Summary
Denne protokol giver en hurtig og pålidelig metode til kvantitativt at måle fagocytose af Aspergillus fumigatus conidia af humane primære fagocytter ved hjælp af flow cytometri og at diskriminere fagocytose af conidia fra simpel vedhæftning til leukocytter.
Abstract
Invasiv lungebetændelse af formen Aspergillus fumigatus udgør en stor trussel mod immunkompromitterede patienter. Inhalerede svampe nåle (sporer) udskilles fra den menneskelige lunge alveolerne ved at være fagocytoseret af medfødte monocytter og/eller neutrofiler. Denne protokol giver en hurtig og pålidelig måling af fagocytose ved flow cytometri ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC)-mærket conidia for Co-inkubation med humane leukocytter og efterfølgende kontra farvning med et anti-FITC antistof til at tillade diskrimination af internaliseret og celle-overbærende conidia. Store fordele ved denne protokol er dens rapidness, muligheden for at kombinere analysen med cytometrisk analyse af andre celle markører af interesse, den samtidige analyse af monocytter og neutrofiler fra en enkelt prøve og dens anvendelighed til andre celle vægbærende svampe eller bakterier. Bestemmelse af procentdele af fagocytoserende leukocytter giver et middel til mikrobiologer til vurdering af virulens af et patogen eller til sammenligning af patogener og mutanter samt til immunologer til undersøgelse af human leukocyt kapaciteter til bekæmpelse af patogener.
Introduction
Invasiv pulmonal aspergillose er en stor trussel mod immunkompromitterede patienter, da behandlingsmulighederne er begrænsede og kun lykkes ved tidlig diagnose, hvilket fører til høje dødelighedsrater1. Infektiøse agenser er conidia (sporer) af formen Aspergillus fumigatus , der er allestedsnærværende til de fleste levesteder2. Conidia inhaleres, passere gennem luftvejene og kan endelig komme ind i lunge alveolerne. Hos immunkompetente mennesker, disse conidia er ryddet af medfødte immunceller såsom monocytter eller makrofager og neutrofile granulocytter, som tager op (fagocytose) og fordøje patogener3. Fagocytose er vigtigt for mikrobiologer og immunologer ligeledes når interesserede i vært-patogen interaktioner. Konfrontationsassays, såsom Co-inkubation af leukocytter og conidia, omfatter ofte mærkning af sporer ved fluorescein eller dets afledte fluorescein isothiocyanat (FITC). Ved hjælp af et mikroskop er det ligetil at identificere internaliseret fluorescerende conidia og til at bestemme fastsiddende/klædelig conidia, selv om denne fremgangsmåde er tung og realistisk begrænset til et par hundrede celler4. Men i flow cytometri, som let giver mulighed for analyse af hundredtusinder af celler inden for minutter, er differentiel farvning af fagocytoseret og vedliggende conidia afgørende. Derfor er mange protokoller afhængige af trypan Blue til at slukke FITC-fluorescens fra vedsiddende conidia5,6,7,8. En anden fremgangsmåde er at udnytte fluorescens resonans energioverførsel af ethidium bromid og FITC til at udsende rødt i stedet for grøn fluorescens fra vedsiddende conidia9,10,11. Hvis specifikke antistoffer er tilgængelige, som det er tilfældet for nogle bakterier, celle bundne partikler kan være direkte plettet12,13.
Her præsenterer vi en protokol til hurtigt og kvantitativt vurdere fagocytose af FITC-mærket a. fumigatus conidia af humane leukocytter sammen med fastgørelse af sporer til celler og manglende interaktion ved at ansætte en allophycocyanin (APC)-koblede anti-FITC-antistof. Metoden giver også mulighed for samtidig flow cytometrisk analyse af yderligere celle markører, der kan anvendes til separat analyse af fagocytose af monocytter og neutrofiler fra samme prøve.
Protokollen kan anvendes til karakterisering af svampe stammer (f. eks. flere arter af Aspergillus og andre forme fra slægten mucorales præsenteret her) og deres mutanter14 og immunologisk forskning på phagocytter, såsom leukocytter fra immunkompromitterede individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol omfatter brugen af humane Buffy frakker opnået fra Institut for transfusion Medicine, Jena Universitets Hospital og frisk veneblod fra patienter, både efter skriftlig informeret samtykke fra donorer i overensstemmelse med etiske komité godkendelse 4357-03/15.
1. klargøring af Aspergillus fumigatus conidia
- Grow A. fumigatus på 1,5% malt agar Petri skåle i 5 dage ved 37 °C uden Co2.
Forsigtig: a. fumigatus er en biosikkerhedsniveau 2 mikroorganisme og skal håndteres i en passende facilitet ved hjælp af en biosikkerhed kabinet og iført Lab frakke, handsker og en filtermaske.
Bemærk: pladen skal dækkes helt med en grøn-grålig lag af conidia. Hvide kulturer ikke sporulere. Sammensætningen af malt agar: 4% (w/v) maltekstrakt, gærekstrakt 0,4% (w/v), agar 1,5% (w/v), Aqua dest. - Høst af conidia
- Anbring et papirhåndklæde vådt med desinfektionsmiddel i biosikkerheds kabinettet, og Anbring pladen på toppen for at forhindre over distribution af flygtige nåletræer.
- Tilsæt 10 mL fosfat bufferet saltvand (PBS) + 0,01% vaskemiddel på toppen af svampen, brug en Drigalski spatel til at sprede væsken over pladen og gnide den mørke farvede conidia. Pas på ikke at fjerne det hvide mycelium.
- Sæt conidia suspensionen på et 50 mL rør ved hjælp af en 30 μm celle-si for at fjerne eventuelle rester af mycelium.
- Gentag trin 1.2.2 og 1.2.3, og saml det samme 50 mL rør.
- Spin i 5 min ved 2.600 x g ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes og resuspenderes i 20 mL steril Aqua dest.
- Bestemmelse af conidia koncentrationen med en Thoma tælle kammer.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her, og conidia suspensionen opbevares i op til 1 måned ved 4 °c med låget skruet stramt.
- FITC-mærkning
- Forbered en 0,1 mM opløsning af FITC pulver i steril 0,1 M na2co3 (opløst i PBS).
Forsigtig: FITC-pulveret er farligt og bør håndteres med handsker, beskyttelsesbriller og en filtermaske. Indsamle affald i henhold til lokale regler.
Bemærk: Udelad kunstigt lys under dette og følgende trin, der involverer conidia. - Resuspension 1 x 108 (eller mindre) conidia i 5 ml FITC opløsning i en 15 ml rør. Inkubér i 20 min ved 37 °C i en rotator.
- For den negative kontrol, resuspension conidia i 0,1 M na2co3 (uden FITC) i en 15 ml rør. Inkubér i 20 min ved 37 °C i en rotator.
Bemærk: ved beregning af mængden af conidia skal farves, tage hensyn til et tab på op til 70% under farvning, hævelse og alle nødvendige vaske trin. Hvis der ikke er nogen rotator, skal suspensionen rystes tre gange under inkubationen. - Til vask tilsættes 10 mL PBS + 0,01% rengøringsmiddel til suspensionen og spinne i 5 minutter ved 2.600 x g ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og Gentag vask to gange med 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel.
- Forbered en 0,1 mM opløsning af FITC pulver i steril 0,1 M na2co3 (opløst i PBS).
- Hævelse af conidia (kan udelades, hvis det ikke ønskes)
- Resuspension FITC mærket conidia i 5 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium + 10% føtal kalve serum (FCS) og Inkubér i en rotator ved 37 °C i den ønskede tid (f. eks. 2 timer, 4 timer).
Bemærk: Hvis der ikke er nogen rotator, skal suspensionen rystes mindst hver 20 min. under inkubationen. - Tilsæt 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel til suspensionen og drej i 5 minutter ved 2.600 x g ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes og vaskes to gange med 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel.
- Filtrer gennem en 30 μm celle si for at fjerne store klumper af conidia.
- Resuspension FITC mærket conidia i 5 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium + 10% føtal kalve serum (FCS) og Inkubér i en rotator ved 37 °C i den ønskede tid (f. eks. 2 timer, 4 timer).
- Fastgørelse af conidia (kan udelades, hvis det ikke ønskes)
- Resuspension FITC mærket og hævede conidia i 1 mL formaldehyd og inkubere i 1 h ved stuetemperatur.
- Tilsæt 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel til suspensionen og drej i 5 minutter ved 2.600 x g ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes og vaskes to gange med 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her og conidia lagret i PBS i mørke (rør pakket ind i aluminiumsfolie) i op til 1 uge ved 4 °c.
2. klargøring af humane primære leukocytter
- Læg 5 mL Buffy coat i et 50 mL rør. Alternativt kan der anvendes frisk humant perifert veneblod i ethylenediaminetraeddikesyre (EDTA)-monovetter (10 mL pr. 50 mL rør).
Advarsel: humant blod kan overføre vira såsom humant immundefektvirus og hepatitis B-virus. Kun håndteres efter at være blevet vaccineret mod hepatitis B. håndtag i et biosikkerheds kabinet iført laboratorie frakke og handsker. - Fyld røret med erythrocyt lysis (EL) buffer, vend tre gange og Inkuber i 5-8 min vandret, indtil blandingens mælkeagtige udseende bliver klar.
Bemærk: lejlighedsvis kan blodet tage længere tid at lyse. Gå efter udseendet. Det er ikke usædvanligt, at to rør af samme blod tager forskellige gange for at lyse. Sammensætning af EL-buffer: 0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3, 0,1 mm EDTA - Spin i 10 min ved 300 x g ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.
- Opslæmmer pellet i 1 mL EL-buffer ved pipettering. Tilsæt derefter yderligere 24 mL EL-buffer, og vend flere gange.
- Spin i 5 min ved 300 x g ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 1 mL RPMI + 10% FCS.
- Bestem celle koncentrationen med et Neubauer tælle kammer.
3. analyse af fagocytose
- Incubate 2 x 106 leukocytter og 4 x 106 FITC-mærket conidia (mangfoldighed af infektion = 2) i 1,5 ml RPMI + 10% FCS i en 12-brønd cellekultur plade. Som kontrol, Medtag kun celler (ingen conidia) og celler + unbetegnet conidia.
- Placer i en befuret CO2 -inkubator ved 37 °c, og Inkuber i den ønskede periode (f. eks. 0,5 h, 2 timer eller 4 timer).
- Efter inkubation, høst celler med en celle skraber og sat i en 15 mL rør.
- Spin i 5 min ved 300 x g ved stuetemperatur.
- Saml supernatanten for cytokin analyse eller kassér hvis ikke ønsket. Hver prøve opslæmmes i 100 μL PBS + 2 mM EDTA.
4. antistof farvning
- For hver prøve forberedes 100 μL antistof blanding, herunder APC anti-FITC antistof, i henhold til tabel 1.
- Sæt en 100 μL prøve i en brønd af en 96-brønd V-bundplade. Tilsæt 150 μL PBS + 2 mM EDTA til vask.
- For farve kompensation, Placer 1 x 106 celler for hver farve i yderligere brønde af 96-Well V bundpladen. Medtag en brønd af celler, der er tilbage uplettet. Tilsæt 150 μL PBS + 2 mM EDTA til vask.
- Dækplade med en klæbende folie.
- Spin i 5 min ved 300 x g ved stuetemperatur. Fjern folien.
- Kassér supernatanten ved hurtigt og kraftigt at invertere pladen én gang over vasken eller et engangs stykke papir.
Bemærk: du må ikke gentage eller banke pladen på et papir, før den er tør, da dette vil resultere i et massivt tab af celler fra pladen. - Resuspendere cellerne i 100 μL antistof mix, og bland godt ved pipettering.
- For farve kompensation skal de respektive celler resuspenderes i 100 μL PBS + 2 mM EDTA og tilsættes et enkelt antistof til hver brønd med samme mængde, der anvendes i antistof blandingen.
- Dæk med en klæbende folie og Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur i mørket.
- Fjern folien. Tilsæt 150 μL PBS + 2 mM EDTA til hver brønd til vask. Dækslet med en klæbende folie.
- Spin i 5 min ved 300 x g ved stuetemperatur. Fjern folien. Kassér supernatanten ved hurtigt og kraftigt at invertere pladen over vasken eller et engangs papirhåndklæde.
- Resuspension i 200 μL PBS + 2 mM EDTA og Overfør celler fra hver brønd til en separat rund bund slange. Sørg for, at der ikke er nogen celle klynger i suspensionen. Fjern klynger ellers.
Bemærk: hver klynge, der er stor nok til øjet at se, er stor nok til potentielt tilstoppe cytometer.
5. strømnings cytometri
- Start flow flowcytometer og lad det varme op. Start anskaffelses softwaren.
- Opret et nyt eksperiment, og Opsæt og mærk prøverne.
- Opsætning af parametre (FSC 250, SSC 250) og detektorer til fluorophores FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-CY 5.5.
- Opsætning af kompensation
- Åbn kompensations opsætning.
- Angiv individuelle farver.
- Ved hjælp af kontrol cellerne, der ikke er plettet eller med individuelle pletter, indstilles PMT-detektor spændingen til at omfatte alle hændelser i skalaen.
- Optag mindst 10.000 hændelser for hvert kontrolelement.
- Brug kompensations opsætningen til at beregne fluorophores afsmittende, og Anvend på eksperimentets indstillinger for flowcytometer.
- Registrering af eksempeldata
- Display FSC og SSC i erhvervelse software og indstille Gate omkring leukocytter.
- Baseret på leukocyt Gate, display dot plot SSC/CD45 og Gate for CD45 + celler til at adskille fra conidia.
- Vis CD45 + celler i et prik plot CD14/CD66b og Gate monocytter (CD14 +) og neutrofiler (CD66b +) separat.
- Vis neutrofiler i et prik plot anti-FITC/FITC.
- Ved hjælp af prøven med ikke-mærket conidia indstilles kvadranter for anti-FITC-og FITC-signaler, hvilket tillader maksimalt 1% af cellerne i de respektive kvadranter.
- Gentag trin 5.5.4 og 5.5.5 for monocyt Gate.
- Optag alle prøver med mindst 20.000 hændelser i leukocyt porten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved måling af fagocytose af A. fumigatus conidia af humane fagocytiske celler, forskelsbehandling mellem ægte internalisering og blotte fastgørelse af conidia til cellerne er en hindring, især når det kommer til high-gennemløb metoder såsom flow cytometry. For at overvinde denne forhindring, præsenterer vi en hurtig og pålidelig protokol baseret på farvning af conidia med fluorescerende farvestof FITC før Co-inkubation af celler og conidia, efterfulgt af en kontra farvning med et APC-mærket anti-FITC-antistof efter inkubation (figur 1a). Som vist i figur 1B, er FITC-mærket conidia fagocyteret af humane monocytter og neutrofiler, der giver et grønt signal til cellerne. Disse conidia er utilgængelige for ANTIFITC antistof og kan derfor ikke binde antistoffet og cellerne vises APC negative (FITC +, APC-). Ikke-interagerende celler erhverver ikke et grønt signal fra FITC-mærket conidia og forbliver FITC-, APC-. Et par celler vises FITC-, APC +. Da ANTIFITC APC antistof ikke bør være i stand til at binde celler uden FITC-mærket conidia, betragtes disse hændelser som farvning artefakter. FITC-mærket conidia, som er knyttet til cellerne, men ikke internaliseret, gør cellerne også positive for FITC, men også give et mål for anti-FITC antistoffer, der gør disse celler dobbelt positiv for FITC og APC (FITC +, APC +). Når det analyseres mikroskopisk, denne population indeholdt op til 20% af celler med påsat conidia kun i vores eksperimenter.
Ved hjælp af de antistoffer, der er beskrevet i denne protokol og efter gating-strategien i figur 1D, efterfølges en generel gating af humane leukocytter af FSC-og SSC-karakteristika af en adskillelse af leukocytter og gratis conidia af Pan-LEUKOCYT markør CD45. Især når du bruger hævede conidia og/eller lange inkubationstider, kan conidia nå næsten Cellestørrelse på tidspunktet for flow cytometri og dermed bias analyse. Da humane primære monocytter og neutrofiler tage op conidia forskelligt, denne protokol gør det muligt særskilt at analysere disse cellepopulation baseret på farvning med den veletablerede celle Lineage markører CD14 for monocytter og CD66b for neutrofiler. Gating for fagocytosing og overbærende cellepopulationer sker baseret på kontrolprøver med umærkede conidia, der bærer hverken en FITC eller en anti-FITC APC signal. Når APC og FITC er afbildet mod hinanden, er kvadranter sat på en sådan måde, at højst 1% celler er tilladt i portene af interesse.
Procentdelen af humane primære fagocytter internalisering conidia kan være meget variabel blandt bloddonorer, men også afhænger af eksperimentelle faktorer såsom inkubationstid og hævelse tilstand af conidia. Spore internalisering kan påvises efter 0,5 h af co-inkubation allerede og stiger med tiden (figur 2A). Præ-hævede conidia er taget op lettere end hvile (ikke hævede) sporer selv ved korte inkubationstider (figur 2B). Hvis conidia er fastgjort med formaldehyd, fagocytose er formindsket sammenlignet med indfødte conidia (figur 2C).
| Reagens | μl pr. prøve |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0,5 |
| CD66b PerCP-CY 5.5 | 1,5 |
| anti-FITC APC | 0,5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| Samlede | 100 |
Tabel 1: antistof sammensætning for strømnings cytometri. Mængderne af hvert reagens gives som mikroliter pr. prøve (1 x 106 celler), der skal analyseres.
Figur 1: opsætning og analyse af flowcytometrisk phagocytose assay. A) protokol til protokollen, herunder nåle-og celle tilberedning og kontra farvning. (B) fagocytose analyseres ved at afbilde strømnings cytometriske data af FITC-mærket conidia mod anti-FITC APC kontra farvning. Resulterende populationer indikerer procenter af ikke-interagerende leukocytter (FITC-, APC-), leukocytter med klædende conidia (FITC +, APC +) og fagocytosing leukocytter (FITC +, APC-) samt farvning artefakter (FITC-, APC +). (C) dobbelte positive cellepopulationer fra 3 forskellige eksperimenter med 3 forskellige donorer (to af dem udført i dubletter, én udført enkelt) blev mikroskopisk talt for internaliseret og vedhæftet kun conidia. D) repræsentativ gating-strategi for flow cytometriske data til påvisning af LEUKOCYTTER (CD45), identifikation af MONOCYTTER (CD14) og neutrofiler (CD66b) og bestemmelse af interagerende populationer (FITC, anti-FITC). Dette tal er blevet modificeret fra Hartung et al., cytometry A, 95:3, s. 332-338 (2019)14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fagocytose af conidia af humane primære phagocytter afhænger af flere betingelser. (A) procentdel af celler, der internaliserer hvilende conidia steg med co-inkubationstid. (B) fagocytose steg med nåletids hævelse tid, når Co-inkuberet for 0,5 h.C) indfødte conidia var bedre fagocytoseret end fast conidia. Der blev indhentet data fra 10 forskellige donorer (a, b) eller 5 forskellige donorer (c) i 10 (a, b) eller 5 (c) uafhængige eksperimenter. Fejllinjer indikerer SD. Dette tal er blevet modificeret fra Hartung et al., cytometry A, 95:3, s. 332-338 (2019)14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af fagocytose er et middel til at vurdere funktionaliteten af humane primære fagocytter og karakterisere klinisk relevante skimmelsvampe. A) eksemplarisk sammenligning af monocytter fra en sund donor og en immunsupprimerede patient (efter hæmatopoietisk stamcelletransplantation) fagocytoserende hvilende conidia for 0,5 h, 2 h og 4 h. (B) fagocytose af hvilende svampe conidia blev bestemt for klinisk relevante Aspergillus og mucorales arter efter 2 h Co-inkubation. Data blev indhentet fra 5 (Aspergillus) eller 3 (mucorales) forskellige donorer i 5 eller 3 uafhængige eksperimenter hver. Fejllinjer indikerer SD. forkortelser: A. Aspergillus, L. Lichtheimia, M. Mucor, R. rhizopus Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol præsenterer en hurtig flow cytometrisk metode til at måle interaktion af a. fumigatus conidia med et stort antal primære humane leukocytter, der ikke er muligt i almindelige mikroskopiske protokoller. Imaging celler med et mikroskop og manuelt tælle internaliseret conidia er besværligt og kan realistisk set gøres for et par hundrede celler kun. Flowcytometri overvinder dette problem ved at måle tusindvis af celler inden for minutter. En forhindring, der er fælles for begge fremgangsmåder, er sondringen mellem henholdsvis fagocytoseret og overbærende conidia i eller på celler. I mikroskopi bruges farvestoffet calcofluor White ofte til farvning af overbærende conidia, men dets anvendelse er begrænset til mikroorganismer med en chitin-holdige cellevæg.
Denne protokol i modsætning brugt særskilte fluorophorer til karakterisering af interaktion begivenheder, der giver mulighed for tilsætning af yderligere celle markører, såsom Lineage markører CD45, CD14 og CD66b. Det er således også muligt at diskriminere fagocytose af patogener ved monocytter og neutrofiler i en enkelt prøve. Selv om valget af markører og fluorophorer til celle identifikation kan tilpasses eksperimentets behov og kapaciteten hos det tilgængelige cytometer, anbefales det at bruge det specifikke APC anti-FITC-antistof, der er nævnt i denne protokol, da det var mest pålidelige antistof i vores hænder.
Da formaldehyd-faste conidia er ikke internaliseret lige så godt, indfødte sporer anbefales til fagocytosis assays. Men, indfødte conidia vil starte eller fortsætte hævelse under Co-inkubation med humane leukocytter og i sidste ende spire. Typisk, A. fumigatus conidia spire efter ca. 8-9 h i glucoseholdige medier ved 37 °c. Kombinationen af hævelse tid og co-inkubationstid med fagocytter bør ikke overskride denne tidsramme som spiring forårsager tab af FITC på nålens overflade. Mere vigtigt, germlings kan ikke fagocyteret længere af monocytter eller neutrofiler. I stedet, disse fagocytter akkumulere rundt og holde sig til germlings, der producerer celle klynger, der tilstoppe cytometer, hvis ikke fjernet. Tilsvarende, 4 h hævede conidia tendens til at generere klynger indbyrdes og med celler. Ofte kan disse klynger ikke adskilles mekanisk længere, og cellerne i går tabt for flow cytometrisk analyse.
Selvom gating er ligetil og let i begyndelsen, jo mere conidia internaliseret af celler, den blurrier gating kan blive. Ved hjælp af MOIs > 2 øger fagocytose ved indledende tidspunkter, men gating spørgsmål kan opstå tidligere så godt. Derfor bør MOIs nøje bestemmes med de specifikke celler og patogener af interesse.
En begrænsning af denne protokol er i dobbelthed af celle populationen med vedklædet conidia (FITC + APC +), der kan også være husly celler med Klæb samt internaliseret conidia. En mulighed for yderligere diskrimination er anvendelsen af billedbehandlings flow flowcytometri15 , der giver mulighed for visuel billeddannelse af alle celler målt i flowcytometer.
På grund af den uspecifikke FITC-mærkning af nåle-cellevæggen er denne metode let overføres til andre svampe af interesse, såsom klinisk relevante forme af slægten Mucorales eller gær Candida albicans. Desuden kan også celle-væg bærende bakterier være FITC-mærket. Den universelle kontra farvning med anti-FITC-antistof giver mulighed for hurtig og nem måling af fagocytose af alle disse patogener både ved et stort antal humane leukocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker fru Pia stier for fremragende teknisk assistance. M. von Lilienfeld-Toal understøttes af Center for sepsis Control and Care (det tyske Forbundsministerium for uddannelse og sundhed, BMBF, FKZ 01E01002) og InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang støttes af Jena skolen for mikrobiel kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
