Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقه سريعة وموثوق بها لقياس كثرة المحببات من الرشاشيات التبخير كونيديا بواسطة الخلايا الاساسيه البشرية باستخدام التدفق الخلوي والتمييز بين ندره الكونيديا من مجرد التصاق إلى الكريات البيضاء.
Abstract
العدوى الرئوية الغازية من قبل العفن الرشاشيات التبخير يشكل تهديدا كبيرا للمرضي المناعي. يتم مسح الكونيديا الفطرية المستنشقة (الجراثيم) من الحويصلات الرئوية البشرية بواسطة الخلايا الفطرية و/أو العدلات. يوفر هذا البروتوكول قياسا سريعا وموثوقا به لندره الكريات بواسطة التدفق الخلوي باستخدام فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC)-المسمي كونيديا لاحتضان المشتركة مع الكريات البيضاء البشرية والمضادة اللاحقة مع الأضداد المناهضة لل FITC للسماح بالتمييز الداخلي والخلوي كونيديا. المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي توفر خدمه ، وامكانيه الجمع بين المقايسة مع تحليل الخلوية من علامات الخلية الأخرى من الفائدة ، والتحليل في وقت واحد من الخلايا الاحاديه والعدلات من عينه واحده وقابليتها للتطبيق علي الخلايا الأخرى التي تحمل الجدار الفطريات أو البكتيريا. تحديد النسب المئوية من الكريات البيضاء فاجوسيتوسينج يوفر وسيله لعلماء الاحياء المجهرية لتقييم ضراوة من الممرض أو للمقارنة بين الأنواع البرية الممرض والمسوخ وكذلك لعلماء المناعة للتحقيق في قدرات الكريات البيضاء البشرية لمكافحه مسببات الامراض.
Introduction
داء الرشاشيات الرئوي الغازي يشكل تهديدا كبيرا للمرضي الذين يعانون من نقص المناعة لان خيارات العلاج محدوده وناجحه فقط عند التشخيص المبكر ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدلات الوفاات1. العوامل المعدية هي كونيديا (جراثيم) من العفن الرشاشيات التبخير التي هي في كل مكان إلى معظم الموائل2. كونيديا يتم استنشاقها ، تمر عبر الخطوط الجوية ويمكن ان تدخل في النهاية الحويصلات الهوائية الرئوية. في البشر المناعي ، يتم مسح هذه الكونيديا من قبل الخلايا المناعية الفطرية مثل الكريات الوحيدة أو الضامة والمحببة العدلات ، التي تتناول (فاجوسيتوسي) وهضم مسببات الامراض3. كثرة المحببات مهمة لعلماء الاحياء المجهرية وعلماء المناعة بالمثل عند المهتمين بالتفاعلات بين المضيف والممرض. اختبارات المواجهة ، مثل المشاركة في حضانة الكريات البيضاء والكونيديا ، وغالبا ما تشمل وضع العلامات من الجراثيم بواسطة فلوريسئين أو مشتقه فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC). باستخدام المجهر ، فمن الواضح لتحديد الكونيديا الفلورية المستوعبة وتحديد الكونيديا المرفقة/الملتصقة ، علي الرغم من ان هذا النهج هو مرهق ومقيد واقعيا إلى بضع مئات من الخلايا4. ومع ذلك ، في التدفق الخلوي الذي يسمح بسهوله تحليل مئات آلاف من الخلايا في غضون دقائق ، تلطيخ التفاضلية من الكونيديا والملتصقة أمر حيوي. ولذلك ، العديد من البروتوكولات تعتمد علي الترلون الأزرق لإخماد fitc-الفلورية من الكونيديا الملتصقة5،6،7،8. نهج آخر هو استغلال الطاقة بالرنين الفلوري نقل بروميد ايثيديوم و fitc لتنبعث منها الأحمر بدلا من الفلورية الخضراء من تمسك كونيديا9,10,11. إذا كانت الأجسام المضادة المحددة متوفرة ، كما هو الحال بالنسبة لبعض البكتيريا ، يمكن ان تكون الجزيئات المرتبطة بالخلايا ملطخه مباشره ب12،13.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتقييم بسرعة وكميه كثرة المحببات من FITC-المسمي ا. تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية جنبا إلى جنب مع المرفق من الجراثيم إلى الخلايا وعدم التفاعل من خلال توظيف الوفيكوسيانين (APC)-المضادة لل fitc الأجسام. كما يسمح الأسلوب للتحليل الخلوي تدفق في وقت واحد من علامات الخلية الأخرى التي يمكن استخدامها لتحليل منفصلة من كثرة الخلايا الاحاديه والعدلات من نفس العينة.
يمكن تطبيق البروتوكول لتوصيف سلالات الفطرية (علي سبيل المثال ، عده أنواع من الرشاشيات وغيرها من قوالب من جنس mucorales المقدمة هنا) والمسوخ بهم14 والبحوث المناعية علي البالعات ، مثل الكريات البيضاء من الافراد المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويشمل هذا البروتوكول استخدام معاطف بافي البشرية التي تم الحصول عليها من معهد طب نقل الدم ، ومستشفي جامعه جينا والدماء الوريدية الطازجة المسحوبة من المرضي ، سواء بعد موافقه خطيه مستنيرة من المانحين وفقا لموافقه لجنه الأخلاقيات 4357-03/15.
1. اعداد الرشاشيات تبخير كونيديا
- تنمو ا. تبخير علي 1.5 ٪ أجار الشعير اطباق بيتري لمده 5 أيام في 37 درجه مئوية دون CO2.
تحذير: ا. تبخير هو مستوي السلامة البيولوجية 2 الكائنات المجهرية ويجب التعامل معها في مرفق مناسب باستخدام خزانه السلامة الاحيائيه وارتداء معطف المختبر والقفازات وقناع فلتر.
ملاحظه: يجب ان تكون مغطاه لوحه تماما مع طبقه خضراء رمادية من كونيديا. الثقافات البيضاء لا الرياضية. تكوين أجار الشعير: 4 ٪ (ث/ف) استخراج الشعير ، الخميرة استخراج 0.4 ٪ (ث/ف) ، أجار 1.5 ٪ (ث/ف) ، اكوا الأعلى. - حصاد كونيديا
- ضع منشفه ورقيه مبلله بالمطهر في خزانه السلامة الاحيائيه ووضع الصفيحة علي القمه لمنع الإفراط في التوزيع لكونيديا المتطايرة.
- أضافه 10 مل من الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) + 0.01 ٪ المنظفات علي راس الفطريات ، واستخدام ملعقة Drigalski لنشر السائل علي لوحه وفرك قباله الكونيديا الملونة الداكنة. يجب الحرص علي عدم أزاله mycelium الأبيض.
- وضع تعليق كونيديا إلى أنبوب 50 mL باستخدام مصفاه الخلية 30 μm لأزاله اي mycelium المتبقية.
- كرر الخطوات 1-2-2 و 1.2.3 وجمع في نفس أنبوب 50 mL.
- تدور لمده 5 دقائق في 2,600 x g في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله سوبرناتانت وأعاده التعليق في 20 مل من اكوا المعقمة الأعلى.
- تحديد تركيز كونيديا مع غرفه العد Thoma.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاهنا والتعليق الكونيديا المخزن لمده تصل إلى 1 شهر في 4 درجه مئوية مع الغطاء مشدود باحكام.
- الوسم FITC
- اعداد محلول 0.1 mM من مسحوق FITC في العقيمة 0.1 M Na2CO3 (المذاب في تلفزيوني).
تحذير: مسحوق fitc الخطرة وينبغي التعامل مع القفازات ، نظارات واقيه وقناع فلتر. جمع النفايات وفقا للوائح المحلية.
ملاحظه: حذف الضوء الاصطناعي خلال هذا والخطوات التالية التي تنطوي علي كونيديا. - أعاده التعليق 1 × 108 (أو اقل) كونيديا في 5 مل من محلول fitc في أنبوب 15 مل. احتضان لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية في المدورة.
- للسيطرة السلبية ، أعاده التعليق كونيديا في 0.1 M Na2CO3 (بدون fitc) في أنبوب 15 مل. احتضان لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية في المدورة.
ملاحظه: عند حساب كميه الكونيديا لتكون ملطخه ، وتاخذ في الاعتبار خسارة تصل إلى 70 ٪ خلال تلطيخ ، وتورم وجميع الخطوات اللازمة الغسيل. إذا لم يتوفر المدورة ، يجب ان تهتز التعليق ثلاث مرات اثناء الحضانة. - للغسيل ، أضافه 10 مل من تلفزيوني + 0.01 ٪ المنظفات للتعليق وتدور لمده 5 دقائق في 2,600 x g في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله ماده طافي وتكرار الغسيل مرتين مع 10 مل من تلفزيوني + 0.01 ٪ المنظفات.
- اعداد محلول 0.1 mM من مسحوق FITC في العقيمة 0.1 M Na2CO3 (المذاب في تلفزيوني).
- تورم في الكونيديا (قد يتم حذفه إذا لم يكن مرغوبا فيه)
- أعاده التعليق FITC المسمي كونيديا في 5 مل من روزويل بارك النصب التذكاري معهد (RPMI) متوسط + 10 ٪ الجنين الساق المصل (FCS) واحتضان في المدورة في 37 درجه مئوية للوقت المطلوب (علي سبيل المثال ، 2 ح ، 4 ح).
ملاحظه: إذا لم يتوفر المدور ، يجب ان تهتز التعليق علي الأقل كل 20 دقيقه اثناء الحضانة. - أضافه 10 مل من تلفزيوني + 0.01 ٪ المنظفات للتعليق وتدور لمده 5 دقائق في 2,600 x g في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله ماده طافي ويغسل مرتين مع 10 مل من المنظفات + 0.01 ٪.
- تصفيه من خلال مصفاه الخلية 30 μm لأزاله كتل كبيره من كونيديا.
- أعاده التعليق FITC المسمي كونيديا في 5 مل من روزويل بارك النصب التذكاري معهد (RPMI) متوسط + 10 ٪ الجنين الساق المصل (FCS) واحتضان في المدورة في 37 درجه مئوية للوقت المطلوب (علي سبيل المثال ، 2 ح ، 4 ح).
- تحديد كونيديا (قد يتم حذفه إذا لم يكن مرغوبا فيه)
- أعاده التعليق FITC المسمية وتورم كونيديا في 1 مل من الفورمالديهايد واحتضان لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
- أضافه 10 مل من تلفزيوني + 0.01 ٪ المنظفات للتعليق وتدور لمده 5 دقائق في 2,600 x g في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله ماده طافي ويغسل مرتين مع 10 مل من المنظفات + 0.01 ٪.
ملاحظه: يمكن ان يكون البروتوكول متوقفا هنا والكونيديا المخزنة في النظام التلفزيوني في الظلام (أنبوب ملفوفه في رقائق ألومنيوم) لمده تصل إلى 1 أسبوع في 4 درجه مئوية.
2. اعداد الكريات البيضاء الاساسيه البشرية
- وضع 5 مل من معطف بافي في أنبوب 50 mL. بدلا من ذلك ، استخدم الدم الوريدي المحيطي الإنسان الطازجة المسحوبة في حمض ايثيلنديدياتيتاتاتاستيك (أدتا) monovettes (10 مل لكل أنبوب 50 mL).
تحذير: قد ينقل الدم البشري فيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية وفيروس التهاب الكبد B. التعامل فقط بعد تطعيمه ضد التهاب الكبد b. التعامل في خزانه السلامة الاحيائيه يرتدي معطف المختبر والقفازات. - ملء أنبوب مع كريات تحلل (EL) العازلة ، وعكس ثلاث مرات واحتضان لمده 5-8 دقيقه أفقيا حتى ظهور حليبي من الخليط يتحول واضحة.
ملاحظه: في بعض الأحيان ، قد يستغرق الدم وقتا أطول لlyse. اذهب بالمظهر ليس من غير المالوف ان اثنين من أنابيب من نفس الدم تاخذ أوقات مختلفه لlyse. تكوين العازلة EL: 0.15 M NH4Cl ، 10 ملم khco3، 0.1 mm أدتا - تدور لمده 10 دقيقه في 300 x g في درجه حرارة الغرفة. تجاهل الخارقة.
- أعاده تعليق بيليه في 1 مل من العازلة EL عن طريق التنضيد. ثم أضافه آخر 24 مل من العازلة EL ، وعكس عده مرات.
- تدور لمده 5 دقائق في 300 x g في درجه حرارة الغرفة.
- تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق الخلايا في 1 مل من rpmi + 10 ٪ FCS.
- تحديد تركيز الخلية مع دائره العد نيوبوير.
3. فحص كثرة الكريات
- احتضان 2 × 106 الكريات البيضاء و 4 × 106 fitc-المسمي كونيديا (تعدد العدوى = 2) في 1.5 مل من rpmi + 10% FCS في لوحه ثقافة خليه 12 بئر. كما الضوابط ، وتشمل الخلايا فقط (لا كونيديا) والخلايا + كونيديا غير مسماه.
- مكان في حاضنه CO2 ترطيب في 37 درجه مئوية واحتضان للفترة المطلوبة من الزمن (علي سبيل المثال ، 0.5 h ، 2 h أو 4 h).
- بعد الحضانة ، حصاد الخلايا مع مكشطه الخلية ووضعها في أنبوب 15 مل.
- تدور لمده 5 دقائق في 300 x g في درجه حرارة الغرفة.
- جمع ماده طافي لتحليل السايسيسين أو تجاهل إذا لم يكن مطلوبا. أعاده تعليق كل عينه في 100 μL من تلفزيوني + 2 مم أدتا.
4. تلطيخ الأجسام المضادة
- لكل عينه ، أعد 100 μL من مزيج الأجسام المضادة ، بما في ذلك الأجسام المضادة لمكافحه FITC APC ، وفقا للجدول 1.
- وضع عينه 100 μL في بئر واحده من لوحه الخامس السفلي 96 جيدا. أضافه 150 μL من تلفزيوني + 2 مم أدتا للغسيل.
- لتعويض اللون ، ضع 1 × 106 خلايا لكل لون في مزيد من الآبار من اللوحة السفلي 96-بئر V. وتشمل بئر من الخلايا التي تركت غير ملطخه. أضافه 150 μL من تلفزيوني + 2 مم أدتا للغسيل.
- تغطيه لوحه مع رقائق لاصقه.
- تدور لمده 5 دقائق في 300 x g في درجه حرارة الغرفة. أزاله إحباط.
- تجاهل ماده طافي بسرعة وبقوة عكس لوحه مره واحده فقط علي بالوعة أو منشفه ورقيه يمكن التخلص منها.
ملاحظه: لا تكرر أو تدق لوحه علي ورقه حتى تجف لان هذا سوف يؤدي إلى فقدان ضخمه من الخلايا من لوحه. - أعاده تعليق الخلايا في مزيج الأجسام المضادة 100 μL ، وتخلط جيدا عن طريق التنضيد.
- لتعويض اللون ، أعاده تعليق الخلايا المعنية في 100 μL من تلفزيوني + 2 مم أدتا وأضافه جسم واحد إلى كل بئر في نفس الكمية المستخدمة في مزيج الأجسام المضادة.
- غطيها بورق لاصق وحضن لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
- أزاله إحباط. أضافه 150 μL من تلفزيوني + 2 مم أدتا لكل بئر للغسيل. غطيها بورق لاصق.
- تدور لمده 5 دقائق في 300 x g في درجه حرارة الغرفة. أزاله إحباط. تجاهل ماده طافي بسرعة وبقوة عكس لوحه علي بالوعة أو منشفه ورقيه يمكن التخلص منها.
- أعاده التعليق في 200 μL من تلفزيوني + 2 مم أدتا ونقل الخلايا من كل بئر إلى أنبوب أسفل جولة منفصلة. تاكد من عدم وجود كتل خلايا في التعليق. أزاله الكتل خلاف ذلك.
ملاحظه: كل كتله كبيره بما يكفي للعين لرؤية كبيره بما فيه الكفاية لتسد المحتملة المضخم.
5. تدفق الخلوي
- بدء تدفق المضخم الخلوي والسماح لها الإحماء. بدء تشغيل برنامج الاستحواذ.
- إنشاء تجربه جديده واعداد وتسميه العينات.
- اعداد المعلمات (FSC 250 ، SSC 250) وكاشفات للكشف عن الفلوروبيورس FITC ، APC ، BUV395 ، V500 ، PerCP-Cy 5.5.
- اعداد التعويض
- فتح اعداد التعويض.
- الاشاره إلى ألوان الفردية.
- باستخدام خلايا التحكم اليسار غير ملطخه أو مع الصبغات الفردية ، تعيين الفولتية كاشف PMT لتشمل جميع الاحداث داخل النطاق.
- تسجيل ما لا يقل عن 10,000 الاحداث من كل عنصر تحكم.
- استخدم اعداد التعويض لحساب امتداد الفلوريد وتطبيقه علي إعدادات المقياس المضخم للتجربة.
- تسجيل بيانات العينة
- عرض FSC و SSC في برنامج الاستحواذ وتعيين بوابه حول الكريات البيضاء.
- استنادا إلى بوابه الكريات البيضاء ، عرض مؤامرة نقطه SSC/CD45 وبوابه ل CD45 + الخلايا للفصل من كونيديا.
- عرض CD45 + الخلايا في مؤامرة نقطه CD14/CD66b والبويضات بوابه (CD14 +) و العدلات (CD66b +) بشكل منفصل.
- عرض العدلات في مؤامرة نقطه مكافحه FITC/FITC.
- باستخدام العينة ذات الكونيديا غير المسمية ، اضبط الأرباع للإشارات المضادة للFITC و FITC ، مما يسمح بحد اقصي 1% من الخلايا في الأرباع الخاصة بكل منها.
- كرر الخطوات 5.5.4 و5.5.5 لبوابه الخلايا الاحاديه.
- تسجيل جميع العينات مع ما لا يقل عن 20,000 الاحداث في بوابه الكريات البيضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في قياس ندره الكريات ا. تبخير كونيديا بواسطة خلايا الإنسان البشرية ، التمييز بين الاستيعاب الداخلي الحقيقي ومجرد التعلق كونيديا إلى الخلايا هو عقبه ، وخصوصا عندما يتعلق الأمر بطرق عاليه الانتاجيه مثل تدفق الخلوي. من أجل التغلب علي هذه العقبة ، ونحن نقدم بروتوكول سريع وموثوق بها علي أساس تلطيخ كونيديا مع الصبغة الفلورية FITC قبل المشاركة في الحضانة من الخلايا والكونيديا ، تليها تلطيخ مع المضادة لل APC المسمي مكافحه الفتنه بعد الحضانة (الشكل 1ا). كما هو مبين في الشكل 1ب، fitc-المسمي كونيديا هي مبتلع بواسطة الخلايا الوحيدة البشرية و العدلات التي توفر اشاره خضراء للخلايا. هذه الكونيديا لا يمكن الوصول اليها للأجسام المضادة لل FITC ، التالي ، لا يمكن ربط الأضداد وتظهر الخلايا APC السلبية (FITC + ، APC-). الخلايا غير المتفاعلة لا تكتسب اشاره خضراء من كونيديا المسمي FITC وتبقي FITC-، APC-. تظهر خلايا قليله FITC-، APC +. نظرا لان الأجسام المضادة لمكافحه FITC APC لا ينبغي ان تكون قادره علي ربط الخلايا دون كونيديا المسمي FITC ، تعتبر هذه الاحداث التحف تلطيخ. FITC المسمي كونيديا ، والتي تعلق علي الخلايا ولكن ليس المستوعبة ، وجعل الخلايا أيضا ايجابيه لل FITC ولكن أيضا توفير هدف لمكافحه FITC الأجسام المضادة التي تجعل هذه الخلايا الايجابيه مزدوجة ل FITC و APC (FITC + ، APC +). عندما حللت مجهريا, احتوي هذا السكان حتى 20% من خلايا مع كونيديا مرفقه فقط في تجاربنا.
باستخدام الأجسام المضادة الموصوفة في هذا البروتوكول واتباع استراتيجية الفصل في الشكل 1D، يتم تعقب الخلايا الكريات البيضاء البشرية من قبل FSC وخصائص SSC بفصل الكريات البيضاء والكونيديا الحرة بواسطة علامة الكريات البيضاء CD45. خصوصا عند استخدام تورم كونيديا و/أو فترات الحضانة الطويلة ، كونيديا يمكن ان تصل إلى حجم الخلية تقريبا في وقت التدفق الخلوي وتحليل التحيز التالي. منذ الخلايا الوحيدة الاساسيه البشرية والعدلات تناول كونيديا بشكل مختلف ، يسمح هذا البروتوكول لتحليل بشكل منفصل هذه الخلايا السكانية علي أساس تلطيخ مع علامات سلاله الخلايا الراسخة CD14 للخلايا الوحيدة و CD66b ل العدلات. يتم النابضة لسكان الخلايا اللزجة والملتصقة استنادا إلى عينات التحكم مع كونيديا غير المسمية التي تحمل لا FITC ولا اشاره APC مكافحه FITC. عندما يتم رسم APC و FITC ضد بعضها البعض ، يتم تعيين الأرباع بطريقه تسمح بحد اقصي 1 ٪ من الخلايا في بوابات الفائدة.
ويمكن ان تكون النسبة المئوية للخلايا الاساسيه البشرية الداخلية الكونيدياه متغيرة للغاية بين المتبرعين بالدم ولكنها تعتمد أيضا علي عوامل تجريبية مثل وقت الحضانة وتورم حاله الكونيديا. يمكن الكشف عن تدخيل البوغ بعد 0.5 h من الاحتضان المشترك بالفعل ويزيد مع مرور الوقت (الشكل 2ا). وتؤخذ الكونيديا المنتفخة قبل التورم بشكل أسهل من الجراثيم التي يتم الراحة فيها (وليست متورمة) حتى في أوقات الحضانة القصيرة (رقم 2ب). إذا تم إصلاح كونيديا مع الفورمالديهايد ، يتم تقليل ندره الكريات مقارنه بالكونيديا الاصليه (الشكل 2ج).
| كاشف | ميكرولتر لكل عينه |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0.5 |
| CD66b PerCP-Cy 5.5 | 1.5 |
| ناقله افراد مصفحه مضاده للFITC | 0.5 |
| الاذاعه التلفزيونية + 2 مم أدتا | 97 |
| مجموع | 100 |
الجدول 1: مزيج الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي. وتعطي كميات من كل كاشف كما ميكروليتر لكل عينه (1 × 106 خلايا) ليتم تحليلها.
الشكل 1: اعداد وتحليل فحص كثرة الكريات الخلوية المتدفقة. (ا) مخطط البروتوكول بما في ذلك الكونيديا واعداد الخلايا والتلوين المضاد. (ب) يتم تحليل ندره المحببات عن طريق التامر للبيانات تدفق الخلوية من fitc-المسمي كونيديا ضد مكافحه FITC APC مضاده للتلوين. السكان الناتجة تشير إلى نسب مئوية من الكريات البيضاء غير المتفاعلة (fitc-، apc-) ، والكريات البيضاء مع كونيديا ملتصقة (fitc + ، apc +) والكريات البيضاء فاجوسيتوسينج (fitc + ، apc-) وكذلك تلطيخ التحف (fitc-، apc +). (ج) عدد الخلايا الايجابيه المزدوجة من 3 تجارب مختلفه مع 3 جات مانحه مختلفه (اجري اثنان منها بالتكرارات ، واحده منها أجريت واحده) تم احتسابها مجهريا لاستيعابها وإرفاقها كونيديا فقط. (د) استراتيجية تمثيليه لبيانات التدفق الخلوي للكشف عن الكريات البيضاء (CD45) ، وتحديد الخلايا الاحاديه (CD14) و العدلات (CD66b) وتحديد السكان المتفاعلين (fitc ، المضادة للfitc). وقد تم تعديل هذا الرقم من هارتونغ وآخرون ، الخلوي A ، 95:3 ، ص. 332-338 (2019)14. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: كثرة الكريات الكونيدياه بالخلايا الاساسيه البشرية تعتمد علي عده شروط. (ا) زادتالنسبة المئوية للخلايا الداخلية لكونيديا اليستريح بوقت الحضانة المشتركة. (ب) زادت ندره المحببات مع كونيديال الوقت تورم عندما شارك في احتضان ل 0.5 h. (ج) كانت الكونيديا الاصليه أفضل من الكونيديا الثابتة. وتم الحصول علي بيانات من 10 جات مانحه مختلفه (ا ، ب) أو 5 جات مانحه مختلفه (ج) في 10 (ا ، ب) أو 5 (ج) تجارب مستقله. تشير أشرطه الخطا إلى SD. وقد تم تعديل هذا الرقم من هارتونغ وآخرون ، الخلوي A ، 95:3 ، ص. 332-338 (2019)14. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل ندره الكريات هو وسيله لتقييم الأداء الوظيفي للخلايا الاساسيه البشرية وتوصيف القوالب ذات الصلة السريرية. (ا) المقارنة المثالية بين الخلايا الاحاديه من متبرع صحي ومريض مناعي (بعد زرع الخلايا الجذعية التي تكون الدم) الكونيديا يستريح لمده 0.5 ساعة ، 2 ح و 4 ح. (ب) تم تحديد ندره الكونيديا الفطرية اليستريحه لأنواع الرشاشيات والفطريات ذات الصلة السريرية بعد 2 ساعة من الاحتضان المشترك. تم الحصول علي البيانات من 5 (الرشاشيات) أو 3 (mucorales) المانحين مختلفه في 5 أو 3 تجارب مستقله لكل منهما. تشير أشرطه الخطا إلى SD. الاختصارات: ا. الرشاشيات، ل. lichtheimia، m. Mucor، r. رهيبوس الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويقدم هذا البروتوكول طريقه تدفق سريع الخلوي لقياس التفاعل من ا. تبخير كونيديا مع عدد كبير من الكريات البيضاء البشرية الاساسيه التي ليس من الممكن في البروتوكولات المجهرية المشتركة. خلايا التصوير مع المجهر والعد يدويا كونيديا المستوعبة مرهقه ويمكن ان يتم واقعيا لبضع مئات من الخلايا فقط. التدفق الخلوي يتغلب علي هذه المشكلة عن طريق قياس آلاف من الخلايا في غضون دقائق. والعقبة المشتركة بين النهجين هي التمييز بين الكونيديا والملتصقة في الخلايا أو عليها علي التوالي. في المجهر ، وغالبا ما تستخدم صبغه calcofluor الأبيض لتلطيخ كونيديا ملتصقة ولكن استخدامه يقتصر علي الكائنات الدقيقة مع جدار الخلية التي تحتوي علي كيتين.
ويستخدم هذا البروتوكول في المقابل الفلوروبيورس مميزه لتوصيف احداث التفاعل التي تسمح باضافه علامات خليه أخرى ، مثل علامات النسب CD45 و CD14 و CD66b. التالي ، فمن الممكن أيضا التمييز بين كثرة الجراثيم من مسببات الامراض من قبل الخلايا الاحاديه والعدلات في عينه واحده. في حين ان اختيار العلامات والفلوريد لتحديد الخلية يمكن ان تتكيف مع احتياجات التجربة وقدرات المضخم الخلوي المتاحة ، يوصي باستخدام الأجسام المضادة المحددة لمكافحه الفتنه المذكورة في هذا البروتوكول لأنها كانت الأجسام المضادة الأكثر موثوقيه في ايدينا.
منذ الفورمالديهايد-كونيديا الثابتة لا يتم استيعابها بشكل جيد علي قدم المساواة ، ويوصي الجراثيم الاصليه لاختبارات ندره المحببات. ومع ذلك ، سوف تبدا الكونيديا الاصليه أو تستمر في التورم اثناء الاحتضان المشترك مع الكريات البيضاء البشرية وتنبت في نهاية المطاف. عاده ، ا. تبخير كونيديا تنبت بعد حوالي 8-9 h في وسائل الاعلام التي تحتوي علي الجلوكوز في 37 درجه مئوية. الجمع بين الوقت تورم والوقت المشترك الحضانة مع الخلايا الدهنية يجب ان لا تتجاوز هذا الإطار الزمني كما الإنبات يسبب فقدان FITC علي سطح كونيديا. والاهم من ذلك ، لا يمكن ان تكون الخلايا الجرثومية غير المشبعة بعد الآن من قبل البويضات أو العدلات. بدلا من ذلك ، تتراكم هذه البالعات حول والتمسك germlings التي تنتج مجموعات الخلايا التي تسد المضخم الخلوي ، إذا لم تتم ازالتها. المثل ، 4 h تورم كونيديا تميل إلى توليد مجموعات فيما بينها ومع الخلايا. في كثير من الأحيان لا يمكن فصل هذه المجموعات ميكانيكيا بعد الآن ، ويتم فقدان الخلايا داخل لتحليل التدفق الخلوي.
علي الرغم من ان النابضة واضحة وسهله في البداية ، فان المزيد من الكونيديا يتم استيعابها من قبل الخلايا ، قد تصبح النابضة. باستخدام MOIs > 2 يزيد من ندره المحببات في النقاط الزمنيه الاوليه ولكن قد تنشا القضايا النابضة في وقت سابق كذلك. لذلك ، يجب ان يتم تحديد MOIs بعناية مع خلايا محدده ومسببات الامراض من الفائدة.
الحد من هذا البروتوكول هو في ازدواجيه السكان الخلية مع كونيديا ملتصقة (FITC + APC +) التي قد تكون أيضا إيواء الخلايا مع الملتصقة وكذلك كونيديا المستوعبة. وهناك امكانيه لمزيد من التمييز هو تطبيق التصوير الخلوي تدفق15 التي تسمح التصوير البصري لجميع الخلايا تقاس في تدفق المضخم.
نظرا لوسم FITC غير محدده من جدار الخلية الكونديله ، وهذا الأسلوب هو بسهوله للتحويل إلى الفطريات الأخرى من الفائدة مثل القوالب ذات الصلة سريريا من جنس Mucorales أو الخميرة المبيضات الbicans. وعلاوة علي ذلك ، يمكن أيضا ان تكون البكتيريا الحاملة لجدار الخلية FITC المسمي. المضادة للتلوين العالمي مع مكافحه FITC الأضداد يسمح قياس سريعة وسهله من كثرة الكريات من كل هذه الممرضات علي حد سواء من قبل عدد كبير من الكريات البيضاء البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ونشكر السيدة بيا ستير علي المساعدة التقنية الممتازة. يتم دعم m. فون ليلينفيلد-Toal من قبل مركز التحكم في الانتان والرعاية (وزاره التعليم والصحة الاتحادية المانيه ، BMBF ، FKZ 01E01002) والحرم الجامعي للبحوث InfectoGnostics (BMBF ، FKZ 13GW0096D). ويدعم ثي نغوك ماي هوانغ من قبل مدرسه جينا للاتصالات الميكروبية (Deutsche Forschنجوجيميندينشافت ، FKZ 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
