Summary
Vi forsøkte å etablere en svinemodell av hjertesvikt indusert av venstre circumflex arterie blokkering og rask tempo for å teste effekten og sikkerheten ved intramyokarial administrasjon av stamceller for cellebaserte terapier.
Abstract
Selv om fremskritt er oppnådd ved behandling av hjertesvikt (HF) etter hjerteinfarkt (MI), er HF etter MI fortsatt en av de viktigste årsakene til dødelighet og sykelighet rundt om i verden. Cellebaserte behandlinger for hjertereparasjon og forbedring av venstre ventrikulær funksjon etter mi har tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet. Dersom sikkerheten og effekten av disse celletransplantasjonene skal testes i en preklinisk stor dyremodell av HF før klinisk bruk. Griser er mye brukt for kardiovaskulær sykdom forskning på grunn av deres likhet med mennesker i form av hjertestørrelse og koronar anatomi. Derfor forsøkte vi å presentere en effektiv protokoll for etablering av en svin kronisk HF-modell ved hjelp av lukket-brystet koronar ballong okklusjon av venstre circumflex arterie (LCX), etterfulgt av rask ventrikulær pacing indusert med pacemaker implantasjon. Åtte uker senere ble stamcellene administrert ved intramyokarial injeksjon i peri-infarktområdet. Deretter ble infarktstørrelse, celleoverlevelse og venstre ventrikulær funksjon (inkludert ekkokardiografi, hemodynamiske parametere og elektrofysiologi) evaluert. Denne studien bidrar til å etablere en stabil preklinisk stor dyr HF modell for stamcellebehandling.
Introduction
Kardiovaskulære sykdommer, koronarsykdom (CAD) spesielt, forblir den viktigste årsaken til sykelighet og dødelighet i Hong Kong og over heleverden 1. I Hong Kong, en 26% økning fra 2012 til 2017 av antall CAD-pasienter behandlet under Hospital Authority ble anslått2. Blant alle CADer er akutt hjerteinfarkt (MI) en ledende dødsårsak og påfølgende komplikasjoner, som hjertesvikt (HF). Disse bidrar til betydelige medisinske, sosiale og økonomiske byrder. Hos pasienter med MI er trombolytisk behandling eller primær perkutan koronarintervensjon (PCI) en effektiv terapi for å bevare livet, men disse behandlingene kan bare redusere kardiomyocytttap (CM) under MI. Behandlingene som er tilgjengelige, kan ikke fylle opp det permanente tapet av CMs, noe som fører til hjertefibrose, hjerteinfarkt, hjertearytmi og til slutt hjertesvikt. Dødeligheten ved 1-års post-MI er rundt 7% med mer enn 20% pasienter som utvikler HF3. I sluttfasen HF pasienter, hjertetransplantasjon er den eneste tilgjengelige effektiv terapi, men det er begrenset av mangel på tilgjengelige organer. Nye terapier er nødvendig for å reversere utviklingen av post-MI HF. Som et resultat anses cellebasert terapi som en attraktiv tilnærming til å reparere de svekkede CMs og forbedre venstre ventrikulær (LV) funksjon i HF etter MI. Våre tidligere studier fant stamcelletransplantasjon å være gunstig for hjertefunksjon forbedring etter direkte intramyokarial transplantasjon i små dyremodeller av MI4,5. Standardiserte prekliniske store dyr HF-protokoller er dermed nødvendig for å ytterligere teste effekten og sikkerheten av stamcelletransplantasjon før klinisk bruk.
De siste tiårene har vært vitne til den utbredte bruken av griser i kardiovaskulær forskning for stamcellebehandling. HF griser er en lovende modell for translasjonell forskning på grunn av deres likhet med mennesker i form av hjertestørrelse, vekt, rytme, funksjon, og koronar anatomi. Videre kan svin HF-modeller etterligne post-MI HF-pasienter når det gjelder CM-metabolisme, elektrofysiologiske egenskaper og nevroendokrine endringer under iskemiske forhold6. Protokollen som presenteres her bruker en slik standardisert gris HF modell, ansette en lukket-brystet koronar ballong okklusjon av venstre circumflex arterie (LCX) etterfulgt av rask pacing indusert av pacemaker implantasjon. Studien optimaliserer også ruten for intramyokarial administrasjon av stamceller for behandling av post-MI HF. Formålet er å produsere en svinedyrmodell av kronisk hjerteinfarkt som kan brukes til å utvikle behandlinger som er klinisk relevante for pasienter med alvorlig CAD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Guide for care and use of Laboratory Animals utgitt av US National Institutes of Health og forskrifter ved University of Hong Kong, og protokollen ble godkjent av komiteen for bruk av levende dyr i undervisning og forskning (CULTAR) ved University of Hong Kong.
MERK: Hunngårdgriser som veier 35-40 kg (9-12 måneder gamle) ble brukt til denne studien. Flytskjemaet for dette eksperimentet er vist i figur 1.
1. Kirurgiske prosedyrer
- Anestesi og fremstilling av dyret
- Rask dyrene i 12 timer og underlagt vannmangel i 4 timer før forsøket.
- Bedøve grisene gjennom en intramuskulær injeksjon av tiletamin+zolezepam (2-7 mg/kg) og xylazin (0,5-1 mg/kg) tilberedt i 20 ml normal saltvann. Overvåk dyrets palpebrale reflekser til de er fraværende.
- Fjern grisens hår og steriliser huden i nakken og lysken for seksjoner 1.3-1.5. Desinfiser operasjonsområdet 3x med 70% etanol og betadin.
- Plasser et 7 mm endotrakealrør i svinetrachea og plasser en 22 G venøs innoppussingsnål i øret vena.
- Flytt grisen på operasjonsbordet og plasser i liggende stilling. Koble endotrakealrøret til åndedrettsvernet og ventiler (inspiratorisk/ekspiratorisk tidsforhold 1:2) dyret med isofluran (1,5 %-2,0 % innånding) og oksygen (0,5-1,5 l/min innånding).
- Overvåk overflaten elektrokardiogram og blodtrykk, og kontinuerlig overvåke hjertefrekvens, hjerterytme, og arteriell blodtrykk via elektrofysiologi opptakssystemer.
- Ekkokardiografi
- Flytt grisen til venstre lateral decubitus posisjon og fest på bordet.
- Sett sonden på perikardområdet og utfør seriell ekkokardiografi, inkludert 2D- og M-modusavbildning, ved hjelp av et høyoppløselig ekkokardiografisk system og en 3-9 MHz transduser ved baseline, før celletransplantasjon og 8 uker etter celletransplantasjon (Supplerende figur 1).
- Analyser alle de oppnådde bildene ved hjelp av kommersiell programvare. Beregn LV end-diastolisk dimensjon (LVEDD), LV end-systolisk dimensjon (LVESD), LV end-diastolisk volum (LVEDV), LV end-systolisk volum (LVESV), LV utstøting brøk (LVEF), og veggtykkelse etter standard ekkokardigrafiske bilder er hentet fra parasternal langakse visning.
MERK: Alle off-line analyser ble utført av en annen uavhengig operatør ved hjelp av en datamaskin arbeidsstasjon. Variasjonen av målingene mellom ulike observatører var 4% basert på 20 gjentatte tilfeldige bilder. Alle ekkokardigrafiske målinger ble utført i samsvar med American Society of Echocardiography anbefalinger.
- Pacemaker implantasjon
- Flytt grisen til liggende stilling og fest grisens lemmer på bordet med stropper.
- Finn riktig halspulsåren og halsvenen i halskantanten (bak sternocleidomastoid og omgitt av stylohyoid, digastric muskelen, og omohyoid) og isolere riktig halspulsåren og halsvenen med hemostatiske tang under sterile forhold (Supplerende figur 2). Ligate den distale enden av høyre halspulsåren og halsvenen. Sy de to musklene med 2-0 Vicryl.
- Kanylere høyre halsvene med angiokath og sett inn en pacemaker føre til høyre ventrikkel under røntgenveiledning (figur 2).
- Isoler sternocleidomastoid og fremre scalene muskel ved hjelp av tang. Implanter en pacemaker mellom de to musklene og sy de to musklene med 2-0 silke. Koble pacemakeren til ledningen.
- Omprogrammer pacemakeren til backup VVI-modus (35 bpm) av en pacemakergenerator etter transplantasjonen.
- Påfør rask ventrikulær tempo (150 slag / min) for å indusere HF av en pacemaker generator 4 uker etter MI induksjon. Sett deretter pacemakeren tilbake til backup VVI-modus etter 8 uker.
- Analyse av invasiv trykkvolumsløyfe
MERK: Utfør invasiv hemoodynamisk vurdering ved baseline, før celletransplantasjon og 8 uker etter celletransplantasjon for å vurdere endringer i LV-funksjonen.- Isoler høyre lårarterie og lårvene i lårtrekanten (omgitt av inngangsledd, sartoriusmuskel og adductor longus muskel) (Supplerende figur 2).
- Kanylere høyre lårarterie med angiokath og plasser en ledetråd i arterien via angiocath. Fjern angiocath og kanyyler en 9F hylse inn i arterien under veiledning av ledetråden. Fjern ledetråden.
- Kanyler høyre lårvene med en 12F-hylse som beskrevet i trinn 1.4.2. Sett inn et ballongkateter fra den plasserte 12F-hylsen i den dårligere vena cava (IVC) under røntgenveiledning.
- Kalibrer et 7 Fr trykkvolum (PV) kateter i isotonisk saltvann med en PV-signalprosessor.
- Sett PV-kateteret inn i LV-toppunktet fra den plasserte 9F-hylsen under røntgenveiledning. Suspender ventilasjonen og mål venstre ventrikulært positivt trykkderivat (+dP/dt), end-systolisk trykk (ESP) og endediastolisk trykk (EDP) med PV-signalprosessoren.
- Mål slutten systolisk trykkvolumrelasjon (ESPVR) av PV-signalprosessoren under okklusjon av IVC.
- Start ventilasjonen på nytt når prosedyren er ferdig.
- Induksjon av MI
- Intravenøst administrer amiodaron (5 mg/kg intravenøst over 1 time) og lidokain (1,5 mg/kg intravenøs bolus) til dyret før induksjon av MI for å forhindre ventrikulære arytmier.
- Kanylere riktig halspulsåren med en 8F-hylse som nevnt i trinn 1.4.3.
- Utfør koronar angiografi gjennom en 6F JR4 over-the-wire guiding kateter via den plasserte hylsen guidet av standard C arm fluoroskopi utstyr.
- Okkluder venstre circumflex koronararterie (LCX) distale til den første stumpe marginale grenen med perkutan transluminal koronar angioplastikk (PTCA) dilatasjon ballong kateter inflasjon under røntgenveiledning (figur 2).
- Injiser 1 ml 700 μm svampmikrosfærer blandet med 3 ml saltvann tilberedt i en 10 ml sprøyte gjennom ballongkateteret for å blokkere LCX, og tøm deretter ballongen og utfør et angiogram for å bekrefte okklusjonen.
- Gjenta injeksjonsprosedyren for å oppnå vellykket fullstendig blokkering.
- Overvåk dyrets hjertefrekvens og rytme for å oppdage hjertearytmier. Hvis ventrikulær fibrillering skjedde, bruk en ekstern, bifasisk defibrillator for å gjenopprette en sinusrytme ved hjelp av 150-300 J-sjokk.
- Injeksjon av stamceller
- Tilordne tilfeldig alle dyrene med bemerkelsesverdig svekkelse av hjertefunksjonen (LVEF < 40% ved 8 uker etter induksjon av MI) til to forskjellige grupper: en som vil motta intramyokarial administrasjon av 2 x 108 menneskeinduserte pluripotente stamcelleavledede mesenchymale stamceller (hiPSC-MSCer), og den andre som ikke vil motta hiPSC-MSCer.
- Forbered hiPSC-MSC-ene i 2 ml normal saltvann for intramyokarial transplantasjon. Før intramyokarial hiPSC-MSCs transplantasjon, gjenta anestesi og dyr forberedelse trinn nevnt i pkt 1.1, denne gangen sterilisere 10 cm rundt toppunktet beat området. Utfør venstre thoracotomi på 4-5 interkostalrom med en retractor. Utfør pericardiotomy for å eksponere den infarktede sideveggen.
MERK: Snittets lengde var 10-12 cm. - Bruk 5-8 intramyokariske injeksjoner (~0,3 ml per injeksjon) rundt det ufarcted området for å administrere kulturmedium (Table of Materials) til en gruppe dyr eller 2 x 108 hiPSC-MSCer til den andre gruppen (figur 3). Unngå nøye skade på koronararterier for å redusere risikoen for blødning.
- Lukk interkostalrom med jerntråd og lukk muskellaget med 2-0 silke. Sy det subkutane vevet og huden med 2-0 vicryl.
- Intracardiac programmert elektrisk stimulering
- Utfør programmert elektrisk stimulering ved hjelp av en programmerbar stimulator for å vurdere indukbiliteten av ventrikulær takykarytmi (VT) etter celletransplantasjonsbehandlingen.
- Sett inn et 6F elektrofysiologisk kateter i høyre ventrikulær apex via lårvenen før du ofrer alle dyrene.
- Vis intracardiac-opptakene med overflateelektrokardiogramledningene I, II og III på det elektrofysiologiske opptakssystemet med en hastighet på 200 mm/s. Lever en 2 ms pulsbredde ved 2x diastolisk terskel ved hjelp av en stimulator.
- Lever et pacing tog på åtte stimuli (S1) på to drivsykluslengder (200 ms og 300 ms), etterfulgt av en (S2) eller to (S2 og S3) for tidlig ekstra stimuli.
- Forkorte koblingsintervallene sekvensielt til en ventrikulær effektiv refraktær periode eller arytmi induseres. Legg merke til tilstedeværelsen av induserbar vedvarende VT (> 10 s).
2. Postoperativ protokoll
- Postoperativ medisin
- Utfør konvensjonelle farmakologiske behandlinger for HF. Kort sagt, oralt administrere metoprolol succinate (25 mg) og ramipril (2,5 mg) til alle dyr daglig.
- Intramuskulært administrere enrofloksacin (5 mg/kg) og buprenorfin (0,01 mg/kg) til alle dyr daglig i 1 uke etter operasjonen for å forebygge infeksjon og lindre smerte.
- For å minimere immunologisk avvisning, oralt administrere et steroid (40 mg/dag muntlig) og ciklosporin (200 mg/dag muntlig) til alle dyr fra 3 dager før celletransplantasjon til 8 uker etter.
- Vurdering av infarktstørrelse
- Euthanize dyrene ved en overdose av dorminal (pentobarbital natrium, 100 mg / kg, IV) på slutten av forsøket.
- Åpne brystet og samle hjertet. Skyll hjertet i 0,9% saltvann.
- Serielt seksjon LV vevsprøver med en skalpell på 1 cm tykkelser i LV tverrgående retning.
- Velg deler av skivene som inneholder det infarktede myokardiet for å måle veggtykkelsen og det ufarctområdet.
- Ta bildet av disse skivene og kvantitativt analysere veggtykkelsen og det infarktområdet ved hjelp av kommersiell bildeanalyseprogramvare.
- Fest vevet i 10% formalin ved 4 °C i en måned. Bygg inn vevet i, tilstøtende og fjerntliggende til de infarktstedene (~ 1 cm2 stykker) i parafin. Seksjon i 5 μm skiver ved hjelp av en mikrotom for histologisk undersøkelse.
- Celle overlevelse
- Oppdag engraftmentet av de transplanterte cellene ved immunohistokjemisk farging med anti-humant kjernefysisk antigen (HNA) i henhold til protokollen fra produsenten.
- Ta bildet i tre forskjellige seksjoner på fem tilfeldige felt i hvert dyr og kvantitativt analysere de positive cellene i peri-infarktsonen.
MERK: Bildeopptakssystemet og bildeanalyseprogramvaren ble brukt til å fange og analysere bildene av hjertedelene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dødelighet
Totalt 24 griser ble brukt i denne studien. Tre av dem døde under MI induksjon på grunn av vedvarende VT. Ett dyr døde i åpen hjertekirurgi for celleinjeksjon på grunn av sårblødning. To dyr døde på grunn av alvorlig infeksjon. To dyr ble ekskludert på grunn av svak EF-reduksjon (LVEF-reduksjon > 40 % av baseline). Som et resultat fullførte 16 dyr hele studieprotokollen.
Hjertefunksjon og ombygging
Seriell ekkokardiografisk undersøkelse viste at LVEF signifikant gikk ned fra 68,23 ± 3,52 % ved baseline til 39,37 ± 3,22 %. LVEDD økte betydelig fra 3,6 ± 0,5 til 4,8 ± 0,4 og LVESD signifikant økt fra 2,5 ± 0,3 til 3,9 ± 0,4 (figur 4A) ved 8 uker etter induksjon av MI. LVEF og LVESD forbedret seg signifikant til henholdsvis 52,9 ± 4,27 % og 3,3 ± 0,3 i hiPSC-MSC-gruppen 8 uker etter transplantasjonen, sammenlignet med MI-statusen (figur 4A).
+dP/dt og ESPVR ble signifikant redusert fra 1325 ± 63 mmHg/s og 3,9 ± 0,4 ved baseline til 978 ± 45 mmHg/s og 1,8 ± 0,2 ved 8 uker etter induksjon av MI. Intramyokarial administrasjon av hiPSC-MSCer økte +dP/dt og ESPVR til 1 127,4 ± 50 mmHg/s og 2,6 ± 0,3 ved 8 uker etter transplantasjon av iPSC-MSCer, sammenlignet med MI-statusen (figur 4B).
Infarkt veggtykkelse
Den gjennomsnittlige LV infarkt veggtykkelsen ble målt fra 5-7 seriell 1 cm tykkelse seksjonsprøver i hvert dyr (figur 5). Andelen LV-infarkt var 16 ± 2 %.
Celleoverlevelse etter transplantasjonen
Det var ingen celleoverlevelse rundt injeksjonsstedet i infarktområdet 8 uker etter transplantasjonen, men et lite antall overlevelses-hiPSC-msCer var synlige i peri-infarktområdet (figur 6).
Induserbar ventrikulær arytmi
Forekomsten av indusible vedvarende ventrikulære takykarytmier kan lett økes hos dyr med HF (10 % ved baseline vs. 75 % 8 uker etter induksjon av MI). HiPSC-MSCs transplantasjon endrer ikke signifikant det underliggende myokardsubstratet for å redusere mottakeligheten for VT (62,5 % i hiPSC-MSCer gruppe 8 uker etter intramyokarial administrasjon av hiPSC-MSCer, figur 7).
Figur 1: Flytskjema for eksperimentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Svinemodell av hjerteinfarkt. Svinemodellen av hjerteinfarkt (MI) ble indusert ved embolisering av venstre circumflex koronararterie (LCX, rød pil) distal til den første stumpe marginale grenen. Denne koronararterien ble okkludert med ballonginflasjon og en injeksjon på 700 μm mikrosfærer. Koronar angiografi ved pre-MI, ballonginflasjon og post-MI ble utført gjennom et 6F JR4-styrekateter via riktig halspulsåren. Pacemakerledningen ble satt inn i høyre ventrikkelvegg (blå pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Celletransplantasjon i en svinemodell av MI. Celleinjeksjonssteder ved sideveggen rundt det infarktområdet på venstre ventrikkel under venstre thoracotomi. Den blå pilen viser peri-infarktområdet, og den røde pilen viser det infarktområdet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hjertefunksjonen endres etter MI. (A)Et ekkokardiogrambilde i LV M-modus ved baseline, MI og celletransplantasjon. LVEF, LVEDD, LVESD gikk signifikant ned 8 uker etter MI-induksjon og økte signifikant i hiPSC-MSC-gruppen 8 uker etter celletransplantasjon. (B) For å vurdere grisenes hjertefunksjon med hjertesvikt, ble +dP/dt-verdien og ESPVR målt med en PV-signalprosessor. Den dårligere vena cava (IVC) ble okkludert av ballonginflasjon (blå pil) under ESPVR-vurderingen. Både +dP/dt og ESPVR ble signifikant redusert etter MI-induksjon, og økte deretter signifikant i hiPSC-MSC-gruppene 8 uker etter transplantasjonen. ANOVA etterfulgt av Student-Newman-Keuls post hoc testing (SPSS, versjon 14) ble brukt med α = 0,05 for betydning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Infarct området endres etter MI. LV tverrgående retningsprøver seksjonert ved 1 cm tykkelser i hvert hjerte som inneholder infarkt myokardi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Celleoverlevelse etter transplantasjonen. Engraftmentet av de transplanterte hiPSC-MSC-parlamentsmedlemmene ble oppdaget ved immunohistokjemisk farging foranti-humant kjernefysisk antigen (rød farge). Vektstangen = 100 μm. Piler representerer positive celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Forekomsten av vedvarende ventrikulære takyarytmier. (A)Ventrikulære takyarytmier (VT, rød pil) indusert av in vivo intracardiac programmert elektrisk stimulering. (B)Forekomsten av VT økte signifikant etter MI induksjon. Celletransplantasjon økte ikke forekomsten av VT. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstall 1: Oppkjøp av ekkokardiogram. Det venstre panelet viser dyrets posisjon. Det høyre panelet viser probeposisjonen. Det midterste panelet viser ekkokardiografisk bilde under denne posisjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstall 2: Plassering av fartøy. Griser ble plassert i liggende stilling. Snitt for halspulsåren og lårarterien presenteres som en rød linje. Halsvenen og lårvenen var under henholdsvis halspulsåren og lårarterien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standard dyremodeller er av avgjørende betydning for å forstå patofysiologien og mekanismene for sykdommer og teste nye terapeutiske midler. Vår protokoll etablerer en svin modell av HF indusert av venstre circumflex arterie blokkering og rask tempo. Åtte uker etter induksjon av MI utviklet dyrene betydelig svekkelse av LVEF, LVEDD, LVESD, +dP/dt og ESPVR. Denne protokollen tester også administrasjonsmetoden for stamcellebehandling for hjerteregenerering ved intramyokarial injeksjon. Den infarktstørrelse, og hjerte systolisk og diastolisk funksjon evalueres. Denne studien bidrar til å etablere en stabil og reproduserbar preklinisk stor dyr HF modell for stamcellebehandling, som ligner på kliniske tilfeller.
LCX blokkering og rask tempo har blitt brukt mye for å lage dyremodeller av HF i våre tidligere studier7,,8. LCX distal til den første stumpe marginale grenen ble okkludert, etterfulgt av 4 uker med rask høyre ventrikulær tempo. Myokardium iskemi resulterer i tap av kardiomyocytter under MI, noe som forårsaker hjertefibrose, hjerteinfarkt remodeling, og hjertearytmi. Ventrikulær tempo resulterer i betydelig LV-utvidelse, ikke-ischemisk svekkelse av venstre ventrikulær kontraktilitet og alvorlig LV dysfunksjon9,10. Lengre varighet av iskemi og rask tempo produsere en progressiv eksperimentell lav-output HF modell for translasjonell forskning. Tidligere studier etablerte hjertesviktmodeller ved å indusere MI10. Imidlertid var dødeligheten av alvorlig MI høyere og LVEF-reduksjonen av MI var ustabil. Derfor bruker vi rask høyre ventrikulær tempo etter LCX blokkering for å indusere betydelig svekkelse av hjertefunksjonen. Som det frem ser i våre tidligere studier, gir modellen som presenteres her stabil infarktstørrelse, og LVEF av denne modellen reduseres til minst under 40% normal6,,7,,8. Hadde det vært færre infeksjoner og blødninger, kunne vår modell suksessrate ha vært rundt 80%.
En av de store hindringene for klinisk anvendelse av stamceller er deres dårlige overlevelse og engraftment etter transplantasjon. Nyere kliniske studier og metaanalyse11,12,13,,14,,15 har ikke vist noen konsekvent forbedring i LV-funksjon eller infarktstørrelse etter slik behandling. En av de potensielle årsakene er den lave overlevelsesraten av transplanterte celler. Å oppdage en optimal administrasjonsmetode spiller en avgjørende rolle i stamcellebehandling. Sammenligning av de tre metodene for celletransplantasjon, intramyokarial administrasjon er mer effektiv enn intravenøs og intrakoronær administrasjon på grunn av høyere celleretensjon16,,17. Derfor valgte vi en intramyokarial administrasjonsrute for iPSC-MSCer levering i denne studien. Ekkokardigrafiske resultater og invasive hemodynamiske resultater viste at intramyokarial administrasjon av iPSC-MSCer forbedret LV-funksjonen til post-MI HF-griser 8 uker etter celletransplantasjon. Til tross for administrering av immunsuppressive legemidler (et steroid og ciklosporin), ble bare noen få transplanterte celler oppdaget i peri-infarktområdet. Ingen overlevende celle ble oppdaget i det ufarcted området rundt injisert området. Tidligere studier har også funnet en ekstremt liten del av stamceller i det infarcted myokardiet ettertransplantasjon 18,19,20,21. Celletap under intramyokarial administrasjon kan påvirke de eksperimentelle resultatene. Hvordan forbedre administrasjonsmetodene og øke oppholdssatsen bør avklares i fremtidige studier.
Sikkerhet, spesielt arytmogenese, er en annen viktig bekymring angående klinisk praksis med cellebaserte terapier. Vår nylige studie viste at intramyokarial administrering av human embryostamcelle (hESC) avledet CMs økte forekomsten av spontane ikke-vedvarende ventrikulære takyarytmier4. I vår post-MI HF svinemodell var forekomsten av spontan ikke-vedvarende ventrikulær takyarytmi (hastighet > 180 bpm og > 12 slag) registrert ved telemetriovervåking fra pacemakeren 25% etter MI-induksjon, men vedvarende VT kunne lett induseres (80%). I denne studien forblir forekomsten av plutselig død uendret med eller uten administrering av hiPSC-MSCer. Videre endret hiPSC-MSCs transplantasjon ikke det underliggende myokardsubstratet for å redusere eller øke følsomheten for ventrikulære arytmier. Dette resultatet tyder på at den store dyre kroniske HF-modellen kan brukes til cellesikkerhetsvurdering.
Unngåelse av infeksjon og blødning er av avgjørende betydning for vellykket dyremodell etablering. For å redusere risikoen for blødning, bør det tas hensyn til for å unngå skade på koronararterier og hjerteårer. Som to dyr døde av alvorlig infeksjon, en passende postoperativ medisinsk strategi vil være til nytte. Her gir vi en postoperativ medisinsk strategi som nedenfor: Intramuskulært administrering av enrofloksacin (7,5 mg/kg, SID) og buprenorfin (0,02 mg/kg, BUD) kombinert med oralt administrer amoksycillin/klavulansyre (12,5mg/kg, SID) og Carprofen (2 mg/kg, SID) til alle dyr i 1 uke etter operasjonen for å forhindre infeksjon og lindre smerte.
Oppsummert gir den nåværende metoden en stabil og reproduserbar klinisk relevant stor dyremodell av hjertesvikt for cellebaserte terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Alfreda og Kung Tak Chung for deres utmerkede tekniske støtte under dyreforsøkene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiodarone | Mylan | - | - |
| Anaesthetic machines and respirator | Drager | Fabius plus XL | - |
| Angiocath | Becton Dickinson | 381147 | - |
| Anti-human nuclear antigen | abcam | ab19118 | - |
| Axio Plus image capturing system | Zeiss | Axioskop 2 PLUS | Axioskop 2 plus |
| AxioVision Rel. 4.5 software | Zeiss | - | - |
| Baytril | Bayer | - | enrofloxacin |
| Betadine | Mundipharma | - | - |
| CardioLab Electrophysiology Recording Systems | GE Healthcare | G220f | - |
| Culture media | MesenCult | 05420 | - |
| Cyclosporine | Novartis | - | - |
| Defibrillator | GE Healthcare | CardioServ | - |
| Dorminal | TEVA | - | - |
| Echocardiographic system | GE Vingmed | Vivid i | - |
| EchoPac software | GE Vingmed | - | - |
| Electrophysiological catheter | Cordis Corp | - | - |
| Embozene Microsphere | Boston Scientific | 17020-S1 | 700 μm |
| Endotracheal tube | Vet Care | VCPET70PCW | Size 7 |
| Ethanol | VWR chemicals | 20821.33 | - |
| Formalin | Sigma | HT501320 | 10% |
| IVC balloon Dilatation Catheter | Boston Scientific | 3917112041 | Mustang |
| JR4 guiding catheter | Cordis Corp | 67208200 | 6F |
| Lidocaine | Quala | - | - |
| Mersilk | Ethicon | W584 | 2-0 |
| Metoprolol succinate | Wockhardt | - | - |
| Microtome | Leica | RM2125RT | - |
| Mobile C arm fluoroscopy equipment | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | - |
| Pacemaker | St Jude Medical | PM1272 | Assurity MRI pacemaker |
| Pacemaker generator | St Jude Medical | Merlln model 3330 | - |
| Pressure-volume catheter | CD Leycom | CA-71103-PL | 7F |
| Pressure–volume signal processor | CD Leycom | SIGMA-M | - |
| Programmable Stimulator | Medtronic Inc | 5328 | - |
| PTCA Dilatation balloon Catheter | Boston Scientific | H7493919120250 | MAVERICK over the wire |
| Ramipril | TEVA | - | - |
| Sheath introducer | Cordis Corp | 504608X | 8F, 9F, 12F |
| Steroid | Versus Arthritis | - | - |
| Temgesic | Nindivior | - | buprenorphine |
| Venous indwelling needle | TERUMO | SR+OX2225C | 22G |
| Vicryl | Ethicon | VCP320H | 2-0 |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | - | - |
| Zoletil | Virbac New Zealand Limited | - | tiletamine+zolezepam |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131, e29 (2015).
- Hospital Authority. Hospital Authority Statistical Report 2013. , Hong Kong. (2013).
- Cung, T. T., et al. Cyclosporine before PCI in Patients with Acute Myocardial Infarction. The New England Journal of Medicine. 373 (11), 1021-1031 (2015).
- Liao, S. Y., et al. Proarrhythmic risk of embryonic stem cell-derived cardiomyocyte transplantation in infarcted myocardium. Heart Rhythm. 7, 1852-1859 (2010).
- Liao, S. Y., et al. Overexpression of Kir2.1 channel in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes attenuates posttransplantation proarrhythmic risk in myocardial infarction. Heart Rhythm. 10, 273-282 (2013).
- Liu, Y., et al. Thoracic spinal cord stimulation improves cardiac contractile function and myocardial oxygen consumption in a porcine model of ischemic heart failure. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 23, 534-540 (2012).
- Liao, S. Y., et al. Improvement of Myocardial Function Following Catheter-Based Renal Denervation in Heart Failure. JACC: Basic to Translational Science. 2 (3), 270-281 (2017).
- Liao, S. Y., et al. Remodelling of cardiac sympathetic re-innervation with thoracic spinal cord stimulation improves left ventricular function in a porcine model of heart failure. Europace. 17 (12), 1875-1883 (2015).
- Daehnert, I., Rotzsch, C., Wiener, M., Schneider, P. Rapid right ventricular pacing is an alternative to adenosine in catheter interventional procedures for congenital heart disease. Heart. 90 (9), 1047-1050 (2004).
- Hála, P., et al. Tachycardia-Induced Cardiomyopathy as a Chronic Heart Failure Model in Swine. Journal of Visualized Experiments. (132), e57030 (2018).
- Santoso, T., et al. Endomyocardial implantation of autologous bone marrow mononuclear cells in advanced ischemic heart failure: a randomized placebo-controlled trial (END-HF). Journal of Cardiovascular Translational Research. 7, 545-552 (2014).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network. Effect of intracoronary delivery of autologous bone marrow mononuclear cells 2 to 3 weeks following acute myocardial infarction on left ventricular function: the LateTIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 306, 2110-2119 (2011).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network (CCTRN). Effect of the use and timing of bone marrow mononuclear cell delivery on left ventricular function after acute myocardial infarction: the TIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 308, 2380-2389 (2012).
- de Jong, R., Houtgraaf, J. H., Samiei, S., Boersma, E., Duckers, H. J. Intracoronary stem cell infusion after myocardial infarction. A meta-analysis and update on clinical trials. Circulation: Cardiovascular Interventions. 7, 156-167 (2014).
- Nowbar, A. N., et al. DAMASCENE writing group. Discrepancies in autologous bone marrow stem cell trials and enhancement of ejection fraction (DAMASCENE): weighted regression and meta-analysis. British Medical Journal. 348, g2688 (2014).
- Kanelidis, A. J., Premer, C., Lopez, J., Balkan, W., Hare, J. M. Route of Delivery Modulates the Efficacy of Mesenchymal Stem Cell Therapy for Myocardial Infarction: A Meta-Analysis of Preclinical Studies and Clinical Trials. Circulation Research. 120 (7), 1139-1150 (2017).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112 (9 Suppl), I150-I156 (2005).
- Hu, X., et al. A Large-Scale Investigation of Hypoxia-Preconditioned Allogeneic Mesenchymal Stem Cells for Myocardial Repair in Nonhuman Primates: Paracrine Activity Without Remuscularization. Circulation Research. 118, 970-983 (2016).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Martens, A., et al. Substantial early loss of induced pluripotent stem cells following transplantation in myocardial infarction. Artificial Organs. 38, 978-984 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
