Summary
Bu protokol, aspergillus fumigatus conidia'nın fagositozunu akış sitometrisi kullanarak insan primer fagositler tarafından nicel olarak ölçmek ve konidianın fagositozunu sadece aparatlardan lökositlere ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
Abstract
Küf Aspergillus fumigatus tarafından invaziv pulmoner enfeksiyon bağışıklık hastaiçin büyük bir tehdit oluşturmaktadır. İnhale mantar konidia (sporlar) doğuştan gelen monositler ve/veya nötrofiller tarafından fagositosed olarak insan akciğer alveollerinden temizlenir. Bu protokol, insan lökositleri ile birlikte kuluçka için floresan izotiyoyanat (FITC) etiketli konidia ve daha sonra içselleştirilmiş ve hücre-yapışık konidia ayrımcılığına izin vermek için bir anti-FITC antikor ile sonraki karşı boyama kullanarak akış sitometri tarafından fagositoz hızlı ve güvenilir bir ölçüm sunuyor. Bu protokolün en önemli avantajları, hızlılığı, tahlilleri diğer şüpheli hücre belirteçlerinin sitometrik analizi ile birleştirme olasılığı, tek bir örnekteki monosit ve nötrofillerin eşzamanlı analizi ve diğer hücre duvar taşıyan mantar veya bakterilere uygulanabilirliğidir. Fagositasyon lökosityüzdelerinin belirlenmesi, bir patojenin virülansını değerlendirmek veya patojen yabani tipleri ve mutantları karşılaştırmak için mikrobiyologlara ve patojenlerle mücadele de insan lökosit yeteneklerini araştırmak için immünolojistlere bir araç sağlar.
Introduction
İnvaziv pulmoner aspergillosis, tedavi seçenekleri sınırlı ve sadece erken tanı da başarılı olduğu için immünazatlı hastalar için büyük bir tehdittir, bu da yüksek mortalite oranlarına yol açar1. Enfeksiyöz ajanlar çoğu habitat2 için her yerde olan küf Aspergillus fumigatus konidia(sporlar)vardır. Conidia solunduğunda, solunum yollarından geçer ve sonunda akciğer alveollerine girebilir. İmmün yetersiz insanlarda, bu konidia monositler veya makrofajlar ve nötrofil granülositler gibi doğuştan gelen bağışıklık hücreleri tarafından temizlenir, hangi (fagositoz) almak ve patojenleri sindirmek3. Fagositositaz, konak-patojen etkileşimleri ile ilgili olarak mikrobiyologlar ve immünolojistler için de önemlidir. Lökosit ve konidianın birlikte kuluçkaya yevdirilmesi gibi çatışma denemeleri genellikle floresan veya türevi floresan izotiyoyanat (FITC) ile sporların etiketlemesi içerir. Bir mikroskop kullanarak, bu yaklaşım hantal ve gerçekçi hücrelerin birkaç yüz sınırlı olmasına rağmen, içselleştirilmiş floresan konidia belirlemek ve ekli / yapışık konidibelirlemek için basittir4. Ancak, kolayca dakika içinde hücrelerin yüz binlerce analizini sağlayan akış sitometrisinde, fagositositve yapışık konidianın diferansiyel boyanması hayati önem taşır. Bu nedenle, birçok protokoller adherentconidia5,6,7,8FITC-floresan söndürmek için Trypan Mavi güveniyor. Başka bir yaklaşım yapışık conidia9,10,11yeşil floresan yerine kırmızı yaklamak ethidyum bromür ve FITC floresan rezonans enerji transferi istismar olduğunu . Belirli antikorlar varsa, bazı bakteriler için olduğu gibi, hücrebağlı parçacıklar doğrudan lekeli olabilir12,13.
Burada, insan lökositler tarafından FITC etiketli A. fumigatus conidia fagositozunun hızlı ve nicel olarak değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktayız ve sporların hücrelere bağlanması ve allofikocyanin (APC) birleştirilmiş anti-FITC antikorkullanılarak etkileşim eksikliği. Bu yöntem aynı örnekten monositler ve nötrofiller tarafından fagositözayrı analizi için istihdam edilebilir diğer hücre belirteçleri eşzamanlı akış sitometrik analizi için izin verir.
Protokol, mantar suşlarının (örneğin, burada mucorales cinsinden çeşitli Aspergillus türleri ve diğer kalıpların) ve mutantların14 ve fagositler üzerinde immünolojik araştırmaları, örneğin immünazatlı bireylerden lökositler gibi karakterizasyonu için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Transfüzyon Tıbbı Enstitüsü' nden, Jena Üniversitesi Hastanesi' nden elde edilen insan buffy paltolarının ve hastaların taze venöz kanlarının, hem bağışçıların etik kurulu onayı 4357-03/15 uyarınca yazılı olarak onayını aldıktan sonra kullanılmasını kapsamaktadır.
1. Aspergillus fumigatus Conidia hazırlanması
- Co2olmadan 37 °C'de 5 gün boyunca %1,5 malt agar Petri kaplarında A. fumigatus yetiştirin.
DİkKAT: A. fumigatus bir biyogüvenlik seviyesi 2 mikroorganizmadır ve uygun bir tesiste biyogüvenlik kabini kullanılarak ve laboratuvar önlüğü, eldiven ve filtre maskesi takarak kullanılmalıdır.
NOT: Plaka tamamen yeşil-grimsi bir konidia tabakası ile kaplanmalıdır. Beyaz kültürler düzensiz değildir. Malt agar bileşimi: 4% (w / v) malt özü, maya özü 0.4% (w / v), agar 1.5% (w / v), Aqua dest. - Conidia hasat
- Biyogüvenlik kabinine dezenfektanlı kağıt havlu yerleştirin ve uçucu konidianın aşırı dağılımını önlemek için plakayı üste koyun.
- Mantarın üzerine 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) + %0.01 deterjan ekleyin, sıvıyı tabağa yaymak ve koyu renkli konidiayı ovmak için Drigalski spatula kullanın. Beyaz miselyumu çıkarmamaya dikkat edin.
- Conidia süspansiyonu, kalan miselyumu çıkarmak için 30 m hücreli süzgeç kullanarak 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
- 1.2.2 ve 1.2.3 adımlarını tekrarlayın ve aynı 50 mL tüpte toplayın.
- Oda sıcaklığında 2.600 x g 5 dakika boyunca spin.
- 20 mL steril Aqua dest'te supernatant'ı çıkarın ve yeniden askıya alın.
- Bir Thoma sayma odası ile konidia konsantrasyonu belirleyin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve konidia süspansiyonu 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir ve kapak sıkıca vidalanır.
- FITC etiketleme
- Steril 0,1 M Na2CO3 (PBS'de çözünmüş) FITC tozunun 0,1 mM çözeltisinihazırlayın.
DİkKAT: FITC tozu tehlikelidir ve eldiven, gözlük ve filtre maskesi ile kullanılmalıdır. Yerel yönetmeliklere göre atık toplamak.
NOT: Bu ve konidia içeren aşağıdaki adımları sırasında yapay ışık atlayın. - 15 mL'lik bir tüpte 5 mL FITC çözeltisinde 1 x 108 (veya daha az) konidiyayı yeniden askıya alın. Bir rotator 37 °C'de 20 dakika kuluçka.
- Negatif kontrol için, 15 mL'lik bir tüpte 0,1 M Na2CO3 (FITC olmadan) konidiyayı yeniden askıya alın. Bir rotator 37 °C'de 20 dakika kuluçka.
NOT: Lekelenecek konidia miktarı hesaplanırken, boyama, şişlik ve gerekli tüm yıkama basamaklarında %70'e varan bir kayıp göz önünde bulundurunuz. Rotator yoksa, kuluçka sırasında süspansiyon üç kez sarsılmalıdır. - Yıkama için süspansiyona 10 mL PBS + %0,01 deterjan ekleyin ve oda sıcaklığında 2.600 x g'da 5 dakika boyunca döndürün.
- 10 mL PBS + %0,01 deterjan ile süpernatant'ı çıkarın ve iki kez tekrarlayın.
- Steril 0,1 M Na2CO3 (PBS'de çözünmüş) FITC tozunun 0,1 mM çözeltisinihazırlayın.
- Konidia şişmesi (istenmezse atlanabilir)
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI) orta + %10 Fetal Baldır Serumu (FCS) 5 mL'lik fitidia etiketli FITC'yi yeniden askıya alın ve istenilen süre boyunca 37 °C'de bir rotatörde kuluçkaya yatırın (örn. 2 saat, 4 saat).
NOT: Rotator yoksa, kuluçka sırasında süspansiyon en az 20 dakikada bir sarsılmalıdır. - Süspansiyona 10 mL PBS + %0,01 deterjan ekleyin ve oda sıcaklığında 2.600 x g'da 5 dk döndürün.
- 10 mL PBS + %0,01 deterjan ile süpernatantı çıkarın ve iki kez yıkayın.
- Büyük konidia kümelerini çıkarmak için 30 m'lik hücresüzden süzün.
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI) orta + %10 Fetal Baldır Serumu (FCS) 5 mL'lik fitidia etiketli FITC'yi yeniden askıya alın ve istenilen süre boyunca 37 °C'de bir rotatörde kuluçkaya yatırın (örn. 2 saat, 4 saat).
- Konidianın düzeltilmesi (istenmezse atlanabilir)
- 1 mL formaldehit ve inkübate oda sıcaklığında 1 saat boyunca FITC etiketli ve şişmiş konidia resuspend.
- Süspansiyona 10 mL PBS + %0,01 deterjan ekleyin ve oda sıcaklığında 2.600 x g'da 5 dk döndürün.
- 10 mL PBS + %0,01 deterjan ile süpernatantı çıkarın ve iki kez yıkayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve pbs'de karanlıkta saklanan konidia (alüminyum folyoya sarılmış tüp) 4 °C'de 1 haftaya kadar.
2. İnsan Primer Lökositlerin Hazırlanması
- 50 mL'lik bir tüpe 5 mL buffy kat koyun. Alternatif olarak, etilendimintetraasetik asit (EDTA) monovettes (50 mL tüp başına 10 mL) içine çekilen taze insan periferik venöz kan kullanın.
DİkKAT: İnsan kanı, İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü ve Hepatit B Virüsü gibi virüsleri bulaştırabilir. Hepatit B'ye karşı aşılandıktan sonra, laboratuvar önlüğü ve eldiven giyen bir biyogüvenlik kabininde sapla. - Tüpü Eritrosit Likisi (EL) Tamponu ile doldurun, üç kez ters çevirin ve karışımın sütlü görünümü netleşene kadar yatay olarak 5-8 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Bazen kanın daha uzun sürmesi gerekebilir. Görünüşe göre git. Aynı kandan iki tüpün lyse için farklı zamanlar alması alışılmadık bir durum değildir. EL tamponunun bileşimi: 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA - Oda sıcaklığında 300 x g'da 10 dk çevirin. Supernatant atın.
- Borulama ile 1 mL EL Tampon pelet resuspend. Sonra başka bir 24 mL EL arabellek ekleyin ve birkaç kez ters çevirin.
- Oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dk çevirin.
- 1 mL RPMI + %10 FCS'deki süpernatant ve resuspend hücreleri atın.
- Neubauer sayma odası ile hücre konsantrasyonu belirleyin.
3. Fagositositöz Tsa
- 12 kuyulu hücre kültürü plakasında 1,5 mL RPMI + %10 FCS'de 2 x 106 lökosit ve 4 x 106 FITC etiketli konidia (enfeksiyonun çokluğu = 2) inkübat. Denetimler olarak, yalnızca hücreleri (konidia yok) ve hücreleri + etiketlenmemiş conidia içerir.
- 37 °C'de nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesine yerleştirin ve istenilen süre boyunca kuluçkaya yatırın (örn. 0,5 saat, 2 saat veya 4 saat).
- Kuluçkadan sonra, bir hücre kazıyıcı ile hasat hücreleri ve 15 mL tüp koymak.
- Oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dk çevirin.
- Sitokin analizi için supernatant toplayın veya değilse atın. Her numuneyi 100 μL PBS + 2 mM EDTA'da yeniden askıya alın.
4. Antikor Boyama
- Her numune için Tablo 1'egöre APC anti-FITC antikor dahil olmak üzere 100 μL antikor karışımı hazırlayın.
- 96 kuyulu V-alt plakanın bir kuyunun içine 100 μL numune koyun. Yıkama için 150 μL PBS + 2 mM EDTA ekleyin.
- Renk telafisi için, 96 kuyulu V alt plakanın daha fazla kuyularına her renk için 1 x 106 hücre yerleştirin. Lekesiz bırakılan hücrelerin bir kuyu ekleyin. Yıkama için 150 μL PBS + 2 mM EDTA ekleyin.
- Bir yapışkan folyo ile kapak plaka.
- Oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dk çevirin. Folyoyu çıkarın.
- Hızlı ve zorla lavabo veya tek kullanımlık kağıt havlu üzerinde sadece bir kez plaka ters tarafından supernatant atın.
NOT: Kuruyana kadar plakayı tekraretmeyin veya bir kağıda düşürmeyin, bu da plakadan büyük miktarda hücre kaybına neden olacaktır. - 100 μL antikor karışımındaki hücreleri yeniden askıya alın ve pipetleme ile iyice karıştırın.
- Renk telafisi için, 100 μL PBS + 2 mM EDTA'daki ilgili hücreleri yeniden askıya alın ve antikor karışımında kullanılan aynı miktarda her kuyuya tek bir antikor ekleyin.
- Bir yapışkan folyo ile kaplayın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka.
- Folyoyu çıkarın. Yıkama için her kuyuya 150 μL PBS + 2 mM EDTA ekleyin. Yapıştırıcı folyo ile kaplayın.
- Oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dk çevirin. Folyoyu çıkarın. Hızlı ve zorla lavabo veya tek kullanımlık kağıt havlu üzerinde plaka ters tarafından supernatant atın.
- 200 μL PBS + 2 mM EDTA'da yeniden askıya alın ve hücreleri her kuyudan ayrı bir yuvarlak alt tüpe aktarın. Süspansiyonda hücre kümesi olmadığından emin olun. Aksi takdirde kümeleri kaldırın.
NOT: Gözün görebileceği kadar büyük olan her küme, sitometreyi tıkayabilecek kadar büyüktür.
5. Akış Sitometrisi
- Akış sitometresini çalıştırın ve ısınmasına izin verin. Satın alma yazılımını başlatın.
- Yeni bir deneme oluşturun ve örnekleri düzenesin ve etiketleyin.
- Kurulum parametreleri (FSC 250, SSC 250) ve floroforlar için dedektörler FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-Cy5.5.
- Tazminat kurulumu
- Tazminat kurulumlarını açın.
- Tek tek renkleri belirtin.
- Lekesiz veya tek tek boyamalarla bırakılan kontrol hücrelerini kullanarak, PMT dedektör voltajlarını ölçek içindeki tüm olayları içerecek şekilde ayarlayın.
- Her denetimden en az 10.000 olay kaydedin.
- Floroforların dökülmesini hesaplamak ve deneyin sitometre ayarlarına uygulamak için tazminat kurulumünü kullanın.
- Örnek verileri kaydetme
- Satın alma yazılımında FSC ve SSC'yi görüntüleyin ve lökositlerin etrafına kapı açın.
- Lökosit kapısına dayanarak, nokta çizimi SSC/CD45'i ve CD45+ hücrelerinin konidiadan ayrılması için kapı görüntüleyin.
- CD45+ hücrelerini nokta çizimi CD14/CD66b ve kapı monositlerinde (CD14+) ve nötrofillerde (CD66b+) ayrı ayrı görüntüleyin.
- Nötrofilleri bir nokta çizimi anti-FITC/FITC'de görüntüleyin.
- Numuneyi etiketsiz konidia ile kullanarak, anti-FITC ve FITC sinyalleri için quadrants ayarlayın, ilgili quadrants hücrelerin in maksimum% 1 izin.
- Monosit kapı için 5.5.4 ve 5.5 adımlarını tekrarlayın.
- Lökosit kapısında en az 20.000 etkinlik lezne ile tüm örnekleri kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A. fumigatus conidia'nın fagosittozunun insan fagositik hücreleri tarafından ölçülmesinde, gerçek içselleştirme ile konidianın hücrelere sadece bağlanması arasındaki ayrımcılık, özellikle akış sitometrisi gibi yüksek iş verme yöntemleri söz konusu olduğunda bir engeldir. Bu engeli aşmak için, hücre ve konidianın birlikte kuluçkaya yatması öncesinde floresan boya FITC ile konidianın boyanmasını temel alan hızlı ve güvenilir bir protokol sunmaktayız ve ardından kuluçka sonrası APC etiketli anti-FITC antikorile karşı boyama yapıyoruz (Şekil 1A). Şekil 1B'degösterildiği gibi, FITC etiketli konidiya, hücrelere yeşil sinyal sağlayan insan monositleri ve nötrofiller tarafından fagositozlanır. Bu konidia anti-FITC antikor için erişilemez ve bu nedenle, antikor bağlayamaz ve hücreler APC negatif görünür (FITC+, APC-). Etkileşime girmeyen hücreler FITC etiketli konidiadan yeşil sinyal almaz ve FITC-, APC-olarak kalır. Birkaç hücre FITC-, APC+ görünür. Anti-FITC APC antikor FITC etiketli konidia olmadan hücreleri bağlamak mümkün olmamalıdır, bu olaylar eserler boyama olarak kabul edilir. Hücrelere bağlı ancak içselleştirilmeyen FITC etiketli konidia, hücreleri FITC için de pozitif hale getirir ken, aynı zamanda bu hücreleri FITC ve APC (FITC+, APC+) için çift pozitif yapan anti-FITC antikoriçin bir hedef sağlar. Mikroskobik olarak analiz edildiğinde, bu popülasyon sadece deneylerimizde konidia bağlı hücrelerin %20'sini içeriyordu.
Bu protokolde tanımlanan antikorların kullanılması ve Şekil 1D'dekigating stratejisini takip ederek, insan lökositlerinin FSC ve SSC karakteristikleri ile genel bir gating'i, lökositve serbest konidianın pan-lökosit belirteci CD45 ile ayrılması takip edilmektedir. Özellikle şişmiş konidia ve/veya uzun kuluçka süreleri kullanırken, konidia akış sitometrisi ve dolayısıyla önyargı analizi sırasında neredeyse hücre büyüklüğüne ulaşabilir. İnsan birincil monositler ve nötrofiller konidia farklı almak yana, bu protokol ayrı ayrı monositler için cd14 ve nötrofiller için CD66b için iyi kurulmuş hücre soy belirteçleri CD14 ile boyama dayalı bu hücre popülasyonu analiz sağlar. Fagositoz ve yapışkan hücre popülasyonları için gating ne FITC ne de anti-FITC APC sinyali taşıyan etiketsiz konidia ile kontrol örnekleri dayalı yapılır. APC ve FITC birbirlerine karşı çizildiğinde, kadranlar en fazla %1'lik hücrelerin ilgi kapılarında izin verilebilen şekilde ayarlanır.
Konidiyaiçselleşen insan primer fagosityüzdesi kan bağışçıları arasında oldukça değişken olabilir, ancak aynı zamanda kuluçka süresi ve konidianın şişme durumu gibi deneysel faktörlere de bağlıdır. Spor içselleştirme sikenasyonu 0.5 saat ko-kuluçkadan sonra saptanabilir ve zamanla artar (Şekil 2A). Önceden şişmiş konidia kısa kuluçka zamanlarında bile dinlenme (şişmemiş) sporlardan daha kolay alınır(Şekil 2B). Konidia formaldehit ile sabit ise, fagositoz doğal konidia göre azalır(Şekil 2C).
| Reaktif | örnek başına μl |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0.5 |
| CD66b PerCP-Cy5.5 | 1.5 |
| anti-FITC APC | 0.5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| Toplam | 100 |
Tablo 1: Akış sitometrisi için antikor karışımı. Her reaktifin miktarları analiz edilecek numune başına mikrolitre (1 x 106 hücre) olarak verilir.
Şekil 1: Akış sitometrik fagositöz analizinin kurulumu ve analizi. (A) Konidia ve hücre hazırlama ve karşı boyama dahil protokol şeması. (B) Fagositoz, FITC etiketli konidianın akış sitometrik verilerinin anti-FITC APC karşı boyamasına karşı çizilerek analiz edilir. Ortaya çıkan popülasyonlar, etkileşime giremeyen lökosit (FITC-, APC-), yapışık konidia (FITC+, APC+) ve fagositising lökosit (FITC+, APC-) ile boyama objeleri (FITC-, APC+) ile lökosit lerin yüzdelerini gösterir. (C) 3 farklı donörle yapılan 3 farklı deneyden (ikisi mükerrer olarak, biri tek kez yapılan) çift pozitif hücre popülasyonları mikroskopik olarak içselleştirilmiş ve sadece konidia ile sayılmıştır. (D) Lökositleri (CD45), monositleri (CD14) ve nötrofilleri (CD66b) belirlemek ve etkileşen popülasyonları (FITC, anti-FITC) belirlemek için akış sitometrik verilerinin temsili gating stratejisi. Bu rakam Hartung vd., Sitometri A, 95: 3, s. 332-338 (2019)14. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Konidiyonun insan primer fagositleri tarafından fagositazisi çeşitli koşullara bağlıdır. (A) Konidiyonu içselleştiren hücrelerin yüzdesi birlikte kuluçka süresi ile artmıştır. (B) Fagositoz, 0.5 h.(C)Yerli konidia nın sabit konidiadan daha iyi fagositoza sahip olması yla konidial şişlik süresi ile artmıştır. Veriler 10(A,B)veya 5 farklı donörden(C)10(A,B)veya 5(C)bağımsız deneyden elde edildi. Hata çubukları SD'yi gösterir. Bu rakam Hartung vd., Sitometri A, 95: 3, s. 332-338 (2019)14. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fagositosit analizi, insan primer fagositlerinin işlevselliğini değerlendirmek ve klinik olarak ilgili kalıpları karakterize etmek için bir araçtır. (A) Sağlıklı bir donör ve immünsupresif bir hastadan monositlerin örnek karşılaştırması (hematopoetik kök hücre naklinden sonra) 0.5 h, 2 h ve 4 h. (B) Dinlenmiş mantar konidianın fagositositisi klinik olarak ilgili Aspergillus ve Mucorales türleri için 2 saat eş kuluçka sonrası belirlendi. Her biri 5 veya 3 bağımsız deneyde 5(Aspergillus)veya 3(Mucorales)farklı donörden veriler elde edilebildi. Hata çubukları SD. Kısaltmaları gösterir: A. Aspergillus, L. Lichtheimia, M. Mucor, R. Rhizopus Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, a. fumigatus conidia'nın çok sayıda birincil insan lökositi ile etkileşimini ölçmek için hızlı bir akış sitometrik yöntemi ni sunar ve bu yöntem ortak mikroskobik protokollerde mümkün değildir. Bir mikroskop ile görüntüleme hücreleri ve elle içselleştirilmiş konidia sayma hantal ve gerçekçi sadece birkaç yüz hücreleri için yapılabilir. Akış sitometrisi bu sorunun üstesinden birkaç dakika içinde binlerce hücreyi ölçerek giderilir. Her iki yaklaşımda da yaygın olan bir engel, sırasıyla hücrelerde veya hücrelerde fagositosi ve yapışık konidia ayrımıdır. Mikroskopide, boya calcofluor beyaz genellikle yapışık conidia boyama için kullanılır ama kullanımı bir kitin içeren hücre duvarı ile mikroorganizmalar ile sınırlıdır.
Buna karşılık bu protokol, cd45, CD14 ve CD66b gibi daha fazla hücre belirteçlerinin eklenmesine olanak tanıyan etkileşim olaylarının karakterizasyonu için farklı floroforlar kullanmaktadır. Böylece patojenlerin fagositözlerini monositler ve nötrofiller tek bir örneklemde ayırmak da mümkündür. Hücre tanımlaması için belirteç ve florofor seçimi deneyin ihtiyaçlarına ve mevcut sitometrenin kapasitelerine uyarlanabilirken, bu protokolde belirtilen spesifik APC anti-FITC antikorlarının kullanımı elimizde en güvenilir antikor.
Formaldehit-sabit konidia eşit derecede iyi içselleştirilemediğinden, fagositöz tahlilleri için yerli sporlar önerilmiştir. Ancak, yerli konidia başlayacak veya insan lökositler ile co-kuluçka sırasında şişme devam edecek ve sonunda çimlenme. Tipik olarak, A. fumigatus conidia 37 °C'de glikoz içeren ortamda yaklaşık 8-9 saat sonra çimlenir. Çimlenme konidia yüzeyinde FITC kaybına neden olduğu için, şişme süresi ve fagositlerle ko-kuluçka süresinin kombinasyonu bu süreyi aşmamalıdır. Daha da önemlisi, germlingler artık monositler veya nötrofiller tarafından fagositosi olamaz. Bunun yerine, bu fagositler etrafında birikir ve kaldırılmazsa, sitometreyi tıkayan hücre kümeleri üreten mikroplara yapışır. Benzer şekilde, 4 h şişmiş conidia kendi aralarında ve hücreleri ile kümeleri oluşturmak eğilimindedir. Genellikle bu kümeler artık mekanik olarak ayrılamaz ve içindeki hücreler akış sitometrik analizi için kaybolur.
Gating başlangıçta basit ve kolay olmasına rağmen, daha conidia hücreler tarafından içselleştirilmiş, bulanık gating olabilir. MOI > 2 kullanmak ilk zaman noktalarında fagositozu artırır, ancak daha erken de gating sorunları ortaya çıkabilir. Bu nedenle, MOI dikkatle belirli hücreler ve ilgi patojenler ile belirlenmelidir.
Bu protokolün bir sınırlama da yapışık yanı sıra içselleştirilmiş conidia ile hücreleri barındıran olabilir yapışık konidia (FITC + APC+) ile hücre popülasyonunun ikilik olduğunu. Daha fazla ayrımcılık olasılığı, akış sitometresinde ölçülen tüm hücrelerin görsel görüntülemesini sağlayan görüntüleme akış sitometrisi15 uygulamasıdır.
Conidial hücre duvarının spesifik FITC etiketleme nedeniyle, Bu yöntem kolayca cins Mucorales veya maya Candida albicansklinik olarak ilgili kalıpları gibi ilgi diğer mantarlar aktarılabilir. Ayrıca, hücre duvarı taşıyan bakteriler FITC etiketli olabilir. Anti-FITC antikor ile evrensel karşı boyama insan lökositler çok sayıda hem tüm bu patojenlerin fagositoz hızlı ve kolay ölçüm sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bayan Pia Stier'e mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz. M. von Lilienfeld-Toal, Sepsis Kontrol ve Bakım Merkezi (Almanya Federal Eğitim ve Sağlık Bakanlığı, BMBF, FKZ 01E01002) ve InfectoGnostik Araştırma Kampüsü (BMBF, FKZ 13GW0096D) tarafından desteklenir. Thi Ngoc Mai Hoang Jena Mikrobiyal İletişim Okulu (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2) tarafından desteklenir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
