Summary
Detta protokoll ger en snabb och tillförlitlig metod för att kvantitativt mäta fagocytos av Aspergillus fumigatus conidia av humana primära fagocyter med flödescytometri och att diskriminera fagocytos av conidia från blotta vidhäftning till leukocyter.
Abstract
Invasiv lunginfektion av mögel Aspergillus fumigatus utgör ett stort hot mot patienter med nedsatt immunförsvar. Inhalerad svamp conidia (sporer) rensas från den mänskliga lung alveolerna genom att vara fagocyterade av medfödda monocyter och/eller neutrofiler. Detta protokoll erbjuder en snabb och tillförlitlig mätning av fagocytos genom flödescytometri med fluorescein isotiocyanat (FITC)-märkt conidia för co-inkubation med humana leukocyter och efterföljande motfärgning med en anti-FITC antikropp för att möjliggöra diskriminering av internaliserade och cell-anhängare av conidia. Stora fördelar med detta protokoll är dess rapidness, möjligheten att kombinera analysen med kors analys av andra cell markörer av intresse, den samtidiga analysen av monocyter och neutrofiler från ett enda prov och dess tillämplighet på andra cell vägg-bärande svampar eller bakterier. Bestämning av procentsatser av fagocytosing leukocyter ger ett sätt att mikrobiologer för utvärdering virulens av en patogen eller för att jämföra patogen vildtyper och mutanter samt Immunologer för att undersöka mänskliga leukocyt förmåga att bekämpa patogener.
Introduction
Invasiv pulmonell aspergillos är ett stort hot mot patienter med nedsatt immunförsvar eftersom behandlingsalternativ är begränsade och endast framgångsrika vid tidig diagnos, vilket leder till hög dödlighet1. Smittämnen är conidia (sporer) av mögel Aspergillus fumigatus som är allestädes närvarande till de flesta Habitat2. Conidia inhaleras, passera genom luftvägarna och kan slutligen komma in i lungorna alveoler. I immunkompetenta människor, dessa conidia rensas av medfödda immunceller såsom monocyter eller makrofager och neutrofila granulocyter, som tar upp (phagocytose) och smälta patogener3. Fagocytos är viktigt för mikrobiologer och Immunologer jämväl när intresserade av värd-patogenen interaktioner. Konfrontation analyser, såsom Co-inkubation av leukocyter och conidia, ofta omfattar märkning av sporer av fluorescein eller dess derivat fluorescein isotiocyanat (FITC). Med hjälp av ett mikroskop, är det enkelt att identifiera internaliserade fluorescerande conidia och för att bestämma bifogade/adherent conidia, även om detta tillvägagångssätt är besvärligt och realistiskt begränsad till några hundra av celler4. Men i flödescytometri som lätt tillåter analys av hundratusentals celler inom några minuter, är differentiell färgning av fagocytos och anhängare conidia avgörande. Därför förlitar sig många protokoll på trypan Blue för att släcka FITC-fluorescens från anhängare conidia5,6,7,8. En annan metod är att utnyttja fluorescensresonans energiöverföring av etidiumbromid bromid och FITC att avge rött i stället för grön fluorescens från anhängare conidia9,10,11. Om specifika antikroppar finns tillgängliga, vilket är fallet för vissa bakterier, kan cell bundna partiklar direkt färgas12,13.
Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt och kvantitativt bedöma fagocytos av FITC-märkt a. fumigatus conidia av humant leukocyter tillsammans med fastsättning av sporer till celler och bristande interaktion genom att anställa en allophycocyanin (APC)-kopplad anti-FITC antikropp. Metoden gör det också möjligt för samtidig flödescytometrisk analys av ytterligare cell markörer som kan användas för separat analys av fagocytos av monocyter och neutrofiler från samma prov.
Protokollet kan tillämpas för karakterisering av svampstammar (t. ex. flera arter av Aspergillus och andra formar från släktet Mucorales presenteras här) och deras mutanter14 och immunologisk forskning om fagocyter, såsom leukocyter från immunkomprometterade individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll omfattar användning av mänskliga Buffy Coats som erhållits från Institutet för transfusionsmedicin, Jena universitetssjukhus och färskt venöst blod från patienter, både efter skriftligt informerat samtycke av givarna i enlighet med etikkommitténs godkännande 4357-03/15.
1. beredning av Aspergillus fumigatus conidia
- Grow A. fumigatus på 1,5% malt agar petriskålar för 5 dagar vid 37 ° c utan Co2.
Varning: a. fumigatus är en biosäkerhetsnivå 2 mikroorganism och måste hanteras i en lämplig anläggning med hjälp av ett biosäkerhetsskåp och bär labbrock, handskar och en filtermask.
Anmärkning: plattan bör täckas helt med ett grönt-gråaktigt skikt av conidia. Vita kulturer inte sporulera. Sammansättning av malt agar: 4% (w/v) maltextrakt, jästextrakt 0,4% (w/v), agar 1,5% (w/v), Aqua dest. - Skörd conidia
- Placera en pappershandduk våt med desinfektionsmedel i biosäkerhets skåpet och Lägg plattan ovanpå för att förhindra överdistribution av flyktiga conidia.
- Tillsätt 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 0,01% tvättmedel ovanpå svampen, Använd en Drigalski spatel för att sprida vätskan över plattan och gnugga bort den mörkfärgade conidia. Var noga med att inte ta bort den vita mycel.
- Sätt conidia suspensionen till en 50 mL tub med en 30 μm cell sil för att ta bort eventuella kvarvarande mycel.
- Upprepa steg 1.2.2 och 1.2.3 och samla i samma 50 mL-rör.
- Snurra i 5 minuter vid 2 600 x g vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och Omsuspendera i 20 mL sterilt Aqua dest.
- Bestäm koncentrationen av conidia med en räknekammare i Thoma.
Obs: protokollet kan pausas här och conidia suspensionen lagras i upp till 1 månad vid 4 ° c med locket skruvas tätt.
- FITC märkning
- Bered en 0,1 mM lösning av FITC pulver i steril 0,1 M na2Co3 (upplöst i PBS).
Försiktighet: FITC Powder är farligt och bör hanteras med handskar, skyddsglasögon och en filtermask. Samla in avfall enligt lokala föreskrifter.
Anmärkning: utelämna artificiellt ljus under detta och följande steg med conidia. - Omsuspendera 1 x 108 (eller mindre) conidia i 5 ml FITC-lösning i en 15 ml tub. Inkubera i 20 minuter vid 37 ° c i en rotator.
- För den negativa kontrollen, Omsuspendera cellerna under conidia i 0,1 M na2Co3 (utan FITC) i en 15 ml tub. Inkubera i 20 minuter vid 37 ° c i en rotator.
Anmärkning: vid beräkning av mängden conidia som ska färgas, ta hänsyn till en förlust på upp till 70% under färgning, svullnad och alla nödvändiga tvättsteg. Om det inte finns någon rotator ska suspensionen skakas tre gånger under inkubering. - För tvättning, tillsätt 10 mL PBS + 0,01% tvättmedel till suspensionen och snurra i 5 min vid 2 600 x g vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten och upprepa tvätt två gånger med 10 mL PBS + 0,01% tvättmedel.
- Bered en 0,1 mM lösning av FITC pulver i steril 0,1 M na2Co3 (upplöst i PBS).
- Svullnad av conidia (kan utelämnas om inte önskas)
- Resuspend FITC märkt conidia i 5 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium + 10% fetalt kalv serum (FCS) och inkubera i en rotator vid 37 ° c för önskad tid (t. ex., 2 h, 4 h).
Anmärkning: om det inte finns någon rotator ska suspensionen skakas minst var 20: de minut under inkubering. - Tillsätt 10 mL PBS + 0,01% tvättmedel till suspensionen och snurra i 5 min vid 2 600 x g vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och tvätta två gånger med 10 mL PBS + 0,01% tvättmedel.
- Filtrera genom en 30 μm cell sil för att ta bort stora klumpar av conidia.
- Resuspend FITC märkt conidia i 5 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium + 10% fetalt kalv serum (FCS) och inkubera i en rotator vid 37 ° c för önskad tid (t. ex., 2 h, 4 h).
- Fixering av conidia (kan utelämnas om inte önskas)
- Omsuspendera FITC märkt och svullet conidia i 1 mL formaldehyd och inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
- Tillsätt 10 mL PBS + 0,01% tvättmedel till suspensionen och snurra i 5 min vid 2 600 x g vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och tvätta två gånger med 10 mL PBS + 0,01% tvättmedel.
Obs: protokollet kan pausas här och conidia lagras i PBS i mörkret (röret insvept i aluminiumfolie) för upp till 1 vecka vid 4 ° c.
2. beredning av humana primära leukocyter
- Sätt 5 mL av Buffy Coat i en 50 mL tub. Alternativt, Använd färskt humant perifert venöst blod som dras in i etylendiamintetraättiksyra (EDTA) monovetter (10 mL per 50 mL rör).
Varning: humant blod kan överföra virus som humant immunbristvirus och hepatit B-virus. Handtaget först efter att ha vaccinerats mot hepatit B. handtag i ett biosäkerhetsskåp som bär labbrock och handskar. - Fyll röret med Erytrocytlys (EL) buffert, vänd tre gånger och inkubera för 5-8 min horisontellt tills den mjölkiga utseendet på blandningen blir klar.
Obs: ibland, blodet kan ta längre tid att lyse. Gå efter utseendet. Det är inte ovanligt att två tuber av samma blod tar olika tider till lyse. Sammansättning av EL buffert: 0,15 M NH4cl, 10 mm KHCO3, 0,1 mm EDTA - Snurra i 10 minuter vid 300 x g vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera pelleten i 1 mL EL-buffert genom pipettering. Tillsätt sedan ytterligare 24 mL EL-buffert och Invertera flera gånger.
- Snurra i 5 minuter vid 300 x g vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i 1 mL RPMI + 10% FCS.
- Bestäm cellkoncentrationen med en Neubauer-räknekammare.
3. phagocytosis analys
- Inkubera 2 x 106 leukocyter och 4 x 106 FITC-märkta conidia (mångfald av infektion = 2) i 1,5 ml RPMI + 10% FCS i en 12-brunn cellkultur tallrik. Som kontroller, inkludera endast celler (ingen conidia) och celler + omärkt conidia.
- Placera i en fuktad CO2 inkubator vid 37 ° c och Inkubera under önskad tidsperiod (t. ex. 0,5 h, 2 h eller 4 h).
- Efter inkubering, skörda celler med en cell skrapa och sätta i en 15 mL tub.
- Snurra i 5 minuter vid 300 x g vid rumstemperatur.
- Samla supernatanten för cytokin analys eller kassera om inte ville. Omsuspendera varje prov i 100 μL PBS + 2 mM EDTA.
4. färgning av antikroppar
- Förbered 100 μL av antikropps blandningen, inklusive APC anti-FITC antikropp, enligt tabell 1för varje prov.
- Sätt ett prov på 100 μL i en brunn på en 96-och V-bottenplatta. Tillsätt 150 μL PBS + 2 mM EDTA för tvättning.
- För färgkompensation, placera 1 x 106 celler för varje färg i ytterligare brunnar i 96-well V bottenplattan. Inkludera en brunn av celler som lämnas ofärgade. Tillsätt 150 μL PBS + 2 mM EDTA för tvättning.
- Täckplåt med en självhäftande folie.
- Snurra i 5 minuter vid 300 x g vid rumstemperatur. Ta bort folien.
- Kassera supernatanten genom att snabbt och kraftfullt Invertera plattan endast en gång över diskbänken eller en disponibel pappershandduk.
Obs: Upprepa inte eller knacka plattan på ett papper tills torr eftersom detta kommer att resultera i en massiv förlust av celler från plattan. - Omsuspendera cellerna i 100 μL antikropps blandning och blanda väl genom pipettering.
- För färgkompensation, Omsuspendera respektive celler i 100 μL PBS + 2 mM EDTA och tillsätt en enda antikropp till varje brunn vid samma mängd som används i antikropps blandningen.
- Täck med en självhäftande folie och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Ta bort folien. Tillsätt 150 μL PBS + 2 mM EDTA till varje brunn för tvättning. Täck med en självhäftande folie.
- Snurra i 5 minuter vid 300 x g vid rumstemperatur. Ta bort folien. Kassera supernatanten genom att snabbt och kraftfullt Invertera plattan över diskbänken eller en disponibel pappershandduk.
- Omsuspendera i 200 μL PBS + 2 mM EDTA och överför celler från varje brunn till ett separat runt botten rör. Kontrollera att det inte finns några cell kluster i suspensionen. Ta bort kluster på annat sätt.
Obs: varje kluster som är tillräckligt stor för ögat att se är tillräckligt stor för att potentiellt täppa till cytometer.
5. flödescytometri
- Starta flödescytometern och låt den värmas upp. Starta förvärvs programvaran.
- Skapa ett nytt experiment och konfigurera och etikettera exemplen.
- Ställ in parametrar (FSC 250, SSC 250) och detektorer för fluorophores FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-CY 5.5.
- Inställning av kompensation
- Öppna kompensationsinställningar.
- Ange enskilda färger.
- Med hjälp av kontrollceller lämnas ofärgade eller med enskilda Infärgningar, ställa in PMT detektor spänningar att inkludera alla händelser inom skalan.
- Registrera minst 10 000 händelser för varje kontroll.
- Använd kompensations inställningen för att beräkna spridningseffekterna av fluoroforer och applicera på experimentets flödescytometerns-inställningar.
- Registrera exempeldata
- Display FSC och SSC i förvärvet programvara och ställa Gate runt leukocyter.
- Baserat på leukocyt Gate, Visa dot Plot SSC/CD45 och grind för CD45 + celler att separera från conidia.
- Visa CD45 + celler i en dot Plot CD14/CD66b och Gate monocyter (CD14 +) och neutrofiler (CD66b +) separat.
- Visa neutrofiler i en dot Plot anti-FITC/FITC.
- Använda provet med omärkta conidia, ange kvadranter för anti-FITC och FITC signaler, vilket gör att högst 1% av cellerna i respektive kvadranter.
- Upprepa steg 5.5.4 och 5.5.5 för monocyt Gate.
- Anteckna alla prover med minst 20 000 händelser i leukocytgrinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid mätning av fagocytos av A. fumigatus conidia av humana Fagocytos celler, är diskriminering mellan äkta internalisering och enkel fastsättning av conidia till cellerna ett hinder, särskilt när det gäller hög genomströmning metoder såsom flödescytometri. För att övervinna detta hinder, presenterar vi ett snabbt och tillförlitligt protokoll baserat på färgning av conidia med fluorescerande färg FITC före Co-inkubation av celler och conidia, följt av en motfärgning med en APC-märkt anti-FITC antikropp efter inkubering (figur 1a). Som visas i figur 1B, FITC-märkta conidia är fagocytos av mänskliga monocyter och neutrofiler som ger en grön signal till cellerna. Dessa conidia är otillgängliga för anti-FITC antikropp och, därmed, kan inte binda antikroppen och cellerna visas APC negativ (FITC +, APC-). Icke-samverkande celler inte förvärva en grön signal från FITC-märkta conidia och förbli FITC-, APC-. Några celler visas FITC-, APC +. Eftersom anti-FITC APC antikropp inte bör kunna binda celler utan FITC-märkta conidia, dessa händelser anses färgning artefakter. FITC-märkt conidia, som är knutna till cellerna men inte internaliseras, återge celler också positiva för FITC men också ge ett mål för anti-FITC antikropp som gör dessa celler dubbelt positiv för FITC och APC (FITC +, APC +). När analyseras mikroskopiskt, denna population innehöll upp till 20% av celler med bifogade conidia endast i våra experiment.
Med hjälp av de antikroppar som beskrivs i detta protokoll och efter den gating strategi i figur 1D, en allmän gating av mänskliga leukocyter av FSC och SSC egenskaper följs av en separation av leukocyter och fria conidia av Pan-LEUKOCYT markör CD45. Speciellt när du använder svullna conidia och/eller långa inkubationstider, conidia kan nå nästan Cellstorlek vid tidpunkten för flödescytometri och därmed bias analys. Eftersom mänskliga primära monocyter och neutrofiler ta upp conidia annorlunda, detta protokoll gör det möjligt att separat analysera dessa cellpopulation baserat på färgning med väletablerade cell Lineage markörer CD14 för monocyter och CD66b för neutrofiler. Gating för fagocytosing och anhängare cellpopulationer görs baserat på kontroll prover med omärkta conidia som bär varken en FITC eller en anti-FITC APC signal. När APC och FITC är plottas mot varandra, kvadranter är inställda på ett sådant sätt att högst 1% celler är tillåtna i portarna av intresse.
Andelen humana primära fagocyter internalisera conidia kan vara mycket varierande blandblod givare men beror också på experimentella faktorer såsom inkubering tid och svullnad tillstånd av conidia. Spore internalisering kan upptäckas efter 0,5 h av co-inkubation redan och ökar med tiden (figur 2a). Pre-svullna conidia tas upp lättare än vila (inte svullna) sporer även vid korta inkubationstider (figur 2B). Om conidia fixeras med formaldehyd, minskar fagocytos jämfört med infödda conidia (figur 2C).
| Reagens | μl per prov |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0,5 |
| CD66b PerCP-CY 5,5 | 1,5 |
| anti-FITC APC | 0,5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| Totala | 100 |
Tabell 1: antikropps blandning för flödescytometri. Mängder av varje reagens ges som mikroliter per prov (1 x 106 celler) som ska analyseras.
Figur 1: inställning och analys av flödescytometriskt fagocytos-test. A) systematiken i protokollet, inbegripet conidia och cell beredning och motfärgning. (B) fagocytos analyseras genom plottning av flödescytometriska data från FITC-märkta conidia mot anti-FITC APC-motfärgning. Resulterande populationer indikerar procentsatser av icke-samverkande leukocyter (FITC-, APC-), leukocyter med anhängare conidia (FITC +, APC +) och fagocyterande leukocyter (FITC +, APC-) samt färgning artefakter (FITC-, APC +). (C) dubbel positiva cellpopulationer från 3 olika experiment med 3 olika givare (två av dem utförs i dubbletter, en utförd singel) var mikroskopiskt räknas för internaliseras och bifogas endast conidia. (D) representativ gating strategi av flödescytometriska data för att upptäcka LEUKOCYTER (CD45), identifiera MONOCYTER (CD14) och neutrofiler (CD66b) och bestämma samverkande populationer (FITC, anti-FITC). Denna siffra har modifierats från Hartung et al., Cytometry A, 95:3, s. 332-338 (2019)14. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fagocytos av conidia av humana primära fagocyter beror på flera villkor. (A) procentandel celler som internaliserar vilande conidia ökade med samtidig inkubationstid. B) fagocytos ökade med tiden för svullnad av spridnings när det saminkuberades för 0,5 h. (C) inhemska conidia var bättre fagocytos än fast conidia. Data erhölls från 10 olika givare (a, b) eller 5 olika givare (c) i 10 (a, b) eller 5 (c) oberoende experiment. Felstaplar indikerar SD. Denna siffra har modifierats från Hartung et al., Cytometry A, 95:3, s. 332-338 (2019)14. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av fagocytos är ett sätt att bedöma funktionaliteten hos humana primära fagocyter och karakterisera kliniskt relevanta formar. (A) exemplarisk jämförelse av monocyter från en frisk givare och en immunsupprimerad patient (efter hematopoietisk stamcellstransplantation) fagocytosing vilande conidia för 0,5 h, 2 h och 4 h. (B) fagocytos av vilande svamp conidia bestämdes för kliniskt relevanta Aspergillus och Mucorales arter efter 2 h Co-inkubation. Data erhölls från 5 (Aspergillus) eller 3 (Mucorales) olika givare i 5 eller 3 oberoende experiment vardera. Felstaplar indikerar SD. förkortningar: A. Aspergillus, L. Lichtheimia, M. Mucor, R. Rhizopus vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll presenterar en snabbflödescytometrisk metod för att mäta interaktionen mellan a. fumigatus conidia med ett stort antal primära humana leukocyter som inte är möjligt i vanliga mikroskopiska protokoll. Imaging celler med ett mikroskop och manuellt räkna internaliserade conidia är besvärligt och kan realistiskt göras för några hundra celler bara. Flödescytometri övervinner detta problem genom att mäta tusentals celler inom några minuter. Ett hinder som är gemensamt för båda metoderna är distinktionen mellan fagocytos och anhängare av conidia i respektive celler. I mikroskopi används färgen calcofluor White ofta för färgning anhängare conidia men dess användning är begränsad till mikroorganismer med en Chitin-innehållande cellväggen.
Det här protokollet använde däremot distinkta fluoroforer för karakterisering av interaktions händelser som gör det möjligt att använda ytterligare cell markörer, till exempel härstamning markörer CD45, CD14 och CD66b. Sålunda, det är också möjligt att diskriminera fagocytos av patogener av monocyter och neutrofiler i ett enda prov. Även om valet av markörer och fluoroforer för cell identifiering kan anpassas till experimentets behov och kapaciteten hos den tillgängliga cytometern, rekommenderas användningen av den specifika APC anti-FITC-antikropp som nämns i detta protokoll eftersom det var mest pålitliga antikroppen i våra händer.
Eftersom formaldehyd-fast conidia inte internaliseras lika bra, infödda sporer rekommenderas för fagocytos assays. Men, infödda conidia kommer att starta eller fortsätta svullnad under Co-inkubation med mänskliga leukocyter och så småningom gro. Typiskt, A. fumigatus conidia gror efter ca 8-9 h i glukos-innehållande media vid 37 ° c. Kombinationen av svullnad tid och co-inkubationstid med fagocyter bör inte överstiga denna tidsram som grobarhet orsakar förlusten av FITC på conidia ytan. Viktigare, germlings kan inte fagocytos längre av monocyter eller neutrofiler. Istället, dessa fagocyter ackumuleras runt och hålla sig till germlings att producera cell kluster som täppa till cytometer, om den inte avlägsnas. Likaså, 4 h svullna conidia tenderar att generera kluster sinsemellan och med celler. Ofta kan dessa kluster inte separeras mekaniskt längre och cellerna inom förloras för flödescytometrisk analys.
Även gating är enkel och lätt i början, desto mer conidia internaliseras av celler, kan det gating bli. Använda MOIs > 2 ökar fagocytos vid initiala tidpunkter men gating frågor kan uppstå tidigare också. Därför bör MOIs noggrant bestämmas med specifika celler och patogener av intresse.
En begränsning av detta protokoll är i dualiteten i cellpopulationen med anhängare av conidia (FITC + APC +) som också kan vara härbärgade celler med anhängare samt internaliserade conidia. En möjlighet till ytterligare diskriminering är tillämpningen av Imaging Flow flödescytometrianalys15 som möjliggör visuell avbildning av alla celler mätta i flödescytometern.
På grund av den ospecifika FITC märkning av spridnings cellväggen, denna metod är lätt överföras till andra svampar av intresse såsom kliniskt relevanta formar av släktet Mucorales eller jästen Candida albicans. Dessutom kan också cell-vägg bärande bakterier FITC-märkta. Den universella motfärgning med anti-FITC antikropp möjliggör snabb och enkel mätning av fagocytos av alla dessa patogener både av ett stort antal humana leukocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Pia Stier för ett utmärkt tekniskt bistånd. M. von Lilienfeld-Toal stöds av centrum för sepsis kontroll och omsorg (tyska federala ministeriet för utbildning och hälsa, BMBF, FKZ 01E01002) och InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang stöds av Jena School of mikrobiell kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
