Summary
Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare methode voor het kwantificeren van de fagocytose van Aspergillus fumigatus conidiën door humane primaire fagocyten met behulp van Flowcytometrie en om de fagocytose van conidiën te onderscheiden van de loutere hechting op leukocyten.
Abstract
Invasieve pulmonale infectie door de schimmel Aspergillus fumigatus vormt een grote bedreiging voor immuungecompromitteerde patiënten. Geïnhaleerde schimmel conidiën (sporen) worden uit de menselijke Long longblaasjes geklaard door fagocytosed te zijn door aangeboren monocyten en/of neutrofielen. Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare meting van de fagocytose door Flowcytometrie met behulp van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-gelabelde conidiën voor coincubatie met menselijke leukocyten en daaropvolgende tegen kleuring met een antilichaam tegen FITC om discriminatie van geïnternationaliseerde en cel-aanhangende conidiën mogelijk te maken. Belangrijke voordelen van dit protocol zijn de snelheid, de mogelijkheid om de test te combineren met cytometrische analyse van andere celmarkeringen van belang, de gelijktijdige analyse van monocyten en neutrofielen uit een enkel monster en de toepasbaarheid ervan op andere celwanddragende schimmels of bacteriën. Bepaling van de percentages van phagocytosing leukocyten biedt een middel aan microbiologen voor de beoordeling van de virulentie van een pathogeen of voor het vergelijken van ziekteverwekkers en mutanten, alsook aan immunologen voor het onderzoeken van menselijke leukocyten capaciteiten om pathogenen te bestrijden.
Introduction
Invasieve pulmonale aspergillose is een grote bedreiging voor immuungecompromitteerde patiënten omdat behandelingsopties beperkt zijn en alleen succesvol zijn bij vroege diagnose, wat leidt tot hoge sterftecijfers1. Infectieuze agentia zijn conidiën (sporen) van de schimmel Aspergillus fumigatus die alomtegenwoordig zijn voor de meeste habitats2. Conidia worden geïnhaleerd, passeren de luchtwegen en kunnen eindelijk de Long alveoli binnengaan. Bij immunocompetente mensen worden deze conidiën geklaard door aangeboren immuuncellen zoals monocyten of macrofagen en Neutrofiele granulocyt, die nemen (fagocytose) en de pathogenen verteren3. Fagocytose is ook belangrijk voor microbiologen en immunologen wanneer ze geïnteresseerd zijn in interacties tussen gastheer en pathogeen. Confrontatie testen, zoals coincubatie van leukocyten en conidia, omvatten vaak het labelen van de sporen door fluoresceïne of zijn afgeleide fluoresceïne isothiocyanaat (FITC). Met behulp van een microscoop is het eenvoudig om geïnternationaliseerde fluorescentie-conidiën te identificeren en om de bijgevoegde/aanhandige conidiën te bepalen, hoewel deze aanpak omslachtig is en realistisch beperkt tot enkele honderden cellen4. Echter, in flow cytometrie waardoor de analyse van honderdduizenden cellen binnen enkele minuten gemakkelijk is, is differentiële kleuring van phagocytosed en aanhandige conidiën van vitaal belang. Daarom zijn veel protocollen gebaseerd op trypan Blue om FITC-fluorescentie te blusen van de aanhandige conidiën5,6,7,8. Een andere aanpak is het benutten van fluorescentie resonantie energie overdracht van ethidiumbromide bromide en FITC om rood uit te stoten in plaats van groene fluorescentie van aanhanger conidiën9,10,11. Als er specifieke antilichamen beschikbaar zijn, zoals bij sommige bacteriën, kunnen cel-gebonden deeltjes direct worden gekleurd12,13.
Hier presenteren we een protocol voor het snel en kwantitatief beoordelen van fagocytose van FITC-gelabelde a. fumigatus conidiën door menselijke leukocyten samen met een bevestiging van sporen aan cellen en een gebrek aan interactie door gebruik te maken van een allophycocyanin (APC)-gekoppeld anti-FITC-antilichaam. De methode maakt het ook mogelijk voor de gelijktijdige Flow cytometrische analyse van verdere celmarkeringen die kunnen worden gebruikt voor een afzonderlijke analyse van fagocytose door monocyten en neutrofielen uit hetzelfde monster.
Het protocol kan worden toegepast voor de karakterisering van schimmel stammen (bijv. verschillende soorten Aspergillus en andere mallen van het geslacht Mucorales hier gepresenteerd) en hun mutanten14 en immunologische onderzoek op fagocyten, zoals leukocyten van immuungecompromitteerde individuen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol omvat het gebruik van menselijke Buffy jassen verkregen van het Institute for Transfusion Medicine, Jena universitair ziekenhuis en vers veneuze bloed van patiënten, zowel na schriftelijke geïnformeerde toestemming van de donoren in overeenstemming met goedkeuring van de ethische commissie 4357-03/15.
1. bereiding van Aspergillus fumigatus conidia
- Grow A. fumigatus op 1,5% Malt agar Petri schaaltjes gedurende 5 dagen bij 37 °C zonder co2.
Letop: a. fumigatus is een micro-organisme voor bioveiligheidsniveau 2 en moet in een geschikte faciliteit worden behandeld met behulp van een bioveiligheidskast en een Labcoat, handschoenen en een filtermasker dragen.
Opmerking: de plaat moet volledig bedekt zijn met een groen-grijzig laagje conidia. Witte culturen niet sporuleren. Samenstelling van mout agar: 4% (g/v) moutextract, gistextract 0,4% (w/v), agar 1,5% (w/v), Aqua dest. - Oogsten conidiën
- Plaats een papieren handdoek nat met een ontsmettingsmiddel in de bioveiligheidskast en leg de plaat er bovenop om te voorkomen dat de vluchtige conidia oververdeeld wordt.
- Voeg 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,01% afwasmiddel toe bovenop de schimmel, gebruik een Drigalski spatel om de vloeistof over de plaat te verdelen en de donker gekleurde conidia af te wrijven. Let op dat u het witte mycelium niet verwijdert.
- Plaats de conidiën suspensie in een tube van 50 ml met een 30 μm celzeef om het resterende mycelium te verwijderen.
- Herhaal stap 1.2.2 en 1.2.3 en verzamel in dezelfde 50 mL Tube.
- Draai gedurende 5 min bij 2.600 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder de supernatant en respendeer in 20 mL steriele Aqua dest.
- Bepaal de concentratie van de conidiën met een Thoma-telkamer.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken en de conidiën suspensie wordt tot 1 maand bij 4 °c bewaard met het deksel strak vastgeschroefd.
- FITC labeling
- Bereid een 0,1 mM oplossing van FITC poeder in steriele 0,1 M na2co3 (opgelost in PBS).
Letop: FITC poeder is gevaarlijk en moet worden behandeld met handschoenen, een bril en een filtermasker. Verzamel afval volgens de lokale regelgeving.
Opmerking: laat kunstlicht weg tijdens deze en de volgende stappen waarbij conidia wordt uitgevoerd. - Respendeer 1 x 108 (of minder) conidiën in 5 ml FITC-oplossing in een buis van 15 ml. Inincuberen gedurende 20 min bij 37 °C in een rotator.
- Voor de negatieve controle, respenderen conidiën in 0,1 M na2co3 (zonder FITC) in een 15 ml buis. Inincuberen gedurende 20 min bij 37 °C in een rotator.
Let op: bij het berekenen van de hoeveelheid conidiën die moet worden gekleurd, rekening houden met een verlies van maximaal 70% tijdens kleuring, zwelling en alle benodigde wasstappen. Als er geen Rotator beschikbaar is, moet de suspensie drie keer worden geschud tijdens de incubatie. - Voor het wassen, voeg 10 mL PBS + 0,01% wasmiddel toe aan de suspensie en draai gedurende 5 minuten bij 2.600 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder supernatant en herhaal het wassen tweemaal met 10 mL PBS + 0,01% afwasmiddel.
- Bereid een 0,1 mM oplossing van FITC poeder in steriele 0,1 M na2co3 (opgelost in PBS).
- Zwelling van conidiën (mag achterwege worden gelaten indien niet gewenst)
- Respendeer FITC met het label conidiën in 5 ml Roswell Park Memorial Institute (rpmi) medium + 10% foetaal kalf serum (FCS) en incuberen in een Rotator bij 37 °c voor de gewenste tijd (bijvoorbeeld 2 uur, 4 uur).
Opmerking: als er geen Rotator beschikbaar is, dient de suspensie ten minste elke 20 minuten te worden geschud tijdens de incubatie. - Voeg 10 mL PBS + 0,01% wasmiddel toe aan de suspensie en draai gedurende 5 minuten bij 2.600 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder de supernatant en spoel tweemaal met 10 mL PBS + 0,01% afwasmiddel.
- Filtreer door een 30 μm-celzeef om grote klonters van conidia te verwijderen.
- Respendeer FITC met het label conidiën in 5 ml Roswell Park Memorial Institute (rpmi) medium + 10% foetaal kalf serum (FCS) en incuberen in een Rotator bij 37 °c voor de gewenste tijd (bijvoorbeeld 2 uur, 4 uur).
- Bevestiging van conidiën (mag achterwege worden gelaten indien niet gewenst)
- Respendeer FITC gelabeld en gezwollen conidiën in 1 ml formaldehyde en incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 mL PBS + 0,01% wasmiddel toe aan de suspensie en draai gedurende 5 minuten bij 2.600 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder de supernatant en spoel tweemaal met 10 mL PBS + 0,01% afwasmiddel.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken en de conidiën opgeslagen in PBS in het donker (buis verpakt in aluminiumfolie) tot 1 week bij 4 °c.
2. bereiding van menselijke primaire leukocyten
- Zet 5 mL buffy coat in een tube van 50 mL. U ook gebruik maken van vers humaan perifeer veneuze bloed in ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) monovettes (10 mL per 50 mL Tube).
Letop: menselijk bloed kan virussen zoals humaan immunodeficiëntie virus en hepatitis B-virus overdragen. Pas na te zijn gevaccineerd tegen hepatitis B. handvat in een bioveiligheid kabinet dragen Labcoat en handschoenen. - Vul de buis met erytrocyten Lysis (EL) buffer, Inverteer drie keer en inincuberen voor 5-8 min horizontaal totdat het melkachtig uiterlijk van het mengsel duidelijk wordt.
Opmerking: soms kan het bloed langer duren tot lyse. Ga door het uiterlijk. Het is niet ongebruikelijk dat twee buisjes van hetzelfde bloed verschillende keren naar lyse nemen. Samenstelling van EL buffer: 0,15 M NH4cl, 10 mm khco3, 0,1 mm EDTA - Draai gedurende 10 min bij 300 x g bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
- Rebreng de pellet in 1 mL EL buffer door pipetteren. Voeg vervolgens nog eens 24 mL EL-buffer toe en keer meerdere keren om.
- Draai gedurende 5 min bij 300 x g bij kamertemperatuur.
- Gooi de supernatant-en respendeer cellen weg in 1 mL RPMI + 10% FCS.
- Bepaal de cel concentratie met een Neubauer telkamer.
3. fagocytose assay
- Incuberen 2 x 106 leukocyten en 4 x 106 FITC-gelabelde conidiën (multipliciteit van de infectie = 2) in 1,5 ml rpmi + 10% FCS in een 12-well celkweek plaat. Als besturingselementen, omvatten alleen cellen (geen conidia) en cellen + zonder label conidia.
- Plaats in een incubator met bevoficeerde CO2 bij 37 °c en incueren gedurende de gewenste tijdsperiode (bijv. 0,5 u, 2 uur of 4 uur).
- Na incubatie, oogst cellen met een celscraper en zet in een buis van 15 mL.
- Draai gedurende 5 min bij 300 x g bij kamertemperatuur.
- Verzamel supernatant voor cytokine-analyse of gooi het weg als het niet gewenst is. Respendeer elk monster in 100 μL PBS + 2 mM EDTA.
4. antilichaam kleuring
- Bereid voor elk monster 100 μL antilichaammix, inclusief APC anti-FITC-antilichaam, volgens tabel 1.
- Breng een 100 μL monster in één put van een 96-well V-bottom Plate. Voeg 150 μL PBS + 2 mM EDTA toe voor het wassen.
- Voor kleur compensatie, plaats 1 x 106 cellen voor elke kleur in verdere putjes van de 96-well V bodemplaat. Neem een goed van cellen die onbevlekt achtergelaten. Voeg 150 μL PBS + 2 mM EDTA toe voor het wassen.
- Afdekplaat met zelfklevende folie.
- Draai gedurende 5 min bij 300 x g bij kamertemperatuur. Verwijder de folie.
- Gooi de supernatant weg door snel en krachtig de plaat slechts eenmaal over de gootsteen of een wegwerp papieren handdoek te inverteren.
Opmerking: Herhaal of klop de plaat niet op een papier totdat het droog is, omdat dit zal resulteren in een enorm verlies van cellen van de plaat. - Respendeer cellen in de 100 μL antilichaammix en meng goed door pipetten.
- Voor kleur compensatie moet de respectieve cellen worden hervat in 100 μL PBS + 2 mM EDTA en wordt één antilichaam aan elk goed met dezelfde hoeveelheid gebruikt in de antilichaammix.
- Bedek met een zelfklevende folie en inbroed gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Verwijder de folie. Voeg 150 μL PBS + 2 mM EDTA toe aan elke put voor het wassen. Afdekking met een zelfklevende folie.
- Draai gedurende 5 min bij 300 x g bij kamertemperatuur. Verwijder de folie. Gooi de supernatant weg door snel en krachtig de plaat over de gootsteen of een wegwerp papieren handdoek te inverteren.
- Respendeer in 200 μL PBS + 2 mM EDTA en breng cellen over van elke put naar een aparte ronde bodem buis. Zorg ervoor dat er geen celclusters in de suspensie zijn. Verwijder clusters anders.
Opmerking: elk cluster dat groot genoeg is voor het oog om te zien, is groot genoeg om de cytometer mogelijk te verstoppen.
5. stroom Cytometrie
- Start de flow cytometer en laat het opwarmen. Start de acquisitie software.
- Maak een nieuw experiment en stel de voorbeelden in en label deze.
- Parameters instellen (FSC 250, SSC 250) en detectoren voor fluorophores FITC, APC, BUV395, V500 Photo, PerCP-CY 5.5.
- Compensatie instellen
- Compensatie-instellingen openen.
- Geef afzonderlijke kleuren aan.
- Met behulp van de controle cellen links onbevlekt of met individuele stainings, stelt u de PMT detector spanningen alle gebeurtenissen in de schaal opnemen.
- Noteer ten minste 10.000 gebeurtenissen van elk besturingselement.
- Gebruik de compensatie-instellingen om de overloop van fluoroforen te berekenen en toe te passen op de cytometer-instellingen van het experiment.
- Voorbeeldgegevens opnemen
- Geef FSC en SSC weer in de acquisitie software en stel de poort rond leukocyten in.
- Op basis van de Leukocyt poort, display dot plot SSC/CD45 en Gate voor CD45 + cellen te scheiden van conidia.
- Toon CD45 + cellen in een puntplot CD14/CD66b en poort monocyten (CD14 +) en neutrofielen (CD66b +) afzonderlijk.
- Weergeven van neutrofielen in een stip plot anti-FITC/FITC.
- Gebruik het monster met niet-gelabelde conidia, stel kwadranten in voor anti-FITC-en FITC-signalen, waardoor maximaal 1% van de cellen in de respectieve kwadranten wordt gebruikt.
- Herhaal de stappen 5.5.4 en 5.5.5 voor de monocyt-poort.
- Neem alle samples op met minstens 20.000 gebeurtenissen in de leukocyten poort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij het meten van fagocytose van A. fumigatus conidiën door menselijke fagocytische cellen, is discriminatie tussen echte internalisering en loutere gehechtheid van conidiën aan de cellen een obstakel, vooral als het gaat om methoden met een hoge doorvoer zoals Flowcytometrie. Om deze hindernis te overwinnen, presenteren we een snel en betrouwbaar protocol op basis van de kleuring van conidiën met de fluorescerende kleurstof FITC voorafgaand aan de co-incubatie van cellen en conidiën, gevolgd door een tegen kleuring met een APC-gelabeld anti-FITC-antilichaam na incubatie (Figuur 1a). Zoals weergegeven in Figuur 1B, zijn FITC-gelabelde conidiën fagocytosed door humane monocyten en neutrofielen die een groen signaal aan de cellen geven. Deze conidiën zijn ontoegankelijk voor het anti-FITC antilichaam en kunnen dus niet binden het antilichaam en de cellen verschijnen APC negatief (FITC +, APC-). Niet-interactie cellen verwerven geen groen signaal van FITC-gelabelde conidiën en blijven FITC-, APC-. Een paar cellen verschijnen FITC-, APC +. Aangezien antilichamen tegen FITC APC niet in staat moeten zijn cellen te binden zonder FITC-gelabelde conidia, worden deze verschijnselen beschouwd als kleurings artefacten. FITC-gelabelde conidia, die zijn bevestigd aan de cellen, maar niet geïnternationaliseerd, renderen cellen ook positief voor FITC, maar ook bieden een doelwit voor de anti-FITC antilichaam dat maakt deze cellen dubbel positief voor FITC en APC (FITC +, APC +). Wanneer microscopisch wordt geanalyseerd, bevatte deze populatie tot 20% van de cellen met bijgevoegde conidiën alleen in onze experimenten.
Met behulp van de in dit protocol beschreven antilichamen en naar aanleiding van de gating-strategie in Figuur 1D, wordt een algemene gating van menselijke leukocyten met FSC-en SSC-kenmerken gevolgd door een scheiding van leukocyten en vrije conidiën door de panleukocyten marker CD45. Vooral bij het gebruik van gezwollen conidiën en/of lange incubatie tijden kan conidiën bijna de celgrootte bereiken op het moment van Flowcytometrie en dus bias analyse. Aangezien humane primaire monocyten en neutrofielen de conidiën verschillend innemen, maakt dit protocol het mogelijk om deze celpopulatie afzonderlijk te analyseren op basis van kleuring met de welbekende cellineage markers CD14 voor monocyten en CD66b voor neutrofielen. Gating voor fagocytosing en aanhangende celpopulaties wordt gedaan op basis van controlemonsters met niet-gelabelde conidiën die noch een FITC, noch een anti-FITC APC-signaal dragen. Wanneer APC en FITC tegen elkaar worden uitgezet, worden kwadranten zodanig ingesteld dat maximaal 1% cellen zijn toegestaan in de poorten van belang.
Het percentage humane primaire fagocyten dat conidiën internaliseert, kan zeer variabel zijn onder bloeddonoren, maar is ook afhankelijk van experimentele factoren zoals incubatietijd en zwelling toestand van conidiën. De internalisering van de Spore kan na 0,5 h van de co-incubatie al worden gedetecteerd en neemt toe met de tijd (Figuur 2A). Pre-gezwollen conidiën worden gemakkelijker ingenomen dan rusten (niet gezwollen) sporen, zelfs bij korte incubatie tijden (Figuur 2B). Als de conidiën met formaldehyde wordt opgelost, wordt de fagocytose verminderd in vergelijking met inheemse conidiën (Figuur 2C).
| Reagens | μl per monster |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 PHOTO | 0,5 |
| CD66b PerCP-CY 5.5 | 1,5 |
| anti-FITC APC | 0,5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| Totale | 100 |
Tabel 1: antilichaam mengsel voor Flowcytometrie. De hoeveelheden van elk reagens worden gegeven als micro liters per monster (1 x 106 cellen) die moeten worden geanalyseerd.
Figuur 1: opstelling en analyse van de stroom cytometrische fagocytose test. A) schema van het Protocol, met inbegrip van conidiën en voorbereiding van de cellen en tegen kleuring. B) fagocytose wordt geanalyseerd door het uitzetten van flowcytometrische gegevens van FITC-gelabelde conidiën tegen anti-FITC APC-tegen kleuring. Resulterende populaties duiden op percentages van niet-interactie leukocyten (FITC-, APC-), leukocyten met aanhanger conidiën (FITC +, APC +) en fagocytosing leukocyten (FITC +, APC-) evenals kleurings artefacten (FITC-, APC +). C) dubbele positieve celpopulaties van 3 verschillende experimenten met 3 verschillende donoren (twee van hen uitgevoerd in duplicaten, één uitgevoerde single) werden microscopisch geteld voor geïnternationaliseerde en bevestigde alleen conidia. D) representatieve strategie van flowcytometrische gegevens voor het opsporen van LEUKOCYTEN (CD45), het identificeren van MONOCYTEN (CD14) en neutrofielen (CD66b) en het bepalen van de interactie populaties (FITC, anti-FITC). Dit cijfer is gewijzigd van Hartung et al., Cytometry A, 95:3, p. 332-338 (2019)14. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: fagocytose van conidiën door humane primaire fagocyten hangt af van verschillende aandoeningen. A) het percentage cellen dat de internalisering van de rust conidiënheeftverhoogd met de co-incubatietijd. B) de fagocytose steeg met de zwellingen van de naald tijdens de incubering gedurende 0,5 h.C) inheemse conidiën waren beter fagocytosed dan vaste conidiën. Gegevens werden verkregen uit 10 verschillende donoren (a, b) of 5 verschillende donoren (c) in 10 (a, b) of 5 (c) onafhankelijke experimenten. Foutbalken geven SD aan. Dit cijfer is gewijzigd van Hartung et al., Cytometry A, 95:3, p. 332-338 (2019)14. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: analyse van fagocytose is een middel om de functionaliteit van menselijke primaire fagocyten te beoordelen en karakteriseren van klinisch relevante mallen. A)voorbeeldige vergelijking van monocyten van een gezonde donor en een immuunonderdrukte patiënt (na hematopoietische stamceltransplantatie) fagocytosing rust conidiën voor 0,5 h, 2 h en 4 h.B) fagocytose van rust schimmel conidiën werd bepaald voor klinisch relevante Aspergillus -en Mucorales -soorten na 2 uur co-incubatie. Gegevens werden verkregen uit 5 (Aspergillus) of 3 (Mucorales) verschillende donoren in 5 of 3 onafhankelijke experimenten elk. Foutbalken geven SD. afkortingen: A. Aspergillus, L. lichtheimia, M. Mucor, R. Rhizopus Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol presenteert een Fast Flow cytometrische methode voor het meten van de interactie van a. fumigatus conidiën met een groot aantal primaire menselijke leukocyten die niet mogelijk is in gemeenschappelijke microscopische protocollen. Beeldvormings cellen met een microscoop en handmatig de geïnternationaliseerde conidiën tellen zijn omslachtig en kunnen realistisch worden gedaan voor een paar honderd cellen. Flow flowcytometrieonderzoeken overkomt dit probleem door het meten van duizenden cellen binnen enkele minuten. Een horde die voor beide benaderingen gebruikelijk is, is het onderscheid tussen phagocytosed en adherente conidiën respectievelijk in of op cellen. In microscopie wordt de kleurstof calcofluor White vaak gebruikt voor de kleuring hecht conidiën maar het gebruik ervan is beperkt tot micro-organismen met een chitin-bevattende celwand.
Dit protocol daarentegen gebruikte verschillende fluor Foren voor het karakteriseren van interactiegebeurtenissen die de toevoeging van verdere celmarkeringen mogelijk maakt, zoals de Lineage markers CD45, CD14 en CD66b. Het is dus ook mogelijk om de fagocytose van pathogenen door monocyten en neutrofielen in één monster te discrimineren. Hoewel de keuze van markers en fluor Foren voor celidentificatie kan worden aangepast aan de behoeften van het experiment en de capaciteiten van de beschikbare cytometer, wordt het gebruik van het specifieke APC anti-FITC-antilichaam dat in dit protocol wordt genoemd, aanbevolen omdat het de meest betrouwbare antilichaam in onze handen.
Aangezien formaldehyde-vaste conidiën niet even goed geïnternationaliseerd worden, worden inheemse sporen aanbevolen voor fagocytose assays. Echter, inheemse conidiën zal beginnen of blijven zwelling tijdens de coincubatie met menselijke leukocyten en uiteindelijk ontkiemen. Gewoonlijk ontkiemen A. fumigatus conidiën na ongeveer 8-9 h in glucose bevattende media bij 37 °c. De combinatie van zwelling tijd en co-incubatietijd met fagocyten mag dit tijdsbestek niet overschrijden omdat kieming het verlies van FITC op het conidiën-oppervlak veroorzaakt. Belangrijker, germlings kunnen niet worden fagocytosed meer door monocyten of neutrofielen. In plaats daarvan accumuleren deze fagocyten zich rond en plakken ze op germlings die celclusters produceren die de cytometer verstoppen, indien ze niet worden verwijderd. Evenzo, 4 h gezwollen conidiën neiging om clusters te genereren onderling en met cellen. Vaak kunnen deze clusters mechanisch niet meer worden gescheiden en zijn de cellen binnen verloren gegaan voor flowcytometrische analyse.
Hoewel gating in het begin eenvoudig en gemakkelijk is, worden de meer conidiën geïnternationaliseerd door cellen, de vervagende gating kan worden. Met behulp van MOIs > 2 verhoogt fagocytose op de eerste tijdpunten maar gating problemen eerder ook kunnen optreden. Daarom moet de MOIs zorgvuldig worden bepaald met de specifieke cellen en pathogenen die van belang zijn.
Een beperking van dit protocol is in de dualiteit van de celpopulatie met aanhandige conidiën (FITC + APC +) die ook kan worden verkotterd cellen met aanhanger en geïnternationaliseerde conidiën. Een mogelijkheid voor verdere discriminatie is de toepassing van Imaging flow flowcytometrieonderzoeken15 die visuele beeldvorming mogelijk maakt van alle cellen gemeten in de flow-cytometer.
Vanwege de niet-specifieke FITC-labeling van de conidiale celwand, is deze methode gemakkelijk overdraagbaar naar andere schimmels van belang, zoals klinisch relevante mallen van het geslacht Mucorales of de gist Candida albicans. Bovendien, ook cel-muur lager bacteriën kunnen FITC-gelabeld. De universele tegen kleuring met het anti-FITC-antilichaam maakt snelle en eenvoudige meting van fagocytose van al deze pathogenen mogelijk door een groot aantal menselijke leukocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken mevrouw Pia stier voor de uitstekende technische bijstand. M. von Lilienfeld-Toal wordt ondersteund door het centrum voor sepsis controle en verzorging (Duits Federaal Ministerie van onderwijs en gezondheid, BMBF, FKZ 01E01002) en InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang wordt gesteund door de school voor microbiële communicatie van Jena (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
