Summary
该协议提供了一种快速可靠的方法，用流动细胞测定人类原发性噬菌体定量测量阿苯甲基的邻苯二甲苯，并区分锥体从单纯的粘附到白细胞的邻形图。
Abstract
霉菌阿斯珀吉鲁斯熏蒸菌的侵入性肺感染对免疫功能低下的患者构成巨大威胁。吸入真菌锥体（孢子）通过先天单核细胞和/或中性粒细胞的噬菌体从人类肺肺泡。该协议提供了一种快速、可靠的测量方细胞化，使用氟素等氰酸酯 （FITC） 标记的锥体与人类白细胞共同孵育，随后与抗 FITC 抗体进行反染色，以便对内化和细胞粘附锥体进行鉴别。该协议的主要优点是其快速性，将测定与其他感兴趣的细胞标记的细胞学分析相结合的可能性，同时分析单个样本中的单核细胞和嗜中性粒细胞，以及其对其他细胞壁携带真菌或细菌的适用性。测定方位白细胞的百分比，为微生物学家评估病原体的毒性或比较病原体的野生型和突变体提供了手段，也为免疫学家提供了研究人类白细胞对抗病原体的能力的手段。
Introduction
侵入性肺动脉粥样硬化对免疫功能低下患者是一个很大的威胁，因为治疗方案有限，只有在早期诊断成功，导致高死亡率1。传染性病原体是阿塞珀吉鲁斯熏蒸剂的锥度（孢子），在大多数栖息地无处不在2。Conidia 被吸入，通过气道，最后可以进入肺肺泡。在免疫能力人类中，这些锥体由先天免疫细胞清除，如单核细胞或巨噬细胞和嗜中性粒细胞，它们吸收（噬菌体）并消化病原体3。当对宿主-病原体相互作用感兴趣时，噬菌体病对微生物学家和免疫学家也很重要。对抗测定，如白细胞和锥体的共同孵育，通常包括用荧光素或其衍生的荧光素等子素（FITC）标记孢子。使用显微镜，它很容易识别内化荧光锥体，并确定附加/粘附锥体，虽然这种方法是繁琐和现实地限于几百个细胞4。然而，在流式细胞学中，很容易在几分钟内分析数十万个细胞，对方位细胞和粘附性锥体的不同染色至关重要。因此，许多协议依靠Trypan Blue来淬火FITC荧光从粘附锥体5，6，7，8。另一种方法是利用溴化和FITC的荧光共振能量转移，从粘附的锥度9，10，11发射红色，而不是绿色荧光。如果有特定的抗体可用，就像某些细菌一样，细胞结合的颗粒可以直接染色12，13。
在这里，我们提出一个协议，通过采用异位素青霉素（APC）耦合抗FITC抗体，快速定量地评估带有PCC标签的人类白细胞的芬加菌锥体，以及孢子附着在细胞上和缺乏相互作用。该方法还允许同时对来自同一样品的单核细胞和嗜中性粒细胞的食细胞化进行进一步细胞标记的流动细胞学分析。
该协议可应用于真菌菌株的表征（例如，这里介绍的Mucorales属的几种Aspergillus和其他霉菌）及其突变体14和对噬菌体（如免疫功能低下个体的白细胞）的免疫学研究。
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Protocol
该协议包括使用从输血医学研究所、耶拿大学医院获得的人类牛皮大衣和从患者身上抽取的新鲜静脉血，均需经献血者书面知情同意，符合伦理委员会批准书4357-03/15。
1.阿斯珀吉鲁斯熏蒸菌的制备
- 在37°C下，在37°C下种植A.熏蒸，在1.5%麦芽阿加培养皿上5天，不含CO2。
注意：熏蒸是生物安全2级微生物，必须在适当的设施中使用生物安全柜处理，并佩戴实验室外套、手套和过滤面罩。
注：板应完全覆盖一层绿灰色的锥体。白色文化不会使人无法被文化所融合。麦芽琼脂的成分：4%（w/v）麦芽提取物，酵母提取物0.4%（w/v），琼脂1.5%（w/v），水底。 - 收获锥体
- 将用消毒剂湿湿的纸巾放入生物安全柜中，并将盘子放在顶部，以防止挥发性锥体过度分布。
- 在真菌上加入10 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）= 0.01%的洗涤剂，使用Drigalski铲将液体涂在盘子上，擦掉深色的锥体。小心不要去除白色菌丝。
- 使用 30 μm 细胞过滤器将锥体悬浮液放入 50 mL 管中，以去除任何残留的菌丝。
- 重复步骤 1.2.2 和 1.2.3 并在同一 50 mL 管中收集。
- 在室温下在 2，600 x g下旋转 5 分钟。
- 去除上清液，在20 mL无菌 Aqua dest 中重新悬浮。
- 使用 Thoma 计数室确定锥体浓度。
注：协议可以在这里暂停，锥形悬浮液在4°C下储存长达1个月，盖子拧得紧紧。
- FITC 标签
- 在无菌 0.1 M Na2CO3（溶解在 PBS 中）中制备 0.1 mM 的 FITC 粉末溶液。
注意：FITC粉末是危险的，应用手套、护目镜和滤网面罩处理。根据当地法规收集废物。
注：在此和以下步骤中，省略人工光，涉及锥体。 - 在 15 mL 管中重新悬浮 1 x 108（或更少）的 FITC 溶液中的 5 mL 锥度。在旋转器中37°C孵育20分钟。
- 对于负控制，在 15 mL 管中重新悬浮 0.1 M Na2CO3（不含 FITC）中的锥度。在旋转器中37°C孵育20分钟。
注：在计算要染色的锥体量时，在染色、肿胀和所有必要的洗涤步骤中，应考虑到高达 70% 的损失。如果没有旋转器，在孵育期间应摇动悬浮液三次。 - 对于洗涤，在悬浮液中加入 10 mL = 0.01% 的洗涤剂，在室温下在 2，600 x g下旋转 5 分钟。
- 去除上清液，用10 mL的PBS + 0.01%洗涤剂重复洗涤两次。
- 在无菌 0.1 M Na2CO3（溶解在 PBS 中）中制备 0.1 mM 的 FITC 粉末溶液。
- 锥体肿胀（如果不需要，可以省略）
- 在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）的5 mL中重新悬浮FITC标记的锥度，中等=10%胎儿小牛血清（FCS），并在37°C的旋转器中孵育，以达到所需时间（例如，2小时，4小时）。
注：如果没有旋转器可用，在孵育期间至少每20分钟摇动一次悬浮液。 - 在悬浮液中加入 10 mL = 0.01% 洗涤剂，在室温下在 2，600 x g下旋转 5 分钟。
- 去除上清液，用10 mL的PBS = 0.01%洗涤剂洗涤两次。
- 过滤通过30μm细胞过滤器，以去除大块的锥体。
- 在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）的5 mL中重新悬浮FITC标记的锥度，中等=10%胎儿小牛血清（FCS），并在37°C的旋转器中孵育，以达到所需时间（例如，2小时，4小时）。
- 修复锥体（如果不需要，可以省略）
- 在甲醛1mL中重新悬浮FITC标记和肿胀的锥度，并在室温下孵育1小时。
- 在悬浮液中加入 10 mL = 0.01% 洗涤剂，在室温下在 2，600 x g下旋转 5 分钟。
- 去除上清液，用10 mL的PBS = 0.01%洗涤剂洗涤两次。
注：该协议可以在这里暂停，在4°C下将锥体储存在PBS中（用铝箔包裹的管子）长达1周。
2. 人类原发性白细胞的制备
- 将 5 mL 的布漆放入 50 mL 管中。或者，使用新鲜人类外周静脉血液吸入乙烯二甲酸（EDTA）单体（每50 mL管10 mL）。
注意：人类血液可能传播病毒，如人类免疫缺陷病毒和乙型肝炎病毒。只在接种乙型肝炎疫苗后处理。在生物安全柜中，穿着实验室外套和手套。 - 用红细胞溶酶 （EL） 缓冲液填充管，反转三次，水平孵育 5-8 分钟，直到混合物的乳状外观变清晰。
注意：偶尔，血液可能需要更长的时间来分莱。按外观走。同一血液的两个管子需要不同的时间来分莱酶，这很正常。EL 缓冲液的组成： 0.15 M NH4Cl， 10 mM KHCO3， 0.1 mM EDTA - 在室温下，在 300 x g下旋转 10 分钟。丢弃上清液。
- 通过移液将颗粒重新悬浮在 1 mL 的 EL 缓冲液中。然后添加另一个 24 mL 的 EL 缓冲区，并反转几次。
- 在室温下，在 300 x g下旋转 5 分钟。
- 丢弃上清液，在 1 mL 的 RPMI = 10% FCS 中重新悬浮细胞。
- 使用 Neubauer 计数室确定细胞浓度。
3. 方细胞测定
- 在 1.5 mL 的 RPMI + 10% FCS 中孵育 2 x 106白细胞和 4 x 106 FITC 标记的锥体（感染倍数 = 2）。作为对照，仅包括细胞（无锥体）和细胞 = 未标记的锥体。
- 将加湿 CO2培养箱置于 37°C 下，并在所需时间内孵育（例如，0.5 小时、2 小时或 4 小时）。
- 孵育后，用细胞刮刀收获细胞，并放入15 mL管中。
- 在室温下，在 300 x g下旋转 5 分钟。
- 收集上清液进行细胞因子分析，或丢弃，如果不需要。将每个样品重新悬浮在 100 μL 的 PBS = 2 mM EDTA 中。
4. 抗体染色
- 根据表1，每个样品制备100μL抗体混合物，包括APC抗FITC抗体。
- 将 100 μL 样品放入 96 孔 V 底板的一个孔中。添加 150 μL 的 PBS = 2 mM EDTA 进行洗涤。
- 对于颜色补偿，将每种颜色的 1 x 106个单元放入 96 孔 V 底板的进一步孔中。包括未染色的单元格。添加 150 μL 的 PBS = 2 mM EDTA 进行洗涤。
- 用胶箔盖板。
- 在室温下，在 300 x g下旋转 5 分钟。拆下铝箔。
- 将盘子仅在水槽或一次性纸巾上快速、用力倒置一次，从而丢弃上清液。
注意：在干燥之前，不要重复或敲打纸张上的盘子，因为这将导致从板上大量损失细胞。 - 在100μL抗体混合物中重新悬浮细胞，并通过移液很好地混合。
- 对于颜色补偿，在 PBS 的 100 μL = 2 mM EDTA 中重新悬浮各自的细胞，并在抗体混合物中使用的相同量的每个井中添加单个抗体。
- 用粘结箔盖住，在黑暗中室温下孵育20分钟。
- 拆下铝箔。在每个井中加入 150 μL 的 PBS = 2 mM EDTA，以便进行洗涤。用胶箔盖住。
- 在室温下，在 300 x g下旋转 5 分钟。拆下铝箔。将盘子快速、有力地倒置在水槽或一次性纸巾上，从而丢弃上清液。
- 在 200 μL 的 PBS + 2 mM EDTA 中重新悬浮，并将每个井的细胞转移到单独的圆形底管中。确保挂起中没有细胞簇。否则删除群集。
注：每个足够大、眼睛都能看到的聚类都足够大，可能会堵塞细胞仪。
5. 流动细胞测定
- 启动流量细胞仪，让它预热。启动采集软件。
- 创建新的实验，设置和标记示例。
- 为荧光团 FITC、APC、BUV395、V500、PerCP-Cy5.5 设置参数（FSC 250、SSC 250）和探测器。
- 薪酬设置
- 打开薪酬设置。
- 指示各个颜色。
- 使用未染色的控制单元或带有单个染色的控制单元，将 PMT 检测器电压设置为包括刻度内的所有事件。
- 记录每个控件的至少 10，000 个事件。
- 使用补偿设置计算荧光水波溢出物，并应用于实验的细胞计设置。
- 记录示例数据
- 在采集软件中显示 FSC 和 SSC，并在白细胞周围设置门。
- 基于白细胞门，显示点图 SSC/CD45 和门 CD45+ 细胞从锥体分离。
- 在点图 CD14/CD66b 和门单核细胞 （CD14+） 和嗜中性粒细胞 （CD66b+） 中分别显示 CD45+ 细胞。
- 在点图中显示嗜中性粒细胞，防 FITC/FITC。
- 使用带有未标记锥体的样品，设置抗 FITC 和 FITC 信号的象限，在各自的象限中最多允许 1% 的细胞。
- 对单核细胞门重复步骤5.5.4和5.5.5。
- 记录所有样本，在白细胞门内记录至少 20，000 个事件。
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Representative Results
在人类吞噬细胞测量锥体噬菌体吞噬细胞时，真正的内化和仅仅依附于细胞之间的歧视是一个障碍，特别是在流式细胞测定等高通量方法方面。为了克服这一障碍，我们提出了一种快速可靠的方案，基于在细胞和锥体联合孵育之前用荧光染料FITC染色的锥体，然后与APC标记的抗FITC抗体在孵育后进行反染色（图1A）。如图1B所示，FITC标记的锥体由人类单核细胞和嗜中性粒细胞对细胞进行噬菌体，为细胞提供绿色信号。这些锥度是无法访问的抗FITC抗体，因此，不能结合抗体和细胞出现APC阴性（FITC+，APC-）。非相互作用的细胞不会从FITC标记的锥体获得绿色信号，并且仍然是FITC-，APC-。几个单元格出现 FITC-，APC+。由于抗FITC APC抗体不能结合没有FITC标记的锥体细胞，这些事件被视为染色伪影。FITC 标记的锥度（附着在细胞上，但不内化），使细胞对 FITC 也呈阳性，但也为抗 FITC 抗体提供靶点，使这些细胞对 FITC 和 APC（FITC®，APC+）具有双重阳性。当从微观分析时，这个群体只在我们的实验中含有多达20%的带有附加的锥体细胞。
使用该协议中描述的抗体，并遵循图1D中的门控策略，由FSC和SSC特性对人白细胞进行一般门控，然后由泛白细胞标记CD45分离白细胞和自由锥体。特别是在使用肿胀的锥体和/或长孵育时间时，锥度在流动细胞测定时几乎可以达到细胞大小，因此偏置分析。由于人类原发性单核细胞和嗜中性粒细胞对锥体的不同，该协议允许根据与成熟的细胞谱系标记CD14对单核细胞和嗜中性粒细胞CD66b的染色单独分析这些细胞群。对噬菌体和粘附细胞群的注口基于未标记的锥体对照样本进行，该样本既不携带FITC，也不携带抗FITC APC信号。当 APC 和 FITC 相互绘制时，象限设置的方式使感兴趣的入口中最多允许 1% 的单元格。
人类原发性噬菌体内化锥体的比例在献血者中可能变化很大，但也取决于实验因素，如锥形的孵育时间和肿胀状态。孢子内化可以在0.5小时共育后检测出来，并随着时间的推移而增加（图2A）。即使在较短的孵育时间，也更容易服用前孔径（不肿胀）孢子（图2B）。如果锥体与甲醛固定，与原生锥体相比，方位细胞化减少（图2C）。
| 试剂 | 每个样品μl |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0.5 |
| CD66b PerCP-Cy5.5 | 1.5 |
| 反 FITC APC | 0.5 |
| PBS = 2 mM EDTA | 97 |
| 总 | 100 |
表1：用于流动细胞测量的抗体混合物。每个试剂的量以微升为单位，每个样品（1 x 106细胞）进行分析。
图1：流细胞测定的建立与分析。（A） 方案方案包括锥体和细胞制备及抗染色。（B） 通过绘制 FITC 标记的锥体抗 FITC APC 反染色的流细胞测量数据来分析方细胞化。结果的种群表示非相互作用的白细胞（FITC-，APC-），具有粘附锥体（FITC+，APC+）和方细胞细胞（FITC+，APC-）的白细胞的百分比，以及染色伪影（FITC-，APC+）。（C） 与 3 个不同捐赠者进行 3 个不同实验中的双阳性细胞群（其中两个重复执行，一次执行单体）在微观上计算为内化，仅附着 conidia。（D） 流动细胞测量数据的代表性门控策略，用于检测白细胞 （CD45），识别单核细胞 （CD14） 和嗜中性粒细胞 （CD66b） 并确定相互作用的种群 （FITC， 抗 FITC）。这个数字已由Hartung等人修改，细胞学A，95：3，第332-338（2019）14。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：人类原发性噬菌体锥体噬菌体依多种因素的几个条件而定。（A） 内化休息锥体细胞的百分比随着共同孵育时间的增加而增加.（B） 当共同孵育0.5小时（C）原生锥体比固定锥体更好地使用方位体时，噬菌体随同质膨胀时间增加。数据来自10个不同的捐赠者（A，B）或5个不同的捐赠者（C）在10个（A，B）或5个（C）独立实验中。错误条表示 SD。这个数字已由Hartung等人修改，细胞学A，95：3，第332-338（2019）14。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：方位细胞分析是评估人类原发性噬细胞功能和临床相关霉菌特征的一种方法。（A） 健康供体和免疫抑制患者（造血干细胞移植后）的单核细胞的示范性比较，在0.5小时、2小时和4小时（B）中，将食细胞酶的止血锥体确定为临床上相关的阿塞比鲁斯和穆卡利亚人物种，后2小时共同孵育。数据来自5个（阿斯珀吉鲁斯）或3个（穆卡拉尔）不同的捐赠者，每个实验5或3个。误差条表示SD.缩写：A.阿斯珀吉鲁斯，L.利希希米亚，M.穆科尔，R.Rhizopus请点击这里查看这个数字的较大版本。
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Discussion
该协议提出了一种快速流动细胞学方法，用于测量A.熏蒸锥体与大量初级人类白细胞的相互作用，这在常见的显微协议中是不可能的。使用显微镜和手动计数内化锥体成像细胞非常麻烦，实际上只能对几百个细胞进行成像。流式细胞测量通过在几分钟内测量数千个细胞来克服这个问题。这两种方法共有的障碍是细胞内或细胞上的邻形同质体的区别。在显微镜中，染料钙氟白色常用于染色粘附锥体，但其用途仅限于含有含环素的微生物。
与此相反的协议使用独特的荧光素来表征相互作用事件，允许添加更多的细胞标记，如系系标记CD45，CD14和CD66b。因此，在单个样本中也可以用单核细胞和嗜中性粒细胞来区分病原体的噬菌体。虽然细胞识别的标记和荧光团的选择可以适应实验的需要和可用细胞仪的能力，但建议使用本协议中提到的特定APC抗FITC抗体，因为它是我们手中最可靠的抗体
由于甲醛固定锥体没有同样地内化，建议使用原生孢子进行方位细胞测定。然而，在人类白细胞共同孵育期间，原生锥体将开始或继续肿胀，并最终发芽。通常，在37°C的含葡萄糖介质中，A.熏蒸菌锥体在8-9小时后发芽。膨胀时间和与噬菌体共育时间的组合不应超过这个时间框架，因为发芽会导致锥体表面的FITC损失。更重要的是，单核细胞或嗜中性粒细胞不能再用噬菌体来消灭细菌。相反，这些噬菌体会积聚在周围，并坚持在发芽，产生细胞簇堵塞细胞仪，如果不是删除。同样，4 h 肿胀的锥体往往在它们之间和细胞之间产生簇。通常，这些簇不能再机械地分离，并且内部的细胞会丢失用于流式细胞测量分析。
虽然在开始时门控是简单明了的，但细胞内化的锥体越多，门控可能就越模糊。使用 MOIs > 2 会增加初始时间点的噬菌体，但门控问题也可能更早出现。因此，应仔细确定与感兴趣的特定细胞和病原体的MOIs。
该协议的一个限制是粘附性锥体（FITC+ APC+）的细胞群的二元性，该细胞可能还怀有粘附性以及内化锥体。进一步区分的可能性是应用成像流式细胞仪15，允许对流式细胞仪中测量的所有细胞进行目视成像。
由于粘结细胞壁的未特异性FITC标签，这种方法很容易转移到其他感兴趣的真菌，如临床相关的霉菌属的霉菌或酵母念珠菌。此外，细胞壁携带细菌也可以贴上FITC标签。抗FITC抗体的通用反染色允许通过大量人类白细胞快速、轻松地测量所有这些病原体的噬菌体。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢皮娅·斯蒂尔夫人的出色技术援助。M. von Lilienfeld-Toal 由败血症控制和护理中心（德国联邦教育和卫生部、BMBF、FKZ 01E01002）和感染性生物研究园区（BMBF，FKZ 13GW0096D）提供支持。蒂恩戈克·迈·霍恩由耶拿微生物传播学院（德国福森斯格明舍夫特，FKZ 214/2）支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
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