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Immunology and Infection

फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा एस्परगिलस फ्यूमिगटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को मापना

Published: December 7, 2019 doi: 10.3791/60397
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1,2, 1,2, 3, 2, 1,2
1Infections in Hematology and Oncology, Leibniz Institute for Infection Biology and Natural Product Research, 2Department for Hematology and Medical Oncology, Jena University Hospital, 3Institute for Transfusion Medicine, Jena University Hospital

Summary

यह प्रोटोकॉल फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके मानव प्राथमिक फैगोसाइट्स द्वारा एस्परगिलस फ्यूमिगेटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को मात्रात्मक रूप से मापने और केवल आसंजन से ल्यूकोसाइट्स तक कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को भेदभाव करने के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है।

Abstract

मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगाटस द्वारा इनवेसिव पल्मोनरी संक्रमण इम्यूनोसमझौता रोगियों के लिए एक बड़ा खतरा बन गया है। साँस कवक कोनिडिया (बीजाणु) मानव फेफड़ों के अल्वेली से सहज मोनोसाइट्स और/या न्यूट्रोफिल द्वारा फैगोसाइटोस किए जाने से साफ हो जाते हैं । यह प्रोटोकॉल फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइट (एफईसी) का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फागोसाइटोसिस का एक तेज और विश्वसनीय माप प्रदान करता है- मानव ल्यूकोसाइट्स के साथ सह-ऊष्मायन के लिए कोनिडिया लेबल और बाद में एक एंटी-फिटेक एंटीबॉडी के साथ प्रतिधुंधला करने के लिए आंतरिक और सेल-अनुयायी कोनिडिया के भेदभाव की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदे इसकी तेजी, ब्याज के अन्य सेल मार्कर के साइटोमेट्रिक विश्लेषण के साथ परख को संयोजित करने की संभावना, एक ही नमूने से मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल का एक साथ विश्लेषण और अन्य सेल दीवार-असर कवक या बैक्टीरिया के लिए इसकी प्रयोज्यता है। रोगोकोसाइट्स के प्रतिशत का निर्धारण रोगाणु की उग्रता का मूल्यांकन करने या रोगजनक वाइल्डटाइप और म्यूटेंट की तुलना करने के साथ-साथ रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए मानव ल्यूकोसाइट क्षमताओं की जांच के लिए इम्यूनोलॉजिस्ट के लिए माइक्रोबायोलॉजिस्ट को एक साधन प्रदान करता है।

Introduction

इनवेसिव पल्मोनरी एस्परगिलोसिस इम्यूनोमोडिएग किए गए रोगियों के लिए एक बड़ा खतरा है क्योंकि उपचार विकल्प सीमित हैं और केवल प्रारंभिक निदान पर सफल होते हैं, जिससे उच्च मृत्यु दर1हो जाती है। संक्रामक एजेंट मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगाटस के कोनिडिया (बीजाणु) हैं जो अधिकांश आवासों के लिए सर्वव्यापीहैं। कोनिडिया साँस ले रहे हैं, वायुमार्ग के माध्यम से गुजरती हैं और अंत में फेफड़ों के अल्वेली में प्रवेश कर सकती हैं। इम्यूनोसक्षम मनुष्यों में, इन कोनिडिया को जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे मोनोसाइट्स या मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल ग्रैनुलोसाइट्स द्वारा साफ किया जाता है, जो (फागोसाइटोज) लेते हैं और रोगजनकोंको पचातेहैं 3। मेजबान-रोगजनक बातचीत में रुचि होने पर माइक्रोबायोलॉजिस्ट और इम्यूनोलॉजिस्ट के लिए Phagocytosis महत्वपूर्ण है। टकराव के परख, जैसे ल्यूकोसाइट्स और कोनिडिया का सह-ऊष्मायन, अक्सर फ्लोरोसेइन या इसके डेरिवेटिव फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफईसी) द्वारा बीजाणुओं की लेबलिंग शामिल है। माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, आंतरिक फ्लोरोसेंट कोनिडिया की पहचान करना और संलग्न/अनुयायी कोनिडिया निर्धारित करना सीधा है, हालांकि यह दृष्टिकोण बोझिल है और वास्तविक रूप से कुछ सैकड़ों कोशिकाओं तक सीमित है4। हालांकि, प्रवाह साइटोमेट्री में जो आसानी से मिनटों के भीतर सैकड़ों हजारों कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है, फागोसाइटोस और अनुयायी कोनिडिया का अंतर बहुत महत्वपूर्ण है। इसलिए, कई प्रोटोकॉल ट्राइपैन ब्लू पर भरोसा करते हैं ताकि वह पालन करनेवाले5, 6,7,8से फिटेक-फ्लोरेसेंस को बुझा सके। एक अन्य दृष्टिकोण एहिडियम ब्रोमाइड और फिटेक के फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण का शोषण कर रहा है ताकि वे अनुयायी कोनिडिया9,10,11से हरे रंग के फ्लोरेसेंस के बजाय लाल रंग का उत्सर्जन कर सके । यदि विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, जैसा कि कुछ बैक्टीरिया के लिए मामला है, तो सेल-बाउंड कणों को सीधे12,13दाग दिया जा सकता है।

यहां, हम एक एंटी-फिटिक एंटीबॉडी के साथ-साथ कोशिकाओं को बीजाणुओं के लगाव और बातचीत की कमी के साथ मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा एफईसी-लेबल ए फ्यूमिगेटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस का जल्दी और मात्रात्मक आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। विधि आगे के सेल मार्कर के एक साथ प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए भी अनुमति देती है जिसे एक ही नमूने से मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल द्वारा फागोसाइटोसिस के अलग विश्लेषण के लिए नियोजित किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल कवक उपभेदों के लक्षण वर्णन के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, यहां प्रस्तुत जीनस मुकोरल्स से एस्परगिलस की कई प्रजातियां और अन्य मोल्ड) और उनके म्यूटेंट14 और फागोसाइट्स पर इम्यूनोलॉजिकल रिसर्च, जैसे इम्यूनोसमझौता व्यक्तियों से ल्यूकोसाइट्स।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में ट्रांसफ्यूजन मेडिसिन, जेना विश्वविद्यालय अस्पताल के लिए संस्थान से प्राप्त मानव बफी कोट और रोगियों से तैयार ताजा शिरारक्त का उपयोग शामिल है, दोनों नैतिकता समिति की मंजूरी 4357-03/15 के अनुसार दानदाताओं की लिखित सूचित सहमति के बाद ।

1. एस्परगिलस फ्यूमिगाटस कोनिडिया की तैयारी

  1. सीओ2के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए 1.5% माल्ट एगर पेट्री व्यंजन पर ए फ्यूमिगटटस उगाएं।
    सावधानी: ए धूमकेतु एक जैव सुरक्षा स्तर 2 सूक्ष्मजीव है और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग कर एक उपयुक्त सुविधा में संभाला जाना चाहिए और प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और एक फिल्टर मास्क पहने हुए ।
    नोट:प्लेट को पूरी तरह से कोनिडिया की हरी-ग्रेश परत के साथ कवर किया जाना चाहिए। सफेद संस्कृतियां स्पूरूलेट नहीं होती हैं। माल्ट एगर की संरचना: 4% (w/v) माल्ट निकालने, खमीर निकालने ०.४% (w/v), आगर १.५% (w/v), एक्वा dest ।
  2. कटाई कोनिडिया
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में कीटाणुनाशक के साथ एक कागज तौलिया गीला रखें और अस्थिर conidia के अतिवितरण को रोकने के लिए शीर्ष पर थाली डाल दिया ।
    2. फंगस के शीर्ष पर फॉस्फेट बफर्ड लवइन (पीबीएस) + 0.01% डिटर्जेंट के 10 मिलील जोड़ें, प्लेट पर तरल फैलाने और गहरे रंग के कोनिडिया को रगड़ने के लिए ड्रिगलस्की स्पैटुला का उपयोग करें। सफेद माइसेलियम को न हटाने के लिए सावधान रहें।
    3. किसी भी अवशिष्ट माइसेलियम को हटाने के लिए 30 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके 50 एमएल ट्यूब पर कोनिडिया निलंबन रखें।
    4. चरण 1.2.2 और 1.2.3 दोहराएं और उसी 50 मीटर ट्यूब में एकत्र करें।
    5. कमरे के तापमान पर 2,600 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए स्पिन करें।
    6. अलौकिक निकालें और बाँझ एक्वा dest के 20 mL में फिर से निलंबित।
    7. एक थोमा गिनती कक्ष के साथ conidia एकाग्रता निर्धारित करें।
      नोट:प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है और ढक्कन कसकर खराब होने के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक संग्रहीत कोनिडिया निलंबन।
  3. फ़ीसीसी लेबलिंग
    1. बाँझ 0.1 एम एनए2सीओ3 (पीबीएस में भंग) में फिटसी पाउडर का 0.1 एमएम समाधान तैयारकरें।
      सावधानी:FITC पाउडर खतरनाक है और दस्ताने, चश्मे और एक फिल्टर मास्क के साथ संभाला जाना चाहिए। स्थानीय नियमों के अनुसार अपशिष्ट एकत्र करें।
      नोट:इस दौरान कृत्रिम प्रकाश छोड़ दें और कोनिडिया से जुड़े निम्नलिखित चरण।
    2. 15 मीटर ट्यूब में फिटईसी समाधान के 5 एमएल में 1 x 108 (या उससे कम) कोनिडिया को फिर से निलंबित करें। एक रोटेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    3. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, 15 मीटर ट्यूब में 0.1 एम एनए2सीओ3 (फिटसी के बिना) में कोनिडिया को फिर से निलंबित करें। एक रोटेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए इनक्यूबेट।
      नोट:कोनिडिया की मात्रा की गणना करते समय दाग दिया जाए, धुंधला, सूजन और सभी आवश्यक धोने के चरणों के दौरान 70% तक का नुकसान ध्यान में रखें। यदि कोई रोटेटर उपलब्ध नहीं है, तो ऊष्मायन के दौरान निलंबन को तीन बार हिला दिया जाना चाहिए।
    4. धोने के लिए, निलंबन के लिए पीबीएस + 0.01% डिटर्जेंट के 10 mL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2,600 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए स्पिन करें।
    5. सुपरनेटेंट निकालें और पीबीएस + 0.01% डिटर्जेंट के 10 mL के साथ दो बार धोने दोहराएं।
  4. कोनिडिया की सूजन (वांछित नहीं होने पर छोड़ा जा सकता है)
    1. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) माध्यम + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के 5 मिलील में फिटेक लेबल और वांछित समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर में इनक्यूबेट (जैसे, 2 एच, 4 घंटे) को फिर से निलंबित करें।
      नोट:यदि कोई रोटेटर उपलब्ध नहीं है, तो निलंबन को ऊष्मायन के दौरान कम से कम हर 20 कमर को हिला दिया जाना चाहिए।
    2. निलंबन के लिए पीबीएस + 0.01% डिटर्जेंट के 10 mL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2,600 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए स्पिन करें।
    3. अधिनेता को हटादें और पीबीएस + 0.01% डिटर्जेंट के 10 mL के साथ दो बार धोलें।
    4. कोनिडिया के बड़े झुरमुटों को हटाने के लिए 30 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  5. कोनिडिया की फिक्सिंग (यदि वांछित नहीं है तो छोड़ा जा सकता है)
    1. फॉर्मलडिहाइड के 1 मिलील में फ़ेसीसी लेबल और सूजन कोनिडिया को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. निलंबन के लिए पीबीएस + 0.01% डिटर्जेंट के 10 mL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2,600 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए स्पिन करें।
    3. अधिनेता को हटादें और पीबीएस + 0.01% डिटर्जेंट के 10 mL के साथ दो बार धोलें।
      नोट:प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और अंधेरे में PBS में संग्रहीत conidia (ट्यूब एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे) 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह तक के लिए ।

2. मानव प्राथमिक ल्यूकोसाइट्स की तैयारी

  1. एक 50 मीटर ट्यूब में बफी कोट के 5 mL रखो। वैकल्पिक रूप से, एथिलीनडियामिनेटेट्रासेटिक एसिड (ईटीए) मोनोवेट (10 मिलील प्रति 50 मिलील ट्यूब) में तैयार ताजा मानव परिधीय शिरारक्त रक्त का उपयोग करें।
    सावधानी:मानव रक्त मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस और हेपेटाइटिस बी वायरस जैसे वायरस संचारित कर सकते हैं। लैब कोट और दस्ताने पहने बायोसेफ्टी कैबिनेट में हेपेटाइटिस बी हैंडल के खिलाफ टीका लगाए जाने के बाद ही संभालें ।
  2. एरिथ्रोसाइट लायसिस (ईएल) बफर के साथ ट्यूब को भरें, तीन बार उलटा करें और 5-8 मिन क्षैतिज रूप से इनक्यूबेट करें जब तक कि मिश्रण की दूधिया उपस्थिति स्पष्ट न हो जाए।
    नोट:कभी-कभी, रक्त को लगभग अधिक समय लग सकता है। उपस्थिति से जाओ। यह असामान्य नहीं है कि एक ही रक्त की दो ट्यूब अलग-अलग समय लेती हैं। एल बफर की संरचना: 0.15 एम एनएच4सीएल, 10 एमएम केसीओ3,0.1 मीटर ईडीटीए
  3. कमरे के तापमान पर 300 x ग्राम पर 10 न्यूनतम के लिए स्पिन करें। अधिस्थान त्यागें।
  4. पाइपिंग द्वारा एल बफर के 1 mL में गोली को फिर से निलंबित करें। फिर ईएल बफर का एक और 24 mL जोड़ें, और कई बार उलटा।
  5. कमरे के तापमान पर 300 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए स्पिन करें।
  6. अधिनेता को त्यागें और आरपीएमआई + 10% एफसीएस के 1 मिलील में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  7. एक Neubauer गिनती कक्ष के साथ सेल एकाग्रता निर्धारित करें।

3. फागोसाइटोसिस परख

  1. इनक्यूबेट 2 x 106 ल्यूकोसाइट्स और 4 x 106 फ़ेसीसी-लेबल कोनिडिया (संक्रमण की बहुलता = 2) 12-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट में आरपीएमआई + 10% एफसीएस के 1.5 मिलील में। नियंत्रण के रूप में, केवल कोशिकाओं (कोई कोनिडिया) और कोशिकाओं + अवेलेबल conidia शामिल हैं ।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें और वांछित समय के लिए इनक्यूबेट (जैसे, 0.5 एच, 2 एच या 4 घंटे)।
  3. ऊष्मायन के बाद, एक सेल स्क्रैपर के साथ फसल कोशिकाओं और एक 15 mL ट्यूब में डाल दिया।
  4. कमरे के तापमान पर 300 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए स्पिन करें।
  5. साइटोकिन विश्लेषण के लिए अधिनेत लीजिए या यदि नहीं चाहता था तो त्यागें। पीबीएस + 2 एमएम ईटीए के 100 माइक्रोन में प्रत्येक नमूने को फिर से निलंबित करें।

4. एंटीबॉडी धुंधला

  1. प्रत्येकनमूने के लिए, टेबल 1 के अनुसार, एपीसी एंटी-फिटेक एंटीबॉडी सहित एंटीबॉडी मिक्स के १०० माइक्रोन तैयार करें ।
  2. एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे प्लेट के एक अच्छी तरह से एक १०० μL नमूना रखो । धोने के लिए पीबीएस + 2 एमएम ईटीए के 150 माइक्रोन जोड़ें।
  3. रंग मुआवजे के लिए, 96-अच्छी तरह से वी बॉटम प्लेट के आगे के कुओं में प्रत्येक रंग के लिए 1 x 106 कोशिकाओं को रखें। कोशिकाओं का एक कुआं शामिल करें जो बिना दाग छोड़ दिया जाता है। धोने के लिए पीबीएस + 2 एमएम ईटीए के 150 माइक्रोन जोड़ें।
  4. चिपकने वाली पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें।
  5. कमरे के तापमान पर 300 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए स्पिन करें। पन्नी निकालें।
  6. सिंक या डिस्पोजेबल पेपर तौलिया पर केवल एक बार प्लेट को जल्दी और जबरदस्ती उलटा करके अधिनेत को त्यागें।
    नोट:दोहराएं या एक कागज पर थाली दस्तक जब तक सूखी नहीं है क्योंकि यह थाली से कोशिकाओं का एक बड़े पैमाने पर नुकसान में परिणाम होगा ।
  7. 100 माइक्रोन एंटीबॉडी मिश्रण में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  8. रंग मुआवजे के लिए, पीबीएस + 2 एमएम ईटीए के 100 माइक्रोन में संबंधित कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और एंटीबॉडी मिश्रण में उपयोग की जाने वाली राशि पर प्रत्येक अच्छी तरह से एक एंटीबॉडी जोड़ें।
  9. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 न्यूनतम के लिए एक चिपकने वाली पन्नी और इनक्यूबेट के साथ कवर करें।
  10. पन्नी निकालें। धोने के लिए प्रत्येक कुएं में पीबीएस + 2 एमएम ईटीए के 150 माइक्रोन जोड़ें। चिपकने वाली पन्नी से ढकदें।
  11. कमरे के तापमान पर 300 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए स्पिन करें। पन्नी निकालें। सिंक या डिस्पोजेबल पेपर तौलिया के ऊपर प्लेट को जल्दी और जबरदस्ती उलटा करके अधिनेत को त्यागें।
  12. पीबीएस + 2 एमएम ईटीए के 200 माइक्रोन में फिर से सस्पेंड करें और प्रत्येक कुएं से कोशिकाओं को एक अलग गोल बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि निलंबन में कोई सेल क्लस्टर नहीं हैं। अन्यथा क्लस्टर हटा दें।
    नोट:आंख को देखने के लिए पर्याप्त बड़ा है कि हर क्लस्टर संभावित साइटोमीटर रोकना करने के लिए काफी बड़ा है ।

5. फ्लो साइटोमेट्री

  1. फ्लो साइटोमीटर शुरू करें और इसे गर्म होने दें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  2. एक नया प्रयोग और सेटअप बनाएं और नमूनों को लेबल करें।
  3. पैरामीटर (एफएससी 250, एसएससी 250) और फ्लोरोफोरस एफईसी, एपीसी, बीयूवी395, V500, PerCP-Cy5.5 के लिए डिटेक्टर स्थापित करें।
  4. मुआवजा सेटअप
    1. खुला मुआवजा सेटअप।
    2. व्यक्तिगत रंगों का संकेत दें।
    3. नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग कर के अदाग छोड़ दिया या व्यक्तिगत दाग के साथ, पैमाने के भीतर सभी घटनाओं को शामिल करने के लिए पीएमटी डिटेक्टर वोल्टेज सेट ।
    4. प्रत्येक नियंत्रण की कम से कम 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
    5. फ्लोरोफोर्स के स्पिलओवर की गणना करने और प्रयोग की साइटोमीटर सेटिंग्स पर लागू करने के लिए क्षतिपूर्ति सेटअप का उपयोग करें।
  5. नमूना डेटा रिकॉर्ड करना
    1. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में एफएससी और एसएससी प्रदर्शित करें और ल्यूकोसाइट्स के चारों ओर गेट सेट करें।
    2. ल्यूकोसाइट गेट के आधार पर, डिस्प्ले डॉट प्लॉट एसएससी/सीडी45 और सीडी 45 + कोशिकाओं के लिए गेट कोनिडिया से अलग करने के लिए।
    3. एक डॉट प्लॉट CD14/CD66b और गेट मोनोसाइट्स (CD14+) और न्यूट्रोफिल (CD66b+) में सीडी45 + कोशिकाओं को अलग से प्रदर्शित करें ।
    4. डॉट प्लॉट एंटी-फिटेक/फिटसी में न्यूट्रोफिल प्रदर्शित करें।
    5. अवेलेबल कोनिडिया के साथ नमूने का उपयोग करके, एंटी-फिट्सी और फिटसी संकेतों के लिए क्वाड्रंट सेट करें, जिससे संबंधित क्वाड्रंट्स में अधिकतम 1% कोशिकाएं हो जाती हैं।
    6. मोनोसाइट गेट के लिए चरण 5.5.4 और 5.5.5 दोहराएं।
    7. ल्यूकोसाइट गेट में कम से कम 20,000 घटनाओं के साथ सभी नमूनों को रिकॉर्ड करें।

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Representative Results

मानव फागोसाइटिक कोशिकाओं द्वारा ए फ्यूमिगाटस कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को मापने में, वास्तविक आंतरिककरण और कोशिकाओं के लिए कोनिडिया के मात्र लगाव के बीच भेदभाव एक बाधा है, खासकर जब यह प्रवाह साइटोमेट्री जैसे उच्च थ्रूपुट तरीकों की बात आती है। इस बाधा को दूर करने के लिए, हम कोशिकाओं और कोनिडिया के सह-इनविटेशन से पहले फ्लोरोसेंट डायफ़ी के साथ शंकुके धुंधला होने के आधार पर एक तेज और विश्वसनीय प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसके बाद ऊष्मायन के बाद एपीसी-लेबल एंटी-फिट्सी एंटीबॉडी(चित्रा 1ए)के साथ एक प्रतिदाग के बाद। जैसा कि फिगर 1बीमें दिखाया गया है, एफईसी-लेबल वाले कोनिडिया को मानव मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल द्वारा फैगोसाइटोस किया जाता है जो कोशिकाओं को हरी झंडी प्रदान करते हैं। ये कोनिडिया एंटी-फिटेक एंटीबॉडी के लिए दुर्गम हैं और इसलिए एंटीबॉडी को बाध्य नहीं कर सकते और कोशिकाएं एपीसी निगेटिव (फिटसी +, एपीसी-) दिखाई देती हैं । गैर-बातचीत करने वाली कोशिकाएं फिटसी-लेबल कोनिडिया से हरी झंडी प्राप्त नहीं करती हैं और फिटसी-, एपीसी-बने हुए हैं। कुछ कोशिकाएं फिटसी-, एपीसी + दिखाई देती हैं। चूंकि एंटी-फिटेक एपीसी एंटीबॉडी को फिटसी-लेबल कोनिडिया के बिना कोशिकाओं को बांधने में सक्षम नहीं होना चाहिए, इसलिए इन घटनाओं को धुंधला कलाकृतियों माना जाता है। FITC लेबल conidia, जो कोशिकाओं से जुड़े हुए हैं, लेकिन आंतरिक नहीं हैं, कोशिकाओं को भी FITC के लिए सकारात्मक प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी विरोधी FITC एंटीबॉडी है कि इन कोशिकाओं को FITC और एपीसी (FITC +, APC +) के लिए डबल सकारात्मक बनाता है के लिए एक लक्ष्य प्रदान करते हैं । जब सूक्ष्म रूप से विश्लेषण किया जाता है, तो इस आबादी में केवल हमारे प्रयोगों में संलग्न कोनिडिया के साथ 20% कोशिकाएं होती हैं।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित एंटीबॉडी का उपयोग करना और चित्रा 1डीमें गेटिंग रणनीति का पालन करना, एफएससी और एसएससी विशेषताओं द्वारा मानव ल्यूकोसाइट्स का एक सामान्य गेटिंग पैन-ल्यूकोसाइट मार्कर सीडी45 द्वारा ल्यूकोसाइट्स और मुफ्त कोनिडिया के बाद किया जाता है। विशेष रूप से जब सूजन शंकुऔर/या लंबे ऊष्मायन समय का उपयोग कर, conidia प्रवाह साइटोमेट्री के समय लगभग सेल आकार तक पहुंच सकते है और इसलिए पूर्वाग्रह विश्लेषण । चूंकि मानव प्राथमिक मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल को अलग-अलग लेते हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल के लिए मोनोसाइट्स और सीडी66बी के लिए अच्छी तरह से स्थापित सेल वंश मार्कर CD14 के साथ धुंधला होने के आधार पर इन सेल आबादी का अलग से विश्लेषण करने की अनुमति देता है। phagocytosing और अनुयायी सेल आबादी के लिए गेटिंग अवेलेबल कोनिडिया के साथ नियंत्रण नमूनों के आधार पर किया जाता है जो न तो एक फिटसी और न ही एक एंटी-फिटेक एपीसी सिग्नल ले जाते हैं। जब एपीसी और फिटेक एक दूसरे के खिलाफ साजिश रची जाती है, तो क्वाड्रंट्स को इस तरह से सेट किया जाता है कि ब्याज के गेट में अधिकतम 1% कोशिकाओं की अनुमति दी जाती है।

कोनिडिया को आंतरिक मानव प्राथमिक phagocytes का प्रतिशत रक्तदाताओं के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकता है लेकिन यह भी इस तरह के ऊष्मायन समय और कोनिडिया की सूजन की स्थिति के रूप में प्रयोगात्मक कारकों पर निर्भर करता है । बीजाणु आंतरिककरण का पता पहले से ही 0.5 घंटे के सह-ऊष्मायन के बाद लगाया जा सकता है और समय के साथ बढ़ता है(चित्रा 2ए)। प्री-सूजन कोनिडिया को कम ऊष्मायन समय(चित्रा 2बी)पर भी आराम (सूजन नहीं) बीजाणुओं की तुलना में आसान लिया जाता है। यदि कोनिडिया फॉर्मलडिहाइड के साथ तय किए जाते हैं, तो देशी कोनिडिया(चित्रा 2सी)की तुलना में फागोसाइटोसिस कम हो जाता है।

अभिकर्मक प्रति नमूना μl
सीडी45 BUV395 1
सीडी14 V500 0.5
CD66b PerCP-Cy5.5 1.5
एंटी-फिटेक एपीसी 0.5
पीबीएस + 2 एमएम ईटीए 97
कुल 100

तालिका 1: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एंटीबॉडी मिश्रण। प्रत्येक अभिकर्ता की मात्रा प्रति नमूने (1 x 106 कोशिकाओं) का विश्लेषण करने के लिए माइक्रोलीटर के रूप में दी जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रवाह साइटोमेट्रिक फागोसाइटोसिस परख का सेटअप और विश्लेषण। (क)कोनिडिया और सेल तैयार करने और प्रतिदागन सहित प्रोटोकॉल की योजना। (ख)एफईसी एपीसी काउंटरदागिंग के खिलाफ एफईसी लेबल वाले कोनिडिया के फ्लो साइटोमेट्रिक डेटा की साजिश रचकर फागोसाइटोसिस का विश्लेषण किया जाता है । जिसके परिणामस्वरूप आबादी गैर-बातचीत ल्यूकोसाइट्स (एफईसी-, एपीसी-), अनुयायी कोनिडिया (फिटसी +, एपीसी +) और फागोसाइटोसाइट्स (फिट्सी +, एपीसी-) के साथ-साथ धुंधला कलाकृतियों (फिटैसी-, एपीसी +) के साथ ल्यूकोसाइट्स के प्रतिशत का संकेत देती है। (ग)3 विभिन्न दानदाताओं के साथ 3 विभिन्न प्रयोगों से डबल पॉजिटिव सेल आबादी (उनमें से दो डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया, एक एकल प्रदर्शन) सूक्ष्म रूप से आंतरिक और संलग्न केवल conidia के लिए गिना गया । (डी)ल्यूकोसाइट्स (सीडी45) का पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक डेटा की प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति, मोनोसाइट्स (सीडी14) और न्यूट्रोफिल (सीडी66बी) की पहचान करें और बातचीत करने वाली आबादी (फिटसी, एंटी-फिटिक) निर्धारित करें। यह आंकड़ा Hartung एट अल से संशोधित किया गया है, साइटोमेट्री ए, ९५: 3, पी 332-338 (२०१९)14। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मानव प्राथमिक phagocytes द्वारा कोनिडिया का फागोसाइटोसिस कई स्थितियों पर निर्भर करता है। (क)सह-ऊष्मायन समय के साथ आराम शंकुकोइंग कोनिटिया को आंतरिक कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ा । (ख)फागोसाइटोसिस में कोनिडायल सूजन समय के साथ वृद्धि हुई जब 0.5 घंटे(सी)देशी कोनिडिया के लिए सह-इनक्यूबेटेड फिक्स्ड कोनिडिया की तुलना में बेहतर फैगोसाइटोस किया गया था। 10(ए, बी)या 5(ए, बी)या 5(सी)स्वतंत्र प्रयोगों में 10 विभिन्न दानदाताओं (ए, बी) या 5 विभिन्न दानदाताओं(सी)से डेटा प्राप्त किया गया था । त्रुटि बार एसडी का संकेत देते हैं। यह आंकड़ा Hartung एट अल से संशोधित किया गया है, साइटोमेट्री ए, ९५: 3, पी 332-338 (२०१९)14। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फागोसाइटोसिस का विश्लेषण मानव प्राथमिक फैगोसाइट्स की कार्यक्षमता का आकलन करने और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मोल्डों की विशेषता का एक साधन है। (A)एक स्वस्थ दाता और एक इम्यूनोप्रेस्ड रोगी (हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद) से मोनोसाइट्स की अनुकरणीय तुलना 0.5 घंटे, 2 घंटे और 4 घंटे के लिए आराम कोनिडिया कोनिडिया कोनाइडिया(बी)फैगोसाइटोसिस को2 एच सह-ऊष्मायन के बाद चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक एस्परगिलस और मुकोरलप्रजातियों के लिए निर्धारित की गई थी। डेटा 5(Aspergillus)या 3(Mucorales)5 या 3 स्वतंत्र प्रयोगों में विभिन्न दाताओं से प्राप्त किए गए प्रत्येक। त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है एसडी संक्षिप्त: ए Aspergillus,एल Lichtheimia,एम Mucor,आर Rhizopus कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल बड़ी संख्या में प्राथमिक मानव ल्यूकोसाइट्स के साथ ए फ्यूमिगाटस कोनिडिया की बातचीत को मापने के लिए एक तेज प्रवाह साइटोमेट्रिक विधि प्रस्तुत करता है जो आम सूक्ष्म प्रोटोकॉल में संभव नहीं है। माइक्रोस्कोप और मैन्युअल रूप से आंतरिक कोनिडिया की गिनती करने वाली इमेजिंग कोशिकाएं बोझिल हैं और वास्तविक रूप से केवल कुछ सौ कोशिकाओं के लिए की जा सकती हैं। फ्लो साइटोमेट्री मिनटों के भीतर हजारों कोशिकाओं को मापने से इस समस्या पर काबू पा लेते हैं। दोनों दृष्टिकोणों के लिए आम बाधा क्रमशः कोशिकाओं में या उस पर फागोसाइटोस किए गए और अनुयायी कोनिडिया का गौरव है। माइक्रोस्कोपी में, रंग कैल्कोफ्लोर सफेद का उपयोग अक्सर अनुयायी कोनिडिया को धुंधला करने के लिए किया जाता है लेकिन इसका उपयोग चिटिन युक्त कोशिका दीवार वाले सूक्ष्मजीवों तक सीमित है।

इसके विपरीत इस प्रोटोकॉल ने बातचीत की घटनाओं के लक्षण वर्णन के लिए अलग फ्लोरोफोर्स का उपयोग किया जो आगे के सेल मार्कर को जोड़ने की अनुमति देता है, जैसे वंश मार्कर सीडी45, सीडी14 और सीडी66बी। इस प्रकार, एक ही नमूने में मोनोसाइट्स और न्यूट्रोफिल द्वारा रोगजनकों के फागोसाइटोसिस को भेदभाव करना भी संभव है। जबकि सेल पहचान के लिए मार्कर और फ्लोरोफोरस के विकल्प को प्रयोग की जरूरतों और उपलब्ध साइटोमीटर की क्षमताओं के अनुकूल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विशिष्ट एपीसी एंटी-फिटेक एंटीबॉडी के उपयोग की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह था हमारे हाथों में सबसे विश्वसनीय एंटीबॉडी।

चूंकि फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड कोनिडिया को समान रूप से अच्छी तरह से आंतरिक नहीं किया जाता है, इसलिए फागोसाइटोसिस परख के लिए देशी बीजाणुओं की सिफारिश की जाती है। हालांकि, देशी कोनिडिया मानव ल्यूकोसाइट्स के साथ सह-ऊष्मायन के दौरान सूजन शुरू या जारी रखेगा और अंततः अंकुरित होगा। आमतौर पर, ए फ्यूमिगाटस कोनिडिया ग्लूकोज युक्त मीडिया में लगभग 8-9 घंटे के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर अंकुरित होता है। phagocytes के साथ सूजन समय और सह ऊष्मायन समय का संयोजन इस समय सीमा से अधिक नहीं होना चाहिए क्योंकि अंकुरण कोनिडिया सतह पर फिटैसी के नुकसान का कारण बनता है। अधिक महत्वपूर्ण, मोनोसाइट्स या न्यूट्रोफिल द्वारा अब अंकुरण को नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय, ये फैगोसाइट्स चारों ओर जमा होते हैं और अंकुरण से चिपके रहते हैं जो सेल समूहों का उत्पादन करते हैं जो साइटोमीटर को रोकते हैं, यदि हटाया नहीं जाता है। इसी तरह, 4 एच सूजन कोनिडिया आपस में और कोशिकाओं के साथ समूह उत्पन्न करते हैं। अक्सर इन समूहों को यांत्रिक रूप से अब अलग नहीं किया जा सकता है और भीतर की कोशिकाएं प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए खो जाती हैं।

हालांकि गेटिंग शुरुआत में सीधा और आसान है, अधिक कोनिडिया कोशिकाओं द्वारा आंतरिक हैं, धुंधला गेटिंग बन सकता है। MOIs > 2 का उपयोग प्रारंभिक समय बिंदुओं पर phagocytosis बढ़ जाती है, लेकिन गेटिंग मुद्दों पहले के रूप में अच्छी तरह से पैदा हो सकता है । इसलिए, एमओआई को विशिष्ट कोशिकाओं और रुचि के रोगजनकों के साथ सावधानीपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा अनुयायी कोनिडिया (FITC + APC +) के साथ सेल आबादी के द्वंद्व में है जो अनुयायी के साथ-साथ आंतरिक कोनिडिया के साथ कोशिकाओं को भी शरण दे सकती है। आगे भेदभाव के लिए एक संभावना इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री15 का आवेदन है जो प्रवाह साइटोमीटर में मापी गई सभी कोशिकाओं की दृश्य इमेजिंग की अनुमति देता है।

कोनिडायल सेल वॉल के अविशिष्ट फिटसी लेबलिंग के कारण, यह विधि आसानी से ब्याज के अन्य कवक जैसे जीनस म्यूकोरल्स या खमीर कैंडिडा एल्बिकानके नैदानिक रूप से प्रासंगिक मोल्डों के लिए हस्तांतरणीय है। इसके अलावा, सेल-वॉल असर बैक्टीरिया को भी फिटसी-लेबल किया जा सकता है। एंटी-फिटेक एंटीबॉडी के साथ सार्वभौमिक प्रतिदागन बड़ी संख्या में मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा इन सभी रोगजनकों के फागोसाइटोसिस के तेज और आसान माप की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए श्रीमती पिया Stier शुक्रिया अदा करते हैं । एम वॉन लिलिएनफेल्ड-टॉल को केंद्र द्वारा सेप्सिस कंट्रोल एंड केयर (जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ एजुकेशन एंड हेल्थ, बीएमबीएफ, एफकेजेड 01E01002) और इंफेनोग्नोस्टिक्स रिसर्च कैंपस (बीएमबीएफ, एफकेजेड 13GW0096D) द्वारा समर्थित किया जाता है। थी Ngoc माई होआंग माइक्रोबियल कम्युनिकेशन के जेना स्कूल द्वारा समर्थित है (ड्यूश Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive foil Brand 701367
anti-CD14 V500 BD Biosciences 561391 clone M5E2
anti-CD45 BUV395 BD Biosciences 563792 clone HI30
anti-CD66b PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 562254 clone G10F5
anti-FITC APC ThermoFisher Scientific 17-7691-82 clone NAWESLEE
Cell culture plate, 12-well Greiner Bio-one 665180
Cell scraper Bioswisstech 800020
Cell strainer, 30 µm Miltenyi Biotech 130-098-458 SmartStrainer
Cytometer BD Biosciences LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)
Detergent Sigma Aldrich P1379 Tween 20, 0.01% in PBS
Drigalski spatula Carl Roth PC59.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED3SS-500g 2 mM in PBS
Erythrocyte lysis buffer 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA
Fetal Calf Serum (FCS) Biochrom AG S 0115 10% in RPMI 1640
Fluorescein isothiocyanate (FITC) Sigma Aldrich F3651-100MG 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution
Formaldehyd Carl Roth PO87.3 Histofix
Malt agar (1.5%) malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes
Na2CO3 Carl Roth 8563.1 0.1 M in PBS
Petri dish Greiner Bio-one 633180
Phosphat Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 189012-014 without Calcium, without Magnesium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 61870010 RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement
Rotator Miltenyi Biotech 130-090-753 MACSmix Tube Rotator
Round-bottom tube, 7.5 mL Corning REF 352008
Software for data acquisition and analysis BD Biosciences FACSDiva 8.0
V-bottom plate, 96 well Brand 781601 untreated surface

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References

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 154 फागोसाइटोसिस फ्लो साइटोमेट्री एस्परगिलस फ्यूमिगाटस,कोनिडिया फिटेक एंटी-फिटेक एंटीबॉडी एस्परगिलोसिस
फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके मानव ल्यूकोसाइट्स द्वारा <em>एस्परगिलस फ्यूमिगटस</em> कोनिडिया के फागोसाइटोसिस को मापना
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Hartung, S., Rauh, C., Böttcher, S., Hoang, M. T. N., Jahreis, S., Rummler, S., Hochhaus, A., von Lilienfeld-Toal, M. Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (154), e60397, doi:10.3791/60397 (2019).

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