Summary
Questo protocollo fornisce un metodo veloce e affidabile per misurare quantitativamente la fagocitosi di Aspergillus fumigatus conidia da fagociti primari umani utilizzando la citometria di flusso e per discriminare la fagocitosi di conidia dalla mera adesione ai leucociti.
Abstract
L'infezione polmonare invasiva da parte dello stampo Aspergillus fumigatus rappresenta una grande minaccia per i pazienti immunocompromessi. Le conidia fungine inalate (spore) vengono eliminate dagli alveoli polmonari umani per essere fagocitosed da monociti innati e/o neutrofili. Questo protocollo offre una misurazione rapida e affidabile della fagocitosi mediante citometria di flusso utilizzando conidia con etichettatura fitC (isotonionnate) con etichettatura fitC (FITC) per la co-incubazione con leucociti umani e la successiva controtendenza con un anticorpo anti-FITC per consentire la discriminazione dei conerentidi internalizzati e addicenti delle cellule. I principali vantaggi di questo protocollo sono la sua rapidità, la possibilità di combinare l'analisi con l'analisi citometrica di altri marcatori cellulari di interesse, l'analisi simultanea di monociti e neutrofili da un singolo campione e la sua applicabilità ad altri funghi o batteri che portano la parete cellulare. La determinazione delle percentuali di fagocitosi sui leucociti fornisce un mezzo ai microbiologi per valutare la virulenza di un agente patogeno o per confrontare patogeni tipi selvatici e mutanti, nonché con gli immunologi per studiare le capacità di leucociti umani per combattere gli agenti patogeni.
Introduction
L'aspergillosi polmonare invasiva è una grande minaccia per i pazienti immunocompromessi in quanto le opzioni di trattamento sono limitate e hanno successo solo dopo la diagnosi precoce, il che porta ad alti tassi di mortalità1. Gli agenti infettivi sono conidia (spore) dello stampo Aspergillus fumigatus che sono onnipresenti per la maggior parte degli habitat2. I Conidia vengono inalati, passano attraverso le vie aeree e possono finalmente entrare negli alveoli polmonari. Negli esseri umani immunocompetenti, queste conidie vengono eliminate da cellule immunitarie innate come monociti o macrofagi e granulociti neutrofili, che assumono (fagocitosi) e digeriscono gli agenti patogeni3. La fagocitosi è importante per i microbiologi e gli immunologi allo stesso modo quando sono interessati alle interazioni ospite-patogeno. I saggi di confronto, come la co-incubazione di leucociti e conidi, spesso includono l'etichettatura delle spore da fluoresceina o dalla sua fluoresceina derivata isothiocyanate (FITC). Utilizzando un microscopio, è semplice identificare conidia fluorescente interiorizzata e determinare la conidia collegata / aderente, anche se questo approccio è ingombrante e realisticamente limitato a poche centinaia di cellule4. Tuttavia, nella citometria di flusso che consente facilmente l'analisi di centinaia di migliaia di cellule in pochi minuti, la colorazione differenziale di conidia fagocitosa e aderente è vitale. Pertanto, molti protocolli si basano su Trypan Blue per dissetare FITC-fluorescenza da aderente conidia5,6,7,8. Un altro approccio è lo sfruttamento del trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza di bromuro di etidio e FITC per emettere rosso invece di fluorescenza verde da aderente conidia9,10,11. Se sono disponibili anticorpi specifici, come nel caso di alcuni batteri, le particelle legate alle cellule possono essere macchiate direttamente12,13.
Qui, presentiamo un protocollo per valutare rapidamente e quantitativamente la fagocitosi di A. fumigatus conidia con ileuciti umani insieme all'attaccamento delle spore alle cellule e alla mancanza di interazione utilizzando un anticorpo anti-FITC accoppiato all'allocazione (APC). Il metodo consente anche l'analisi citometrica a flusso simultaneo di ulteriori marcatori cellulari che possono essere impiegati per l'analisi separata della fagocitosi da monociti e neutrofili dello stesso campione.
Il protocollo può essere applicato per la caratterizzazione dei ceppi fungini (ad esempio, diverse specie di Aspergillus e altri stampi del genere Mucorales qui presentati) e dei loro mutanti14 e ricerca immunologica sui fagociti, come i leucociti da individui immunocompromessi.
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Protocol
Questo protocollo include l'uso di camici buffy umani ottenuti dall'Institute for Transfusion Medicine, jena University Hospital e sangue venoso fresco prelevato dai pazienti, sia dopo il consenso informato scritto dei donatori in conformità con l'approvazione del comitato etico 4357-03/15.
1. Preparazione di Aspergillus fumigatus Conidia
- Coltivare A. fumigatus su 1,5% di malto agar Petri piatti per 5 giorni a 37 gradi centigradi senza CO2.
A. fumigatus è un microrganismo di livello 2 di biosicurezza e deve essere maneggiato in una struttura appropriata utilizzando un armadio di biosicurezza e indossando camice da laboratorio, guanti e una maschera di filtro.
NOTA: La piastra deve essere completamente ricoperta da uno strato di conidia verde-grigiastra. Le culture bianche non sporche. Composizione di malto agar: 4% (w/v) estratto di malto, estratto di lievito 0.4% (w/v), agar 1.5% (w/v), Aqua dest. - Conidia di raccolta
- Mettere un tovagliolo di carta bagnato con disinfettante nell'armadio di biosicurezza e mettere la piastra sopra per evitare una distribuzione eccessiva di conidia volatile.
- Aggiungere 10 mL di fosfato tamponato salina (PBS) - 0.01% detergente sulla parte superiore del fungo, utilizzare una spatola Drigalski per stendere il liquido sopra la piastra e strofinare fuori la conidia di colore scuro. Fare attenzione a non rimuovere il micelio bianco.
- Mettere la sospensione della conidia in un tubo da 50 mL utilizzando un colino a cellule da 30 m per rimuovere qualsiasi micelio residuo.
- Ripetere i passaggi 1.2.2 e 1.2.3 e raccogliere nello stesso tubo da 50 mL.
- Girare per 5 min a 2.600 x g a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e risospendere in 20 mL di sterile Aqua dest.
- Determinare la concentrazione di conidia con una camera di conteggio Thoma.
N.B.:Il protocollo può essere messo in pausa qui e la sospensione conidia memorizzata per un massimo di 1 mese a 4 gradi centigradi con il coperchio avvitato strettamente.
- Etichettatura FITC
- Preparare una soluzione di 0,1 mM di polvere FITC in sterile 0,1 M Na2CO3 (disciolto in PBS).
AGGIORNAMENTO: La polvere FITC è pericolosa e deve essere maneggiata con guanti, occhiali e una maschera di filtro. Raccogliere i rifiuti secondo le normative locali.
NOTA: Omettere la luce artificiale durante questo e i seguenti passaggi che coinvolgono conidia. - Risospendere 1 x 108 (o meno) conidia in 5 mL di soluzione FITC in un tubo da 15 mL. Incubare per 20 min a 37 gradi centigradi in un rotatore.
- Per il controllo negativo, risospendere la conidia in 0,1 M Na2CO3 (senza FITC) in un tubo da 15 mL. Incubare per 20 min a 37 gradi centigradi in un rotatore.
NOTA: Nel calcolo della quantità di conidia da macchiare, tenere conto di una perdita fino al 70% durante la colorazione, il gonfiore e tutte le necessarie fasi di lavaggio. Se non è disponibile alcun rotatore, la sospensione deve essere scossa tre volte durante l'incubazione. - Per il lavaggio, aggiungere 10 mL di PBS - 0,01% detergente alla sospensione e girare per 5 min a 2.600 x g a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e ripetere il lavaggio due volte con 10 mL di detersivo PBS - 0,01%.
- Preparare una soluzione di 0,1 mM di polvere FITC in sterile 0,1 M Na2CO3 (disciolto in PBS).
- Gonfiore della conidia (può essere omesso se non lo si desidera)
- Resospendi il FITC conidiato conidia in 5 mL del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio - 10% Siero di vitello fetale (FCS) e incuba reca in un rotatore a 37 gradi centigradi per il tempo desiderato (ad esempio, 2 h, 4 h).
NOTA: Se non è disponibile alcun rotatore, la sospensione deve essere agitata almeno ogni 20 min durante l'incubazione. - Aggiungete 10 mL di PBS - detergente allo 0,01% alla sospensione e girate per 5 min a 2.600 x g a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e lavare due volte con 10 mL di detersivo pbS - 0,01%.
- Filtrare attraverso un colino a 30 m per rimuovere grandi ciuffi di conidia.
- Resospendi il FITC conidiato conidia in 5 mL del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio - 10% Siero di vitello fetale (FCS) e incuba reca in un rotatore a 37 gradi centigradi per il tempo desiderato (ad esempio, 2 h, 4 h).
- Fissaggio di conidia (può essere omesso se non lo si desidera)
- Risospendere FITC etichettato e gonfio conidia in 1 mL di formaldeide e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
- Aggiungete 10 mL di PBS - detergente allo 0,01% alla sospensione e girate per 5 min a 2.600 x g a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e lavare due volte con 10 mL di detersivo pbS - 0,01%.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e la conidia memorizzata in PBS al buio (tubo avvolto in un foglio di alluminio) per un massimo di 1 settimana a 4 gradi centigradi.
2. Preparazione dei leucociti della Primaria Umana
- Mettere 5 mL di cappotto di bufala in un tubo da 50 mL. In alternativa, utilizzare sangue venoso periferico umano fresco prelevato in monovette di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) (10 mL per tubo 50 mL).
PRUDENTE: Il sangue umano può trasmettere virus come il virus dell'immunodeficienza umana e il virus dell'epatite B. Maneggiare solo dopo essere stato vaccinato contro l'epatite B. Manico in un armadietto di biosicurezza indossando camice da laboratorio e guanti. - Riempire il tubo con Erithrocyte Lysis (EL) Buffer, invertire tre volte e incubare per 5-8 min orizzontalmente fino a quando l'aspetto lattiginoso della miscela diventa chiaro.
NOTA: Occasionalmente, il sangue può richiedere più tempo per la liscivia. Vai dal capre. Non è insolito che due tubi dello stesso sangue prendano tempi diversi per la lisce. Composizione del buffer EL: 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA - Girare per 10 min a 300 x g a temperatura ambiente. Scartare il super-attardato.
- Risospendere il pellet in 1 mL di EL Buffer mediante pipettaggio. Quindi aggiungere altri 24 mL di buffer EL e invertire più volte.
- Girare per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
- Scartare le cellule sovrnatali e risospendere nuovamente in 1 mL di RPMI - 10% FCS.
- Determinare la concentrazione cellulare con una camera di conteggio Neubauer.
3. Saggio di fagocitosi
- Incubare 2 x 106 leuciti e 4 x 106 conidia con etichettata FITC (molteplicità di infezione 2) in 1,5 mL di RPMI - 10% FCS in una piastra di coltura cellulare 12-well. Come controlli, includere solo le celle (senza conidia) e le celle, senza etichetta.
- Mettere in un'incubatrice di CO2 umidificata a 37 gradi centigradi e incubare per il periodo di tempo desiderato (ad esempio, 0,5 h, 2 h o 4 h).
- Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e mettere in un tubo da 15 mL.
- Girare per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
- Raccogliere supernatante per l'analisi citochina o scartare se non voluto. Risospendere ogni campione in 100 gradi l di PBS - 2 mM edTA.
4. Colorazione anticorpale
- Per ogni campione, preparate 100 luna di miscela di anticorpi, incluso l'anticorpo anti-FITC APC, secondo la tabella 1.
- Mettete un campione di 100 L in un pozzo di una piastra v-fondo da 96 pozze. Aggiungere 150 l di PBS e 2 mM di EDTA per il lavaggio.
- Per la compensazione del colore, posizionare 1 x 106 celle per ogni colore in ulteriori pozzi della piastra inferiore A 96-well V. Includere un pozzo di cellule che viene lasciato incontaminato. Aggiungere 150 l di PBS e 2 mM di EDTA per il lavaggio.
- Coprire la piastra con un foglio adesivo.
- Girare per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Rimuovere la pellicola.
- Scartare il supernatante invertendo rapidamente e forzatamente la piastra solo una volta sopra il lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta.
NOTA: Non ripetere o battere la piastra su una carta fino a quando non si asciuga in quanto ciò comporterà una massiccia perdita di cellule dalla piastra. - Risospendere le cellule nella miscela di anticorpi da 100 e mescolare bene con la pipettatura.
- Per la compensazione del colore, risospendere le rispettive cellule in 100 : L di PBS - 2 mM EDTA e aggiungere un singolo anticorpo ad ogni pozzo alla stessa quantità utilizzata nella miscela anticorpale.
- Coprire con un foglio adesivo e incubare per 20 min a temperatura ambiente al buio.
- Rimuovere la pellicola. Aggiungete 150 l di PBS e 2 mM di EDTA a ciascun pozzo per il lavaggio. Coprire con un foglio adesivo.
- Girare per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Rimuovere la pellicola. Scartare il supernatante invertendo rapidamente e forzatamente la piastra sopra il lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta.
- Risospendere in 200 gradi di PBS - 2 mM di EDTA e trasferire le celle da ogni pozzo a un tubo inferiore rotondo separato. Assicurarsi che non siano presenti gruppi cellulari nella sospensione. Rimuovere i cluster in caso contrario.
NOTA: Ogni ammasso abbastanza grande da far vedere all'occhio è abbastanza grande da intasare potenzialmente il citometro.
5. Citometria di flusso
- Avviare il citometro di flusso e lasciarlo riscaldare. Avviare il software di acquisizione.
- Creare un nuovo esperimento e impostare ed etichettare gli esempi.
- Impostare i parametri (FSC 250, SSC 250) e i rilevatori per i fluorofori FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-Cy5.5.
- Impostazione retribuzione
- Aprire l'impostazione della retribuzione.
- Indicare i singoli colori.
- Utilizzando le celle di controllo lasciate instainate o con singole colorazioni, impostare le tensioni del rivelatore PMT in modo da includere tutti gli eventi all'interno della scala.
- Registrare almeno 10.000 eventi di ogni controllo.
- Utilizzare la configurazione retributiva per calcolare la fuoriuscita di fluorofori e applicare alle impostazioni del citometro dell'esperimento.
- Registrazione dei dati di esempio
- Visualizzare FSC e SSC nel software di acquisizione e impostare cancello intorno leucociti.
- Basato sul cancello leukocito, visualizzare dot plot SSC/CD45 e cancello per le celle CD45 per separare dalla conidia.
- Visualizzare separatamente le celle CD45 in un grafico a punti CD14/CD66b e i monociti del cancello (CD14) e i neutrofili (CD66b).
- Visualizzare i neutrofili in un punto grafico anti-FITC/FITC.
- Utilizzando il campione con conidia non etichettata, impostare i quadranti per i segnali anti-FITC e FITC, consentendo un massimo dell'1% delle cellule nei rispettivi quadranti.
- Ripetere i passaggi 5.5.4 e 5.5.5 per il cancello monocite.
- Registra tutti i campioni con almeno 20.000 eventi nel cancello del leucocito.
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Representative Results
Nella misurazione della fagocitosi di A. fumigatus conidia da cellule fagocitiche umane, la discriminazione tra l'autentica internalizzazione e il semplice attaccamento di conidia alle cellule è un ostacolo, soprattutto quando si tratta di metodi ad alto throughput come la citometria di flusso. Al fine di superare questo ostacolo, presentiamo un protocollo veloce e affidabile basato sulla colorazione della conidia con la tintura fluorescente FITC prima della co-incubazione di cellule e conidia, seguita da una controvendita con un anticorpo anti-FITC etichettato APC dopo l'incubazione (Figura 1A). Come mostrato nella Figura 1B, le conidia con etichetta tramite FITC sono fagocitose ed esibite da monociti umani e neutrofili che forniscono un segnale verde alle cellule. Queste conidia sono inaccessibili per l'anticorpo anti-FITC e, quindi, non possono legare l'anticorpo e le cellule appaiono APC negativo (FITC, APC-). Le cellule non interagenti non acquisiscono un segnale verde dalla conidia con etichettata FITC e rimangono FITC-, APC-. Alcune celle appaiono FITC-, APC. Poiché l'anticorpo aPC anti-FITC non dovrebbe essere in grado di legare le cellule senza conidia con etichettata FITC, questi eventi sono considerati artefatti di colorazione. Le conidie con etichettatura FITC, che sono attaccate alle cellule ma non interiorizzate, rendono le cellule anche positive per FITC, ma forniscono anche un obiettivo per l'anticorpo anti-FITC che rende queste cellule doppio positivo per FITC e APC (FITC, APC). Quando analizzata al microscopicamente, questa popolazione conteneva fino al 20% di cellule con conidia attaccata solo nei nostri esperimenti.
L'utilizzo degli anticorpi descritti in questo protocollo e la strategia di gating nella Figura 1D, un gating generale delle caratteristiche di leucociti umani da parte delle caratteristiche FSC e SSC è seguito da una separazione dei leucociti e dei conidii liberi dal marcatore pan-leucocito CD45. Soprattutto quando si utilizza conidia gonfia e/o lunghi tempi di incubazione, conidia può raggiungere quasi le dimensioni delle cellule al momento della citometria di flusso e quindi l'analisi di bias. Poiché i monociti primari e i neutrofili umani assumono conidia in modo diverso, questo protocollo permette di analizzare separatamente queste popolazioni cellulari in base alla colorazione con i marcatori di lignaggio cellulare ben consolidati CD14 per i monociti e CD66b per i neutrofili. La lotta per la fagocitosa e le popolazioni di cellule aderenti viene effettuata sulla base di campioni di controllo con conidia senza etichetta che non trasportano né un FITC né un segnale APC anti-FITC. Quando APC e FITC sono tracciati l'uno contro l'altro, i quadranti sono impostati in modo tale che un massimo di 1% celle sono consentiti nelle porte di interesse.
La percentuale di fagociti primari umani che interiorizzano la conidia può essere altamente variabile tra i donatori di sangue, ma dipende anche da fattori sperimentali come il tempo di incubazione e lo stato di gonfiore della conidia. L'internalizzazione delle spore può essere rilevata dopo 0,5 h di co-incubazione già e aumenta con il tempo (Figura 2A). Le conidie pre-gonfie sono più facili delle spore a riposo (non gonfie) anche in tempi di incubazione brevi (Figura 2B). Se la conidia è fissata con formaldeide, la fagocitosi è diminuita rispetto alla conidia nativa (Figura 2C).
| Reagente | l per campione |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0.5 |
| CD66b PerCP-Cy5,5 | 1.5 |
| anti-FITC APC | 0.5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| Totale | 100 |
Tabella 1: Miscela di anticorpi per la citometria di flusso. Le quantità di ogni reagente sono date come microlitri per campione (1 x 106 cellule) da analizzare.
Figura 1: Impostazione e analisi del saggio di fagocitosi citometrica del flusso. (A) Schema del protocollo comprendente la conidia e la preparazione cellulare e la controtendenza. (B) La fagocitosi viene analizzata tracciando i dati citometrici di flusso della conidia con etichettata FITC contro la controstazione anti-FITC APC. Le popolazioni risultanti indicano percentuali di leucociti non interagenti (FITC-, APC-), leuciti con conidia aderente (FITC, APC) e fagocitosi leucociti (FITC, APC-) e artefatti di colorazione (FITC-, APC). (C) Le popolazioni cellulari doppie positive di 3 diversi esperimenti con 3 diversi donatori (due dei quali eseguiti in duplicati, uno eseguito singolarmente) sono state conteggiate al microscopio per le conidie interne e attaccate. (D) Rappresentante della strategia di dati citometrici di flusso per rilevare i leucociti (CD45), identificare i monociti (CD14) e i neutrofili (CD66b) e determinare le popolazioni interagenti (FITC, anti-FITC). Questa cifra è stata modificata da Hartung et al., Cytometry A, 95: 3, p. 332-338 (2019)14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La fagocitosi di conidia da parte dei fagociti primari umani dipende da diverse condizioni. (A) La percentuale di cellule che interiorizzano la conidia a riposo è aumentata con il tempo di co-incubazione. (B) La fagocitosi è aumentata con il tempo di gonfiore conidico quando co-incubato per 0,5 h. (C) Conidia nativa erano meglio fagocitosed di conidia fissa. I dati sono stati ottenuti da 10 donatori diversi (A,B) o 5 donatori diversi (C) in 10 (A, B) o 5 esperimenti indipendenti (C). Le barre di errore indicano SD. Questa cifra è stata modificata da Hartung et al., Cytometry A, 95: 3, p. 332-338 (2019)14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'analisi della fagocitosi è un mezzo per valutare la funzionalità dei fagociti primari umani e caratterizzare gli stampi clinicamente rilevanti. (A) Confronto esemplare di monociti di un donatore sano e di un paziente immunosoppresso (dopo il trapianto di cellule staminali ematopoietiche) la fagocitossing di conidia a riposo per 0,5 h, 2 h e 4 h. (B) La fagocitosi della conidia fungina a riposo è stata determinata per le specie di Aspergillus e Mucorale clinicamente rilevanti dopo 2 h-incubation. I dati sono stati ottenuti da 5 (Aspergillus) o 3 (Mucorales) diversi donatori in 5 o 3 esperimenti indipendenti ciascuno. Le barre di errore indicano Abbreviazioni SD: A. Aspergillus, L. Lichtheimia, M. Mucor, R. Rhizopus Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo presenta un metodo citometrico a flusso rapido per misurare l'interazione di A. fumigatus conidia con un gran numero di leucociti umani primari che non è possibile nei protocolli microscopici comuni. L'imaging delle cellule con un microscopio e il conteggio manuale delle conidie interiorizzate sono ingombranti e possono realisticamente essere eseguite solo per alcune centinaia di cellule. La citometria di flusso supera questo problema misurando migliaia di cellule in pochi minuti. Un ostacolo comune a entrambi gli approcci è la distinzione di conidia fagocitosata e aderente rispettivamente all'interno o all'interno delle cellule. In microscopia, il bianco colorante calcofluor è spesso usato per colorare conidia aderente, ma il suo utilizzo è limitato ai microrganismi con una parete cellulare contenente chitina.
Questo protocollo invece ha utilizzato fluorofori distinti per la caratterizzazione degli eventi di interazione che consente l'aggiunta di ulteriori marcatori di cella, come i marcatori di derivazione CD45, CD14 e CD66b. Così, è anche possibile discriminare la fagocitosi degli agenti patogeni da monociti e neutrofili in un singolo campione. Mentre la scelta di marcatori e fluorofori per l'identificazione cellulare può essere adattata alle esigenze dell'esperimento e alle capacità del citometro disponibile, l'uso dell'anticorpo aPC specifico APC menzionato in questo protocollo è raccomandato in quanto anticorpo più affidabile nelle nostre mani.
Poiché le conidia fissa di formaldeide non sono internalizzate altrettanto bene, le spore autoctone sono raccomandate per i saggi di fagocitosi. Tuttavia, la conidia nativa inizierà o continuerà a gonfiarsi durante la co-incubazione con i leucociti umani e alla fine germina. Tipicamente, A. fumigatus conidia germinadopoo dopo circa 8-9 h in supporti contenenti glucosio a 37 gradi centigradi. La combinazione di tempo di gonfiore e tempo di co-incubazione con fagociti non deve superare questo lasso di tempo in quanto la germinazione causa la perdita del FITC sulla superficie della conidia. Più importante, i germi non possono più essere fagocitosi da monociti o neutrofili. Invece, questi fagociti si accumulano intorno e si attaccano a i germi che producono cluster cellulari che intasano il citometro, se non rimosso. Allo stesso modo, 4 h conidia gonfia tendono a generare cluster tra di loro e con le cellule. Spesso questi ammassi non possono più essere separati meccanicamente e le cellule all'interno vengono perse per l'analisi citometrica del flusso.
Anche se il gating è semplice e facile all'inizio, più le conidie sono interiorizzate dalle cellule, il gating più sfocato può diventare. L'uso di MOI > 2 aumenta la fagocitosi nei punti temporali iniziali, ma potrebbero verificarsi problemi anche prima. Pertanto, i MOI devono essere attentamente determinati con le cellule specifiche e gli agenti patogeni di interesse.
Una limitazione di questo protocollo è nella dualità della popolazione cellulare con conidia aderente (FITC, APC) che potrebbe anche ospitare cellule con conidia aderente e interiorizzata. Una possibilità per un'ulteriore discriminazione è l'applicazione della citometria del flusso di imaging15 che consente l'imaging visivo di tutte le cellule misurate nel citometro di flusso.
A causa dell'etichettatura FITC non specifica della parete cellulare conidiale, questo metodo è facilmente trasferibile ad altri funghi di interesse come stampi clinicamente rilevanti del genere Mucorales o il lievito Candida albicans. Inoltre, anche i batteri che portano le pareti cellulari possono essere etichettati come FITC. La controtendenza universale con l'anticorpo anti-FITC consente una misurazione rapida e facile della fagocitosi di tutti questi patogeni allo stesso modo da parte di un gran numero di leucociti umani.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la signora Pia Stier per l'eccellente assistenza tecnica. M. von Lilienfeld-Toal è supportato dal Center for Sepsis Control and Care (Ministero federale tedesco dell'istruzione e della salute, BMBF, FK, FK, 01E01002) e dal campo di ricerca InfectoGnostics (BMBF, FK-13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang è supportato dalla Jena School of Microbial Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FK 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
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