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Immunology and Infection

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Published: December 7, 2019 doi: 10.3791/60397

Summary

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur quantitativen Messung der Phagozytose der Aspergillus fumigatus conidia durch menschliche primäre Phagozyten mittels Durchflusszytometrie und zur Unterscheidung der Phagozytose der Conidia von der bloßen Adhäsion zu Leukozyten.

Abstract

Invasive Lungeninfektion durch den Schimmel Aspergillus fumigatus stellt eine große Bedrohung für immungeschwächte Patienten dar. Inhalierte Pilzkonidien (Sporen) werden von den menschlichen Lungenalveolen durch angeborene Monozyten und/oder Neutrophile phagozytoisiert. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Messung der Phagozytose durch Durchflusszytometrie mit Fluorescein isothiocyanat (FITC)-markierten Conidie nativ für die Ko-Inkubation mit menschlichen Leukozyten und anschließende Gegenfärbung mit einem Anti-FITC-Antikörper, um eine Diskriminierung von internalisiertem und zellhaftem Konidien zu ermöglichen. Wesentliche Vorteile dieses Protokolls sind seine Schnelligkeit, die Möglichkeit, den Assay mit der zytometrischen Analyse anderer Zellmarker von Interesse zu kombinieren, die gleichzeitige Analyse von Monozyten und Neutrophilen aus einer einzigen Probe und seine Anwendbarkeit auf andere zellwandtragende Pilze oder Bakterien. Die Bestimmung der Prozentsätze von Phagozytosing-Leukozyten bietet Mikrobiologen ein Mittel zur Beurteilung der Virulenz eines Erregers oder zum Vergleich von Pathogenwildarten und Mutanten sowie Immunologen zur Untersuchung der Fähigkeiten menschlicher Leukozyten zur Bekämpfung von Krankheitserregern.

Introduction

Invasive lungenaspergillose ist eine große Bedrohung für immungeschwächte Patienten, da die Behandlungsmöglichkeiten begrenzt sind und erst bei einer frühen Diagnose erfolgreich sind, was zu hohen Sterblichkeitsraten führt1. Infektionserreger sind Conidia (Sporen) der Form Aspergillus fumigatus, die in den meisten Lebensräumen allgegenwärtig sind2. Conidia werden eingeatmet, passieren die Atemwege und können schließlich in die Lungenalveolen gelangen. Bei immunkompetenten Menschen werden diese Conidien durch angeborene Immunzellen wie Monozyten oder Makrophagen und neutrophile Granulozyten, die die Erreger aufnehmen (Phagozytose) aufnehmen und verdauen, gelöscht3. Phagozytose ist wichtig für Mikrobiologen und Immunologen, auch wenn sie an Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen interessiert ist. Konfrontationstests, wie die Ko-Inkubation von Leukozyten und Conidie, umfassen häufig die Kennzeichnung der Sporen durch Fluorescein oder deren Derivat Fluoresceinisothiocyanat (FITC). Mit Hilfe eines Mikroskops ist es einfach, verinnerlichte fluoreszierende Konidien zu identifizieren und angehängte/haftende Konidien zu bestimmen, obwohl dieser Ansatz umständlich und realistischerweise auf ein paar hundert Zellen beschränkt ist4. In der Durchflusszytometrie, die die Analyse von Hunderttausenden von Zellen innerhalb von Minuten leicht ermöglicht, ist jedoch eine differenzielle Färbung von phagozytosierter und anhaftender Konidie von entscheidender Bedeutung. Daher verlassen sich viele Protokolle auf Trypan Blue, um fitC-Fluoreszenz aus der anhaftenden Conidia5,6,7,8zu löschen. Ein anderer Ansatz ist die Nutzung der Fluoreszenzresonanzenergieübertragung von Ethidiumbromid und FITC, um rote statt grüne Fluoreszenz aus der anhaftenden Konidie9,10,11auszusenden. Wenn spezifische Antikörper verfügbar sind, wie dies bei einigen Bakterien der Fall ist, können zellgebundene Partikel direkt gebeizt werden12,13.

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen und quantitativen Bewertung der Phagozytose von FITC-markierter A. fumigatus conidia durch menschliche Leukozyten zusammen mit der Anhaftung von Sporen an Zellen und mangelnder Wechselwirkung durch den Einsatz eines Mitwirkungsmittels (APC)-gekoppelten Anti-FITC-Antikörpers. Die Methode ermöglicht auch die gleichzeitige zytometrische Analyse weiterer Zellmarker, die für die separate Analyse der Phagozytose durch Monozyten und Neutrophilen aus derselben Probe eingesetzt werden können.

Das Protokoll kann für die Charakterisierung von Pilzstämmen (z. B. mehrere Arten von Aspergillus und anderen Schimmelpilzen aus der Gattung Mucorales, die hier vorgestellt werden) und deren Mutanten14 und immunologische Forschung an Phagozyten, wie Leukozyten von immungeschwächten Individuen, angewendet werden.

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Protocol

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von menschlichen Buffy-Mänteln, die vom Institut für Transfusionsmedizin, Universitätsklinikum Jena, und frischem venösem Blut von Patienten nach schriftlicher Zustimmung der Spender gemäß der Genehmigung der Ethikkommission 4357-03/15 erhalten wurden.

1. Zubereitung von Aspergillus fumigatus Conidia

  1. A. fumigatus auf 1,5% Malz-Agar-Petri-Schalen 5 Tage lang bei 37 °C ohne CO2anbauen.
    VORSICHT: A. fumigatus ist ein Mikroorganismus der Biosicherheitsstufe 2 und muss in einer geeigneten Einrichtung mit einem Biosicherheitsschrank und laboriertem Mantel, Handschuhen und einer Filtermaske behandelt werden.
    ANMERKUNG: Die Platte sollte vollständig mit einer grün-grauen Konidienschicht bedeckt sein. Weiße Kulturen sporen nicht. Zusammensetzung von Malzagar: 4% (w/v) Malzextrakt, Hefeextrakt 0,4% (w/v), Agar 1,5% (w/v), Aqua dest.
  2. Ernte conidia
    1. Legen Sie ein mit Desinfektionsmittel nasses Papiertuch in den Biosicherheitsschrank und legen Sie die Platte darauf, um eine Überverteilung flüchtiger Konidien zu verhindern.
    2. 10 ml Phosphatgepufferte Kochsel (PBS) + 0,01% Waschmittel auf den Pilz geben, einen Drigalski-Spachtel verwenden, um die Flüssigkeit über die Platte zu verteilen und die dunkel gefärbten Konidien abzureiben. Achten Sie darauf, das weiße Myzel nicht zu entfernen.
    3. Setzen Sie die Konidiasuspension mit einem 30-m-Zellsieb in ein 50 ml-Rohr, um restliches Myzel zu entfernen.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 und sammeln Sie in der gleichen 50 ml Rohr.
    5. Drehen Sie 5 min bei 2.600 x g bei Raumtemperatur.
    6. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 20 ml sterilem Aqua dest wieder aus.
    7. Bestimmen Sie die Konidiakonzentration mit einer Thoma-Zählkammer.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten und die Conidia-Aufhängung bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden, wobei der Deckel fest verschraubt ist.
  3. FITC-Kennzeichnung
    1. Bereiten Sie eine 0,1 mM Lösung von FITC Pulver in steril0,1 M Na2CO3 (in PBS gelöst)vor.
      VORSICHT: FITC Pulver ist gefährlich und sollte mit Handschuhen, Schutzbrille und filtermaske behandelt werden. Sammeln Sie Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften.
      ANMERKUNG: Lassen Sie dabei künstliches Licht aus und die folgenden Schritte mit Conidia.
    2. 1 x 108 (oder weniger) Konidie nieren in 5 ml FITC-Lösung in einem 15 ml-Rohr. 20 min bei 37 °C in einem Rotator inkubieren.
    3. Für die Negativkontrolle Conidia in 0,1 M Na2CO3 (ohne FITC) in einem 15 ml Rohr wieder aussetzen. 20 min bei 37 °C in einem Rotator inkubieren.
      ANMERKUNG: Berücksichtigen Sie bei der Berechnung der zu färbenden Konidienmenge einen Verlust von bis zu 70 % bei Färbung, Schwellung und allen notwendigen Waschschritten. Wenn kein Rotator verfügbar ist, sollte die Aufhängung während der Inkubation dreimal geschüttelt werden.
    4. Zum Waschen 10 ml PBS + 0,01% Reinigungsmittel in die Suspension geben und bei Raumtemperatur 5 min bei 2.600 x g drehen.
    5. Überstand entfernen und zweimal mit 10 ml PBS + 0,01% Waschmittel wiederholen.
  4. Schwellung von Conidia (kann weggelassen werden, wenn nicht gewünscht)
    1. FITC-gekennzeichnete Conidie in 5 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium + 10% Fetal Calf Serum (FCS) und inkubieren in einem Rotator bei 37 °C für die gewünschte Zeit (z. B. 2 h, 4 h).
      HINWEIS: Wenn kein Rotator verfügbar ist, sollte die Aufhängung während der Inkubation mindestens alle 20 min geschüttelt werden.
    2. 10 ml PBS + 0,01% Reinigungsmittel in die Suspension geben und bei Raumtemperatur 5 min bei 2.600 x g drehen.
    3. Den Überstand entfernen und zweimal mit 10 ml PBS + 0,01% Reinigungsmittel waschen.
    4. Filtern Sie durch ein 30-m-Zellsieb, um große Konidierklumpen zu entfernen.
  5. Fixierung von Conidia (kann weggelassen werden, wenn nicht gewünscht)
    1. FITC-gekennzeichnete und geschwollene Konidie in 1 ml Formaldehyd aufheben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. 10 ml PBS + 0,01% Reinigungsmittel in die Suspension geben und bei Raumtemperatur 5 min bei 2.600 x g drehen.
    3. Den Überstand entfernen und zweimal mit 10 ml PBS + 0,01% Reinigungsmittel waschen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten und die Conidia in PBS im Dunkeln (Rohr in Aluminiumfolie eingewickelt) für bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.

2. Vorbereitung der humanen Primärleukozyten

  1. Legen Sie 5 ml Buffy Mantel in einem 50 ml Rohr. Alternativ können Sie frisches peripheres venöses Blut verwenden, das in Monovetten (EDTA) (10 ml pro 50 ml Tube) in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) entnommen wird.
    VORSICHT: Menschliches Blut kann Viren wie Human Immunodeficiency Virus und Hepatitis B Virus übertragen. Behandeln Sie ihn nur nach der Impfung gegen Hepatitis B. Griff in einem Biosicherheitsschrank mit Labormantel und Handschuhen.
  2. Füllen Sie das Rohr mit Erythrozyten Lysis (EL) Puffer, dreimal invertieren und für 5-8 min horizontal inkubieren, bis das milchige Aussehen der Mischung klar wird.
    HINWEIS: Gelegentlich kann das Blut länger dauern, um zu lysieren. Gehen Sie durch das Aussehen. Es ist nicht ungewöhnlich, dass zwei Röhren des gleichen Blutes unterschiedliche Zeiten nehmen, um zu lyse. Zusammensetzung des EL-Puffers: 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA
  3. Drehen Sie 10 min bei 300 x g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand.
  4. Setzen Sie das Pellet in 1 ml EL Buffer durch Pipettieren wieder auf. Fügen Sie dann weitere 24 ml EL-Puffer hinzu und kehren Sie mehrmals um.
  5. Drehen Sie 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur.
  6. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in 1 ml RPMI + 10% FCS wieder auf.
  7. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einer Neubauer Zählkammer.

3. Phagozytose Assay

  1. Inkubieren Sie 2 x 106 Leukozyten und 4 x 106 FITC-markierte Conidie (Infektionsvielfalt = 2) in 1,5 ml RPMI + 10% FCS in einer 12-Well-Zellkulturplatte. Als Steuerelemente, schließen Sie nur Zellen (keine Conidia) und Zellen + unbeschriftete Conidie.
  2. In einen befeuchtetenCO2-Inkubator bei 37 °C geben und für den gewünschten Zeitraum (z.B. 0,5 h, 2 h oder 4 h) inkubieren.
  3. Nach der Inkubation Zellen mit einem Zellschaber ernten und in ein 15 ml Rohr geben.
  4. Drehen Sie 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur.
  5. Sammeln Sie Überstand für Zytokin-Analyse oder entsorgen, wenn nicht gewünscht. Setzen Sie jede Probe in 100 l PBS + 2 mM EDTA aus.

4. Antikörperfärbung

  1. Bereiten Sie für jede Probe 100 l Antikörpermischung, einschließlich APC-Anti-FITC-Antikörper, gemäß Tabelle 1vor.
  2. Legen Sie eine 100-L-Probe in einen Brunnen einer 96-Well-V-Bodenplatte. Fügen Sie 150 l PBS + 2 mM EDTA zum Waschen hinzu.
  3. Zur Farbkompensation 1 x 106 Zellen für jede Farbe in weitere Brunnen der 96-Well V Bodenplatte. Schließen Sie einen Brunnen von Zellen ein, der unbefleckt bleibt. Fügen Sie 150 l PBS + 2 mM EDTA zum Waschen hinzu.
  4. Abdeckplatte mit Klebefolie.
  5. Drehen Sie 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Folie.
  6. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte nur einmal über dem Waschbecken oder einem Einwegpapiertuch schnell und kraftvoll umkehren.
    HINWEIS: Wiederholen oder klopfen Sie die Platte nicht auf ein Papier, bis sie trocken ist, da dies zu einem massiven Verlust von Zellen aus der Platte führt.
  7. Die Zellen in der 100-L-Antikörpermischung wieder aufsetzen und durch Pipettieren gut mischen.
  8. Zur Farbkompensation setzen Sie die jeweiligen Zellen in 100 l PBS + 2 mM EDTA wieder aus und fügen Sie jedem Bohrkörper einen einzigen Antikörper in der gleichen Menge hinzu, die im Antikörpermix verwendet wird.
  9. Mit einer Klebefolie abdecken und 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln bebrüten.
  10. Entfernen Sie die Folie. Fügen Sie 150 L PBS + 2 mM EDTA zu jedem Brunnen zum Waschen hinzu. Mit einer Klebefolie abdecken.
  11. Drehen Sie 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Folie. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell und kraftvoll über dem Waschbecken oder einem Einwegpapiertuch umkehren.
  12. Resuspend in 200 l PBS + 2 mM EDTA und übertragen Zellen von jedem Brunnen in ein separates rundes Bodenrohr. Stellen Sie sicher, dass sich keine Zellcluster in der Suspension befinden. Entfernen Sie Cluster andernfalls.
    HINWEIS: Jeder Cluster, der groß genug ist, damit das Auge sie sehen kann, ist groß genug, um das Zytometer möglicherweise zu verstopfen.

5. Durchflusszytometrie

  1. Starten Sie das Durchflusszytometer und lassen Sie es aufwärmen. Starten Sie die Erfassungssoftware.
  2. Erstellen Sie ein neues Experiment, richten Sie die Beispiele ein, richten Sie sie ein, und beschriften Sie sie.
  3. Einrichten von Parametern (FSC 250, SSC 250) und Detektoren für Fluorophore FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-Cy5.5.
  4. Kompensationseinrichtung
    1. Offene Vergütungseinrichtung.
    2. Geben Sie einzelne Farben an.
    3. Mit den Steuerzellen, die unbefleckt oder mit einzelnen Färbungen übrig geblieben sind, stellen Sie die PMT-Detektorspannungen so ein, dass alle Ereignisse innerhalb der Skala eingeschlossen sind.
    4. Zeichnen Sie mindestens 10.000 Ereignisse jedes Steuerelements auf.
    5. Verwenden Sie die Kompensationseinstellungen, um das Spillover von Fluorophoren zu berechnen und auf die Zytometereinstellungen des Experiments anzuwenden.
  5. Aufzeichnen von Beispieldaten
    1. Zeigen Sie FSC und SSC in der Erfassungssoftware an und setzen Sie das Gate um Leukozyten.
    2. Basierend auf dem Leukozyten-Gate, Display-Punkt-Plot SSC/CD45 und Gate für CD45+ Zellen, um von conidia zu trennen.
    3. CD45+-Zellen in einem Punktplot CD14/CD66b und Gate-Monozyten (CD14+) und Neutrophilen (CD66b+) separat anzeigen.
    4. Anzeigen von Neutrophilen in einem Punktplot anti-FITC/FITC.
    5. Mit der Probe mit unbeschrifteter Konidie naschen quadranten für Anti-FITC- und FITC-Signale, so dass maximal 1% der Zellen in den jeweiligen Quadranten zugelassen werden.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.4 und 5.5.5 für Monozytentor.
    7. Zeichnen Sie alle Proben mit mindestens 20.000 Ereignissen im Leukozytentor auf.

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Representative Results

Bei der Messung der Phagozytose von A. fumigatus conidia durch menschliche phagozytische Zellen ist die Diskriminierung zwischen echter Internalisierung und bloßer Bindung von Conidia an die Zellen ein Hindernis, insbesondere wenn es um Hochdurchsatzmethoden wie Durchflusszytometrie geht. Um diese Hürde zu überwinden, präsentieren wir ein schnelles und zuverlässiges Protokoll, das auf der Färbung von Conidia mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC vor der Koinkubation von Zellen und Konidien basiert, gefolgt von einer Gegenfärbung mit einem APC-beschrifteten Anti-FITC-Antikörper nach der Inkubation (Abbildung 1A). Wie in Abbildung 1Bdargestellt, werden FITC-markierte Conidie von menschlichen Monozyten und Neutrophilen phagozytoisiert, die ein grünes Signal an die Zellen liefern. Diese Conidie sind für den Anti-FITC-Antikörper unzugänglich und können daher den Antikörper nicht binden und die Zellen erscheinen APC negativ (FITC+, APC-). Nicht interagierende Zellen erhalten kein grünes Signal von FITC-beschrifteter Conidia und bleiben FITC-, APC-. Einige Zellen erscheinen FITC-, APC+. Da der Anti-FITC-APC-Antikörper keine Zellen ohne FITC-markierte Konidie binden kann, gelten diese Ereignisse als Färbeartefakte. FITC-markierte Conidie, die an die Zellen angeschlossen, aber nicht internalisiert sind, rendern Zellen auch positiv für FITC, stellen aber auch ein Ziel für den Anti-FITC-Antikörper dar, der diese Zellen doppelt positiv für FITC und APC (FITC+, APC+) macht. Bei der mikroskopischen Analyse enthielt diese Population nur in unseren Experimenten bis zu 20% der Zellen mit angehängter Konidie.

Unter Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen Antikörper und nach der Gating-Strategie in Abbildung 1Dfolgt auf eine allgemeine Vermischung menschlicher Leukozyten durch FSC- und SSC-Eigenschaften eine Trennung von Leukozyten und freier Konidie durch den Pan-Leukozyten-Marker CD45. Insbesondere bei Verwendung von geschwollenem Conidia und/oder langen Inkubationszeiten kann Conidia zum Zeitpunkt der Durchflusszytometrie und damit der Bias-Analyse fast Zellgröße erreichen. Da menschliche primäre Monozyten und Neutrophile Conidia unterschiedlich aufnehmen, ermöglicht dieses Protokoll eine separate Analyse dieser Zellpopulation auf der Grundlage der Färbung mit den etablierten Zelllinienmarkern CD14 für Monozyten und CD66b für Neutrophile. Das Gating für Phagozytosing und anhaftende Zellpopulationen erfolgt auf der Grundlage von Kontrollproben mit unbeschrifteten Conidien, die weder ein FITC- noch ein Anti-FITC-APC-Signal enthalten. Wenn APC und FITC gegeneinander geplottet werden, werden Quadranten so eingestellt, dass maximal 1% Zellen in den Toren des Interesses zulässig sind.

Der Prozentsatz der humanen primären Phagozyten verinnerlicht Konidie kann sehr variabel unter den Blutspendern sein, sondern hängt auch von experimentellen Faktoren wie Inkubationszeit und Schwellungzustand der Konidien. Sporeninternalisierung kann bereits nach 0,5 h Ko-Inkubation erkannt werden und nimmt mit der Zeit zu (Abbildung 2A). Vorgeschwollene Konidien werden auch bei kurzen Inkubationszeiten leichter aufgenommen als ruhende (nicht geschwollene) Sporen(Abbildung 2B). Wenn Conidie mit Formaldehyd fixiert sind, wird Phagozytose im Vergleich zu nativen Conidia vermindert (Abbildung 2C).

Reagenz l pro Probe
CD45 BUV395 1
CD14 V500 0.5
CD66b PerCP-Cy5.5 1.5
Anti-FITC APC 0.5
PBS + 2 mM EDTA 97
gesamt 100

Tabelle 1: Antikörpermischung für Durchflusszytometrie. Die Mengen jedes Reagenzes werden als Mikroliter pro zu analysierender Probe (1 x 106 Zellen) angegeben.

Figure 1
Abbildung 1: Einrichtung und Analyse des flow cytometrischen Phagozytose-Assays. (A) Schema des Protokolls einschließlich Konidien und Zellpräparation und Gegenfärbung. (B) Die Phagozytose wird durch Plotten von zytometrischen Flussdaten von FITC-markierten Conidien gegen Anti-FITC-APC-Gegenfärbung analysiert. Die resultierenden Populationen geben Prozentsätze von nicht interagierenden Leukozyten (FITC-, APC-), Leukozyten mit anhaftender Konidie (FITC+, APC+) und phagozytosingLeukozyten (FITC+, APC-) sowie Färbeartefakte (FITC-, APC+) an. (C) Doppelte positive Zellpopulationen aus 3 verschiedenen Experimenten mit 3 verschiedenen Spendern (zwei davon in Duplikaten, einer durchgeführt single) wurden mikroskopisch für internalisierte und nur konidiengebundene Konidien gezählt. (D) Repräsentative Gating-Strategie der zytometrischen Flussdaten zum Nachweis von Leukozyten (CD45), zur Identifizierung von Monozyten (CD14) und Neutrophilen (CD66b) und zur Bestimmung interagierender Populationen (FITC, Anti-FITC). Diese Zahl wurde geändert von Hartung et al., Cytometry A, 95: 3, S. 332-338 (2019)14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Phagozytose der Conidia durch menschliche primäre Phagozyten hängt von mehreren Bedingungen ab. (A) Prozentsatz der Zellen internalisieren ruhende Konidie erhöht mit Co-Inkubationszeit. (B) Phagozytose erhöhte sich mit konidialer Schwellungszeit, wenn sie für 0,5 h mitinkubiert wurde. (C) Native Conidie waren besser phagozytosiert als feste Conidie. Die Daten wurden von 10 verschiedenen Spendern (A,B) oder 5 verschiedenen Spendern (C) in 10 (A,B) oder 5 (C) unabhängigen Experimenten gewonnen. Fehlerbalken zeigen SD an. Diese Zahl wurde geändert von Hartung et al., Cytometry A, 95: 3, S. 332-338 (2019)14. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die Analyse der Phagozytose ist ein Mittel zur Beurteilung der Funktionalität menschlicher Primärphagozyten und zur Charakterisierung klinisch relevanter Formen. (A) Beispielhafter Vergleich von Monozyten von einem gesunden Spender und einem immunsuppressiven Patienten (nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation) phagozytosing ruhende Konidie für 0,5 h, 2 h und 4 h. (B) Phagozytose der ruhenden Pilzkonidie wurde für klinisch relevante Aspergillus- und Mucorales-Arten nach 2 h Co-Inkubation bestimmt. Die Daten wurden von 5 (Aspergillus) oder 3 (Mucorales) verschiedenen Spendern in jeweils 5 oder 3 unabhängigen Experimenten gewonnen. Fehlerbalken zeigen SD an. Abkürzungen: A. Aspergillus, L. Lichtheimia, M. Mucor, R. Rhizopus Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll stellt eine zytometrische Schnelle-Flow-Methode zur Messung der Wechselwirkung von A. fumigatus conidia mit einer großen Anzahl primärer menschlicher Leukozyten dar, was in gängigen mikroskopischen Protokollen nicht möglich ist. Die Bildgebung von Zellen mit einem Mikroskop und das manuelle Zählen von internalisierter Konidie ist umständlich und kann realistischerweise nur für ein paar hundert Zellen durchgeführt werden. Durchflusszytometrie überwindet dieses Problem, indem Tausende von Zellen innerhalb von Minuten gemessen werden. Eine Hürde, die beiden Ansätzen gemeinsam ist, ist die Unterscheidung von phagozytosiertem und anhaftender Konidie in bzw. auf Zellen. In der Mikroskopie wird der Farbstoff Calcofluorweiß häufig zur Färbung von anhaftenden Konidien verwendet, aber seine Verwendung ist auf Mikroorganismen mit einer Chitin-haltigen Zellwand beschränkt.

Dieses Protokoll hingegen verwendete unterschiedliche Fluorophore für die Charakterisierung von Interaktionsereignissen, die das Hinzufügen weiterer Zellmarker, wie z. B. der Lineage-Marker CD45, CD14 und CD66b, ermöglichen. So ist es auch möglich, die Phagozytose von Krankheitserregern durch Monozyten und Neutrophilen in einer einzigen Probe zu unterscheiden. Während die Wahl der Marker und Fluorophore zur Zellidentifikation an die Bedürfnisse des Experiments und die Kapazitäten des verfügbaren Zytometers angepasst werden kann, wird die Verwendung des in diesem Protokoll genannten spezifischen APC-Anti-FITC-Antikörpers zuverlässigsten Antikörper in unseren Händen.

Da Formaldehyd-fixierte Conidie nicht gleich gut verinnerlicht sind, werden native Sporen für Phagozytose-Assays empfohlen. Jedoch, native Conidia wird beginnen oder weiter Schwellung während der Ko-Inkubation mit menschlichen Leukozyten beginnen oder fortsetzen und schließlich keimen. Typischerweise keimt A. fumigatus conidia nach ca. 8-9 h in glukosehaltigen Medien bei 37 °C. Die Kombination von Anschwellenzeit und Koinkubationszeit mit Phagozyten sollte diesen Zeitrahmen nicht überschreiten, da die Keimung den Verlust von FITC auf der Konidiaoberfläche verursacht. Noch wichtiger ist, dass Keimlinge nicht mehr von Monozyten oder Neutrophilen phagozytosiert werden können. Stattdessen sammeln sich diese Phagozyten an und kleben an Keimen, die Zellcluster produzieren, die das Zytometer verstopfen, wenn nicht entfernt werden. In ähnlicher Weise neigen 4 h geschwollene Konidie dazu, Cluster untereinander und mit Zellen zu erzeugen. Oft können diese Cluster nicht mehr mechanisch getrennt werden und die Zellen im Inneren gehen für die zytometrische Analyse verloren.

Obwohl Gating am Anfang einfach und einfach ist, je mehr Conidia durch Zellen verinnerlicht werden, desto verschwommener kann das Gating werden. Die Verwendung von MOIs > 2 erhöht die Phagozytose zu den anfangs Zeitpunkten, aber Gating-Probleme können auch früher auftreten. Daher sollten MOIs sorgfältig mit den spezifischen Zellen und Krankheitserregern von Interesse bestimmt werden.

Eine Einschränkung dieses Protokolls liegt in der Dualität der Zellpopulation mit anhaftenden Conidie (FITC+ APC+), die auch Zellen mit anhaftenden sowie internalisierten Conidien beherbergen könnte. Eine Möglichkeit für weitere Diskriminierung ist die Anwendung der bildgebenden Durchflusszytometrie15, die eine visuelle Bildgebung aller im Durchflusszytometer gemessenen Zellen ermöglicht.

Durch die unspezifische FITC-Kennzeichnung der Konidialzellwand ist diese Methode leicht auf andere Pilze von Interesse übertragbar, wie z.B. klinisch relevante Schimmelpilze der Gattung Mucorales oder die Hefe Candida albicans. Darüber hinaus können auch zellwandtragende Bakterien FITC-gekennzeichnet werden. Die universelle Gegenfärbung mit dem Anti-FITC-Antikörper ermöglicht eine schnelle und einfache Messung der Phagozytose all dieser Krankheitserreger durch eine große Anzahl menschlicher Leukozyten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Frau Pia Stier für die ausgezeichnete technische Unterstützung. M. von Lilienfeld-Toal wird vom Zentrum für Sepsis-Kontrolle und Pflege (Bundesministerium für Bildung und Gesundheit, BMBF, FKZ 01E01002) und dem InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D) unterstützt. Thi Ngoc Mai Hoang wird von der Jenaer Schule für Mikrobielle Kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2) unterstützt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive foil Brand 701367
anti-CD14 V500 BD Biosciences 561391 clone M5E2
anti-CD45 BUV395 BD Biosciences 563792 clone HI30
anti-CD66b PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 562254 clone G10F5
anti-FITC APC ThermoFisher Scientific 17-7691-82 clone NAWESLEE
Cell culture plate, 12-well Greiner Bio-one 665180
Cell scraper Bioswisstech 800020
Cell strainer, 30 µm Miltenyi Biotech 130-098-458 SmartStrainer
Cytometer BD Biosciences LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)
Detergent Sigma Aldrich P1379 Tween 20, 0.01% in PBS
Drigalski spatula Carl Roth PC59.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED3SS-500g 2 mM in PBS
Erythrocyte lysis buffer 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA
Fetal Calf Serum (FCS) Biochrom AG S 0115 10% in RPMI 1640
Fluorescein isothiocyanate (FITC) Sigma Aldrich F3651-100MG 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution
Formaldehyd Carl Roth PO87.3 Histofix
Malt agar (1.5%) malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes
Na2CO3 Carl Roth 8563.1 0.1 M in PBS
Petri dish Greiner Bio-one 633180
Phosphat Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 189012-014 without Calcium, without Magnesium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 61870010 RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement
Rotator Miltenyi Biotech 130-090-753 MACSmix Tube Rotator
Round-bottom tube, 7.5 mL Corning REF 352008
Software for data acquisition and analysis BD Biosciences FACSDiva 8.0
V-bottom plate, 96 well Brand 781601 untreated surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
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Immunologie und Infektion Ausgabe 154 Phagozytose Durchflusszytometrie Aspergillus fumigatus Conidia FITC Anti-FITC-Antikörper Aspergillose
Messung der Phagozytose von <em>Aspergillus fumigatus</em> Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie
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Hartung, S., Rauh, C., Böttcher, S., Hoang, M. T. N., Jahreis, S., Rummler, S., Hochhaus, A., von Lilienfeld-Toal, M. Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (154), e60397, doi:10.3791/60397 (2019).

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