। (A)बेसलाइन, एमआई और सेल ट्रांसप्लांटेशन पर एलवी एम-मोड इकोकार्डियोग्राम इमेज । एलवीईएफ, एलवीईडी, एलवीएसडी ने एमआई इंडक्शन के 8 सप्ताह बाद काफी कमी की और सेल प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद एचएसएससी-एमएससी समूह में काफी वृद्धि हुई । (ख)दिल की विफलता के साथ सूअरों के हृदय समारोह का आकलन करने के लिए, + डीपी/डीटी मूल्य और ESPVR एक पीवी सिग्नल प्रोसेसर के साथ मापा गया । ईएसपीआर मूल्यांकन के दौरान अवर वेना कावा (आईवीसी) को गुब्बारे की मुद्रास्फीति (नीले तीर) द्वारा ओक्यूलैड किया गया था। एमआई इंडक्शन के बाद + डीपीपी/डीटी और ईएसपीवीआर दोनों में काफी कमी आई, और फिर प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद एचआईपीएससी-एमएससी समूहों में काफी वृद्धि हुई । ANOVA छात्र द्वारा पीछा-ंयूमैन-Keuls पोस्ट हॉक परीक्षण (एसपीएसएस, संस्करण 14) के महत्व के लिए α = 0.05 के साथ इस्तेमाल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: एमआई के बाद इनफार्ट क्षेत्र में परिवर्तन। एलवी ट्रांसवर्स दिशा नमूने प्रत्येक दिल में 1 सेमी मोटाई पर खंडित होते हैं जिसमें इनफार्टेड मायोकार्डियम होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: प्रत्यारोपण के बाद सेल अस्तित्व। प्रत्यारोपित एचआईपीएससी-एमएससी के एनग्रेफ्टमेंट का पता इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग फोरेंटी-ह्यूमन न्यूक्लियर एंटीजन (लाल रंग) से पता चला । स्केल बार = 100 माइक्रोन। तीर सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 7: निरंतर वेंट्रिकुलर टैचयारिथिमियास की घटनाएं। (A)वीवो इंट्राकार्डिएक प्रोग्राम्ड इलेक्ट्रिकल उत्तेजना में वेंट्रिकुलर टैचियाररिथिमियास (वीटी, लाल तीर) द्वारा प्रेरित। (ख)एमआई इंडक्शन के बाद वीटी की घटनाओं में काफी वृद्धि हुई । सेल प्रत्यारोपण से वीटी की घटनाएं नहीं बढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक चित्रा 1: इकोकार्डियोग्राम अधिग्रहण। बायां पैनल जानवर की स्थिति को दर्शाता है। सही पैनल जांच की स्थिति को दर्शाता है । मध्य पैनल इस स्थिति के तहत इकोकार्डियोग्राफिक छवि दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक चित्रा 2: जहाजों का स्थान। सूअरों को रीढ़ की स्थिति में रखा गया था। कैरोटिड धमनी और फेमोरल धमनी के लिए चीरों को लाल रेखा के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। जुगुलर नस और फीमोरल नस क्रमशः कैरोटिड धमनी और फीमोरल धमनी के नीचे थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
रोगों और परीक्षण उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के पथिक विज्ञान और तंत्र को समझने के लिए मानक पशु मॉडल सर्वोपरि महत्व के हैं। हमारा प्रोटोकॉल बाएं परिर्कफ्लेक्स धमनी रुकावट और तेजी से पेसिंग द्वारा प्रेरित एचएफ का एक पोर्सिन मॉडल स्थापित करता है। एमआई के शामिल होने के आठ सप्ताह बाद, जानवरों ने एलवीईएफ, एलवीईडी, एलवीईएसडी, + डीपी/डीटी और ईएसपीवीआर की महत्वपूर्ण हानि विकसित की । यह प्रोटोकॉल इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन द्वारा हृदय उत्थान के लिए स्टेम सेल थेरेपी की प्रशासन विधि का भी परीक्षण करता है। इनफार्क आकार, और कार्डियक सिस्टोलिक और डायस्टोलिक फ़ंक्शन का मूल्यांकन किया जाता है। यह अध्ययन स्टेम सेल उपचार के लिए एक स्थिर और प्रजनन योग्य पूर्व नैदानिक बड़े पशु एचएफ मॉडल स्थापित करने में मदद करता है, जो नैदानिक मामलों के समान है।
एलसीएक्स रुकावट और रैपिड पेसिंग का उपयोग हमारे पिछले अध्ययनों में एचएफ के पशु मॉडल बनाने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है7,8. पहली ऑक्टस सीमांत शाखा के लिए एलसीएक्स डिस्टल को ऑक्सलेड किया गया था, जिसके बाद 4 सप्ताह की रैपिड राइट वेंट्रिकुलर पेसिंग थी। मायोकार्डियम इस्केमिया के परिणामस्वरूप एमआई के दौरान कार्डियोमायोसाइट्स का नुकसान होता है, जो कार्डियक फाइब्रोसिस, मायोकार्डियल रिमॉडलिंग और कार्डियक अतालता का कारण बनता है। वेंट्रिकुलर पेसिंग के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण एलवी फैलाव, बाएं वेंट्रिकुलर संकुचन की गैर-बीमारी, और गंभीर एलवी डिसफंक्शन9,,10। इस्केमिया और रैपिड पेसिंग की लंबी अवधि ट्रांसलेशनल रिसर्च के लिए एक प्रगतिशील प्रयोगात्मक कम उत्पादन एचएफ मॉडल का उत्पादन करती है। पिछले अध्ययनों ने एमआई10को प्रेरित करके हार्ट फेलियर मॉडल स्थापित किए । हालांकि, गंभीर एमआई की मृत्यु दर अधिक थी और एमआई की एलवीईएफ कमी अस्थिर थी। इसलिए, हम कार्डियक फ़ंक्शन की महत्वपूर्ण हानि को प्रेरित करने के लिए एलसीएक्स रुकावट के बाद तेजी से सही वेंट्रिकुलर पेसिंग लागू करते हैं। जैसा कि हमारे पूर्व अध्ययनों में देखा जा सकता है, यहां प्रस्तुत मॉडल स्थिर इनफारेक्ट आकार देता है, और इस मॉडल का एलवीईएफ कम से कम 40% सामान्य6,,7, 8,से कम होजाताहै। अगर वहां कम संक्रमण और खून बह रहा था, हमारे मॉडल सफलता की दर ८०% के आसपास हो सकता था ।
स्टेम सेल के नैदानिक आवेदन करने के लिए प्रमुख बाधाओं में से एक उनके गरीब अस्तित्व और प्रत्यारोपण के बाद engraftment है । हाल ही में नैदानिक अध्ययन और मेटा-विश्लेषण11,12,,,13, 14,,,15 ऐसी चिकित्सा के बाद एलवी फ़ंक्शन या इनफारेक्ट आकार में कोई सुसंगत सुधार प्रदर्शित करने में विफल रहे हैं।14 संभावित कारणों में से एक प्रत्यारोपित कोशिकाओं की कम जीवित रहने की दर है । एक इष्टतम प्रशासन विधि की खोज स्टेम सेल चिकित्सा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । सेल प्रत्यारोपण के तीन तरीकों की तुलना करते हुए, इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन उच्च कोशिका प्रतिधारण16, 17,17के कारण नसों और अंतरसंरक्षित प्रशासन की तुलना में अधिक कुशल है। इसलिए, हमने इस अध्ययन में आईपीएससी-एमएससी डिलीवरी के लिए एक इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन मार्ग का चयन किया। इकोकार्डियोग्राफिक परिणामों और आक्रामक हेमोडायनामिक परिणामों ने दिखा दिया कि सेल प्रत्यारोपण के 8 सप्ताह बाद एमआई एचएफ सूअरों के आईपीएससी-एमएससी के इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन ने एलवी फ़ंक्शन को सुधारा। इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं (एक स्टेरॉयड और साइक्लोस्पोरिन) के प्रशासन के बावजूद, पेरी-इनफार्ट क्षेत्र में केवल कुछ प्रत्यारोपित कोशिकाओं का पता चला। इंजेक्शन स्थल के आसपास के क्षेत्र में कोई जीवित सेल का पता नहीं चला । पिछले अध्ययनों में 18 ,,19 , 20,,1921के प्रत्यारोपण के बाद इंफारेक्टेड मायोकार्डियम में स्टेम सेल का एक बहुत ही छोटा हिस्सा भी पाया गया है ।2021 इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन के दौरान सेल हानि प्रायोगिक परिणामों को प्रभावित कर सकती है। प्रशासन के तरीकों में सुधार कैसे किया जाए और निवास दर कैसे बढ़ाई जाए, यह भविष्य के अध्ययनों में स्पष्ट किया जाना चाहिए।
सुरक्षा, विशेष रूप से अतालता, सेल आधारित उपचारों के साथ नैदानिक अभ्यास के बारे में एक और महत्वपूर्ण चिंता का विषय है। हमारे हालिया अध्ययन से पता चला है कि मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचएसएससी) के इंट्रामायोकार्डियल प्रशासन ने सीएम को प्राप्त किया, जिससे सहज गैर-निरंतर वेंट्रिकुलर टैचिरिथिमियास4की घटनाओं में वृद्धि हुई । हमारे पोस्ट-एमआई एचएफ पोर्सिन मॉडल में, पेसमेकर से टेलीमेट्री मॉनिटरिंग द्वारा दर्ज सहज गैर-निरंतर वेंट्रिकुलर टैचिरीथमिया (दर और जीटी;180 बीपीएम और >12 बीट्स) की घटनाएं एमआई इंडक्शन के बाद 25% थीं, लेकिन निरंतर वीटी को आसानी से प्रेरित किया जा सकता है (८०%)। इस अध्ययन में, एचआईपीएससी-एमएससी प्रशासन के साथ या उसके बिना अचानक मौत की घटनाओं में कोई बदलाव नहीं किया गया है । इसके अलावा, हिप्ससी-एमएससी प्रत्यारोपण ने वेंट्रिकुलर अतालता के प्रति संवेदनशीलता को कम करने या बढ़ाने के लिए अंतर्निहित मायोकार्डियल सब्सट्रेट को संशोधित नहीं किया । इस परिणाम से पता चलता है कि बड़े पशु क्रोनिक एचएफ मॉडल सेल सुरक्षा मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
संक्रमण और नकसीर से बचना सफल पशु मॉडल प्रतिष्ठान के लिए सर्वोपरि महत्वपूर्ण है । रक्तस्राव के जोखिम को कम करने के लिए, कोरोनरी धमनियों और हृदय नसों को किसी भी नुकसान से बचने के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए। चूंकि दो जानवरों की गंभीर संक्रमण से मृत्यु हो गई थी, इसलिए एक उपयुक्त पश्चात चिकित्सा रणनीति को लाभ होगा। यहां, हम नीचे एक पश्चात चिकित्सा रणनीति प्रदान करते हैं: इंट्रामस्कुलरली एन्रोफ्लॉक्सासिन (7.5 मिलीग्राम/किलोग्राम, सिड) और buprenorphine (०.०२ मिलीग्राम/किलो, बोली) मौखिक रूप से प्रशासन Amoxycillin/Clavulanic एसिड (12.5 mg/kg, सिड) और Carprofen (2 मिलीग्राम/किलो, सिड) के साथ संयुक्त सर्जरी के बाद 1 सप्ताह के लिए सभी जानवरों के लिए संक्रमण को रोकने और दर्द से छुटकारा ।
संक्षेप में, वर्तमान विधि सेल आधारित उपचारों के लिए दिल की विफलता का एक स्थिर और प्रजनन योग्य चिकित्सकीय प्रासंगिक बड़े पशु मॉडल प्रदान करती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों ने अल्फ्रेडा और कुंग टाक चुंग को पशु प्रयोगों के दौरान उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiodarone | Mylan | - | - |
| Anaesthetic machines and respirator | Drager | Fabius plus XL | - |
| Angiocath | Becton Dickinson | 381147 | - |
| Anti-human nuclear antigen | abcam | ab19118 | - |
| Axio Plus image capturing system | Zeiss | Axioskop 2 PLUS | Axioskop 2 plus |
| AxioVision Rel. 4.5 software | Zeiss | - | - |
| Baytril | Bayer | - | enrofloxacin |
| Betadine | Mundipharma | - | - |
| CardioLab Electrophysiology Recording Systems | GE Healthcare | G220f | - |
| Culture media | MesenCult | 05420 | - |
| Cyclosporine | Novartis | - | - |
| Defibrillator | GE Healthcare | CardioServ | - |
| Dorminal | TEVA | - | - |
| Echocardiographic system | GE Vingmed | Vivid i | - |
| EchoPac software | GE Vingmed | - | - |
| Electrophysiological catheter | Cordis Corp | - | - |
| Embozene Microsphere | Boston Scientific | 17020-S1 | 700 μm |
| Endotracheal tube | Vet Care | VCPET70PCW | Size 7 |
| Ethanol | VWR chemicals | 20821.33 | - |
| Formalin | Sigma | HT501320 | 10% |
| IVC balloon Dilatation Catheter | Boston Scientific | 3917112041 | Mustang |
| JR4 guiding catheter | Cordis Corp | 67208200 | 6F |
| Lidocaine | Quala | - | - |
| Mersilk | Ethicon | W584 | 2-0 |
| Metoprolol succinate | Wockhardt | - | - |
| Microtome | Leica | RM2125RT | - |
| Mobile C arm fluoroscopy equipment | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | - |
| Pacemaker | St Jude Medical | PM1272 | Assurity MRI pacemaker |
| Pacemaker generator | St Jude Medical | Merlln model 3330 | - |
| Pressure-volume catheter | CD Leycom | CA-71103-PL | 7F |
| Pressure–volume signal processor | CD Leycom | SIGMA-M | - |
| Programmable Stimulator | Medtronic Inc | 5328 | - |
| PTCA Dilatation balloon Catheter | Boston Scientific | H7493919120250 | MAVERICK over the wire |
| Ramipril | TEVA | - | - |
| Sheath introducer | Cordis Corp | 504608X | 8F, 9F, 12F |
| Steroid | Versus Arthritis | - | - |
| Temgesic | Nindivior | - | buprenorphine |
| Venous indwelling needle | TERUMO | SR+OX2225C | 22G |
| Vicryl | Ethicon | VCP320H | 2-0 |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | - | - |
| Zoletil | Virbac New Zealand Limited | - | tiletamine+zolezepam |
References
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