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Biology

通过总内部反射荧光显微镜与数量和亮度分析相结合，活细胞中细胞表面受体的显微化动力学

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60398
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1,2
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

我们描述了一种成像方法，用于测定由活细胞血浆膜中的配体结合诱导的mEGFP标记受体寡聚体的平均寡聚状态。该协议基于总内部反射荧光 （TIRF） 显微镜与数字和亮度 （N&B） 分析相结合。

Abstract

尽管受体寡聚的重要性和普及性，但很少方法适用于检测聚类事件和测量聚类的程度。在这里，我们描述了一种成像方法，以确定活细胞膜中mEGFP标记受体同质复合物的平均寡聚状态。该协议基于总内部反射荧光 （TIRF） 显微镜与数字和亮度 （N&B） 分析相结合。N&B 是一种类似于荧光相关光谱 （FCS） 和光子计数直方图 （PCH） 的方法，该方法基于对荧光团荧光强度波动的统计分析，该分析在照明中扩散出来在观察时间内的体积。特别是，N&B是PCH的简化，以获得关于寡聚混合物中蛋白质平均数量的信息。强度波动幅度由荧光的分子亮度和照明体积内的平均荧光量来描述。因此，N&B只考虑振幅分布的第一个和第二个时刻，即平均强度和方差。这同时也是方法的强弱。由于只考虑了两个时刻，N&B无法确定混合物中未知寡聚物的摩尔部分，但它仅估计混合物的平均寡聚状态。然而，只需监测荧光强度的时间波动，即可应用于相对较小的时间序列（与其他瞬时方法相比），以逐像素为基础。它将每像素的有效时间缩短到几微秒，允许在秒到毫秒的时间内采集，这是快速寡头化动力学所必需的。最后，可以探索大细胞区域以及亚细胞隔间。

Introduction

我们描述了一种总内部反射荧光数和亮度（TIRF-N&B）成像方法，用于确定活细胞血浆膜上受体分子的平均寡聚状态，旨在连接受体组件蛋白质的生物功能动力学（图1）。

在细胞外配体结合时，受体根据其构象、寡聚物、潜在的共受体和膜组成启动细胞内信号转导。尽管受体寡聚的重要性和普及性，在细胞信号1，2，3，4，5，6中被确认为关键事件，7、少数方法可以检测聚类事件，并实验性地测量聚类的程度8，9。共聚焦体积（x，y = 300 nm，z = 900 nm）不足以证明分子相互作用和化学测量，即使在通过图像恢复算法10进行优化后也是如此。蛋白质寡聚物的亚单位组成不能在纯粹的空间基础上解决，即使超分辨率的方法在x，y分辨率为20-70nm，如PALM11，STORM12和STED13。此外，它们的时间分辨率（按每个图像的分钟数顺序）不能跟随秒范围内的动力学。单分子步进漂白只有在蛋白质寡聚物不可移动时才能解决其化学计量。

测量单个图像中荧光标记蛋白的密度和寡头化的最通用方法之一是空间强度分布分析 （SpIDA），它依赖于空间采样。它适用于化学固定和活细胞，并允许使用标准荧光显微镜15同时分析细胞的几个感兴趣的区域。或者，电矩方法，如荧光相关光谱（FCS）16、光子计数直方图（PCH）17和数和亮度（N&B）18、19，适用于定量寡聚子测量。这些方法分析荧光强度波动，当荧光光道在照明体积中扩散时，可以及时观察到。强度波动的振幅可以通过荧光荧光（+）的分子亮度和照明体积17（图2）内的平均荧光量（n）来描述。通常，荧光的扩散系数和照明体积内的分子平均数量（与G（0）值成反比，可以通过FCS20获得。然而，由于扩散时间只与质量的立方根量一起缩放，FCS对检测分子质量21的变化不够敏感。在实践中，单色FCS不能检测膜受体的二分化。PCH 可准确分解不同寡聚物的混合物。使用两个以上振幅分布的瞬间，它检测占据相同照明体积的不同亮度的分子。扫描FCS22和开发，如有趣的分子亮度（pCOMB）方法23的对相关性，介绍了扩大荧光相关方法在生物系统中的适用范围24，仍然是单点方法，缺乏在单元大面积进行快速测量的能力，需要在每个像素上连续进行多次观测，数据采集需要秒数。

N&B 是 PCH 的简化版本，它仅考虑荧光分布振幅的第一个和第二个矩，即平均强度、和方差，#2 （图 2）18，19因此，它不能确定混合物中未知寡聚物的摩尔分数，而只能估计混合物的平均寡聚状态。然而，N&B 的优势是，只需通过监测荧光强度的时间波动，即可逐像素处理比 PCH 更小的活细胞图像时间序列。由于 N&B 可将每像素的时间缩短到几微秒，因此它可以在大型单元区域上遵循快速的寡聚动力学，从而允许在栅格扫描显微镜（例如，共聚焦、2 光子）和毫秒内以秒的时间量采集图像基于相机的显微镜（例如，TIRFM）。

几份报告已经证明了N&B通过成像扩展细胞区域来量化蛋白质簇中亚单位数量的能力。在CHO-K1细胞25的粘附位处检测到帕西林-EGFP簇，COS-7细胞26中描述了致病性Httex1p肽的细胞内聚集。N&B应用于对ErbB受体27的配体驱动寡聚，以及配体FGF21对克洛托布（KLB）和FGFR1c在HeLa细胞28中的影响。TIRF成像和N&B分析相结合，表明dynamin-2主要是整个细胞膜29的四分之二。我们应用N&B在栅格扫描和TIRF图像，以证明配体驱动的uPAR和FGFR1细胞膜受体的二分化30，31。

荧光相关方法，如N&B、FCS和PCH，基于这样一种概念，即在开卷中，粒子的占用数量遵循泊森分布。因为只有荧光光素可以检测到，因此测量的荧光强度与图像像素中的时间平均值是照明体积 n 和其中平均荧光量数的成因。分子亮度，Φ17：

其中 α 表示为当分子处于照明体积中心时，每个分子每单位时间发射的光子数（通常为每秒）。

亮度是给定采集中每个荧光光的特性，而强度是所有荧光光道贡献的总和。在生物竞赛中，亮度会随着一起波动的荧光量的增多而增加，从而提供有关荧光标记蛋白的寡聚状态的信息。给定像素的波动幅度由荧光信号的方差测量，±2：

其中强度平方的平均值和强度平均值的平方是从每个帧的每个像素中的单个强度值计算的：

其中K是时间序列中的总帧数。在实验中，有必要计算整个图像序列的方差，该方差描述单个图像每个像素围绕平均强度值的散射。方差包括不同来源的所有波动。在第一个近似值中，由于探测器拍摄噪声的偏差，照明体积中的扩散粒子[20]的方差可以从方差中分离出来，因为探测器的拍摄噪声为 ± 2d。这两个方差是独立的;因此，总方差由其总和给出：

由于检测体积的分子波动，方差与分子亮度和强度呈线性关系：

根据 eq. 1 重新排列 eq. 6：

根据荧光相关光谱中的典型概念，方程7指出，波动次数引起的方差取决于粒子亮度的平方。

然后，探测器波动引起的方差是检测强度的线性函数，假设探测器的运行量低于其饱和度限制19：

对于光子计数检测器，则±1和c=0，因此检测器方差等于平均强度：

为了将这些概念应用于活细胞中的实际测量，Gratton 及其同事18将每个像素的表观亮度 B 定义为方差与平均强度的比率：

B 是实验测量的参数。在这项工作中，由TIRF显微镜捕获HeLa细胞血浆膜上的FGFR1受体的时间序列图像，通过N&B分析确定平均表观亮度B。然后，在添加FGF2后，连续时间序列被捕获，以跟随在用规范配体刺激受体后膜表面受体分子的自组装的变化。

但是，由于 TIRF 显微镜的探测器是 EMCCD 摄像机，因此表面亮度的表达式需要修改为19：

其中偏移是检测器设置特征的检测电子的强度偏移。模拟探测器的方差和平均强度分别由：

其中 G 是数字电平 （DL/光子） 中的模拟增益，S，每光子19的数字电平，由强度斜率与具有恒定强度（无时态波动）的光源的方差图给出。α 系数与像素检测体积的形状有关。根据Hassler等人32，在检测摄像机19的最大增益下工作的TIRF成像的β系数等于0.3。偏移、S 和 G 参数是相机和显微镜的特性。视界亮度 B 是通过根据 eq. 12 和 13 重新排列 eq. 11 获得：

实验上，α是激光强度和系统检测效率的复杂函数。然而，由于 B/S 线性依赖于 α，因此确定给定检测模式的 α 的相对值非常重要：

其中['与 ______________________不过，校准是使用内部参考执行的。

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Protocol

1. 样品制备

  1. 第1天。种子HeLa细胞在玻璃底培养皿中，浓度为100，000-200，000细胞/mL。种子6-8复制菜肴。
    注：在此示例中，该介质辅以 10% 热灭活胎儿牛血清 （FBS）、1 mM 丙酸钠、100 U/100 μg 青霉素/链霉素。准备了几道复制菜肴。
  2. 第2-3天当细胞处于亚汇合时，在无血清培养基中转染一半与蛋白质粒的菜肴，用参考质粒（单体和二分体）转染一半。
    注：转染是在无血清介质中，辅以抗生素，0.1%牛血清白蛋白和25 mM HEPES缓冲液，不含苯红。
  3. 第3-4天检查转染的细胞是否粘附在盘子的底部，并且细胞膜是荧光的。丢弃细胞过度生长或荧光极低的盘子。
    注：不要让细胞过度生长。细胞必须分布良好，并粘附在盘子的玻璃区域（图1A）。预涂玻璃底盘可用于优优细胞粘附。在任何实验之前，细胞培养体都经过支原体污染测试。在此示例中，细胞使用 （A207K） mEGFP-FGFR1 质粒转染，参考细胞使用 GPI-（A207K） mEGFP 和 GPI-（A207K） mEGFP-（A207K） mEGFP 质粒转染。对于活细胞显微镜，建议使用无指标介质;加入25 mM HEPES缓冲液，以防止成像过程中的pH变化。

2. TIRF 成像 – 激光线的对齐和 TIRF 照明的优化

  1. 实验前四小时，在37°C下激活显微镜的温度培养箱。
  2. 打开显微镜、电脑和摄像机，等待摄像机达到适当的工作温度。
    注：本研究中使用的相机的工作温度为-75 °C。
  3. 在目标上放一点油。将样品盘放在原位。关闭培养箱的门，让菜的温度平衡（约10分钟）。
  4. 打开荧光灯和 488 nm 激光。
  5. 选择荧光对比度模式以探索样本，从眼部搜索要聚焦的细胞。
    注：使用荧光灯来搜索视光细胞不是强制性的。可以改为使用合适的激光线。
  6. 选择适当的过滤器，通过显微镜摄像机收集绿色发射（带通 Ex 490/20 （500） 带通 Em 525/50 或类似。
  7. 在荧光模式下从眼部切换到摄像机端口（图 1中的摄像机#1），优化对焦并更改为 TIRF 模式。Epi荧光和TIRF模式可能使用不同的命名法来命名，具体取决于显微镜的品牌。
    注：如果盖玻片界面上没有荧光标记，则可能存在聚焦或对齐激光的问题。要正确对齐激光（对于良好的 TIRF 至关重要），将焦点放在盖玻片上。通常很难确定封面是否聚焦。作为建议，关注单元格的边缘。
  8. 按照 TIRF 显微镜的说明激活自动校准。
    注：简单地说，对于从 2.4 到 2.8 的步数，首先通过眼部找到细胞并聚焦在它们上，然后将发射发送到 TIRF 显微镜的相机端口，重新聚焦显微镜计算机屏幕上的细胞并激活激光对准过程。对齐包括查找照明消失的临界角度（图 3）。商业显微镜可能具有略有不同的对齐协议，并且也是完全自动化的;其他人可能有一个小型摄像头，以促进关键角度条件的可视化。
  9. 选择合适的照明深度并优化消光场的方向（图3）。
    注：所有控件和样品的穿透深度保持不变。

3. TIRF 成像：捕捉时间序列

  1. 定义至少 256 x 256 像素的感兴趣区域 （ROI）。
    注：在此设置中，捕获使用仅直接控制摄像机的软件下的摄像机#2完成（参见图 1图例）。
  2. 将曝光设置为 1 ms，将 EM 增益设置为 1，000（这是 eq. 12 和 13 中的 G 因子）。在这样的速度下，可能需要调整或增加激光功率。这里的激光功率为0.5 mW。
    注：根据相机的类型以及蛋白质扩散系数、荧光强度和背景的限制，设置激光功率的一般标准是，不使探测器饱和，尽量减少光漂白，并捕获为尽可能快地在合理的S/N。EM 增益始终设置为摄像机的最大值（请参阅简介）。
  3. 在初始条件下运行第一个试验序列，并粗略估计 S/N 值。条件在 S/N = 2-3 或更高时是可以接受的，如第一个时间序列的第一帧中所测量的。
  4. 使用将摄像机#2连接到显微镜的发射分解系统的滑块遮蔽图像的一侧（图 1B，图 4A-B）
    注：在此设置中，摄像机#2上安装了多通道成像连接器，以便同时采集两个空间相同的图像。该系统配有用于安装不同排放过滤器的滑轨。其中一个滑块安装黑色蒙版以覆盖图像的一侧。屏蔽区域用于每个时间序列的内部校准，以确定摄像机参数（eq. 12 和 eq. 13）。这样，就不需要独立的校准步骤，重要的是，校准与捕获每个时间序列同时进行。在没有这个系统的情况下，摄像机可以校准应用公布的协议33。
  5. 选择相机文件自动保存选项。
  6. 开始获取图像系列。以最低 S/N 比率 2 获取至少 700 帧。
    注：分析所需的帧数取决于光漂白的样品稳定性和数据的分散性。因此，在 N&B 分析期间评估每个时间序列的质量。
  7. 不要将盘子从显微镜中拿出来，加入配体。
  8. 选择具有明亮荧光膜的细胞，并快速启动动力学运行的第一次序列。
    注：如果配体添加快速完成，则第一次捕获将设置配体动力学的点 = 0 时间。软件注册捕获的确切时间。
  9. 搜索第二个单元格并获取动力学的第二个时间点。
    注：点访问例程可在一些配备 x，y，z 电动级的显微镜中可用。这些允许记忆细胞盘上的多个位置，并有助于保持不同细胞上图像序列之间更恒定的时间间隔。
  10. 捕获动力学运行的每个时间点的新单元格。
    注：捕获后，单元格被部分光漂白，无法重新成像。因此，动力学是通过组合许多单元格的时间序列而获得的，每个单元在不同的时间点捕获。
  11. 对于每个新菜，重复步骤 2.3 到 3.9 中的协议。
    注：作为参考菜，添加一体积的车辆（PBS补充0.01%牛血清白蛋白）相当于用于配体。

4. 数字和亮度（N&B）：时间序列的质量检查

  1. 转换并保存为 。TIFF 使用相机软件获取的文件（本例中为.sif 文件）。
  2. 进口。通过激活 N&B 图形用户界面 （GUI） MATLAB，在分析软件例程中使用 TIFF 文件。
    注：此处使用自定义的 Matlab 可执行 N&B 例程（https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia 处的 N&B 分析）。通过打开导入 的 。TIFF 文件，例程生成平均强度图像，平均强度配置文件，它允许逐帧检查系列 （补充图 1）。其他软件可用于 N&B 分析（例如，SimFCS 软件）。
  3. 平均强度曲线显示超过 10% 光漂白的丢弃系列，以及采集过程中有明显细胞膜变形或平移的序列。
  4. 裁剪明显不聚焦的帧。
    注：裁剪工具在例程中实现，以丢弃图像系列中的单帧或多帧。允许此操作，因为帧到帧时间并不重要，而像素的入住时间（曝光时间）是（请参阅讨论）。
  5. 仅保留至少 500 个时间范围的分析序列。

5. 数字和亮度（N&B）：摄像机参数的确定（偏移、+ 和 S）

  1. 激活常规校准摄像机。
  2. 在探测器噪声区域中选择至少 20 x 50 像素的区域 （图 4）。
    注：例程源自值的直方图（也定义了数字级别，DL），并返回频率与数字电平的对数图。
  3. 在日志频率与数字电平图中，移动线性红色光标以分隔高斯和曲线的线性部分。
    注：红色光标分割曲线的两个部分，并激活返回偏移的例程，偏移量是摄像机响应的高斯函数的中心，高斯拟合的 μ，以及 S 因子（摄像机的线性部分的斜率）e （图 4C-D） .

6. 数字和亮度（N&B）：计算选定感兴趣区域（ROI）中的 B 值

  1. 激活B键。
    注：此操作生成平均强度图像（图5，第一列）和 B 图像，其中每个单独的 B 值与图像中的相关像素相关联（补充图 1）。
  2. 应用最小分箱（2 2）以减少数据的分散，并生成B-I直方图（图5，第二列）。
    注：B-I 直方图表示图像所有像素的 B 值与像素强度的分布。Y = B/S;X = （ - 偏移）/S （补充图 1和 eq. 11 和 15）。
  3. 使用交互式方形光标检查 B-I 直方图。
  4. 为分析选择一个平方 ROI（图 5，第三列）。
    注：光标在平均强度图像上同步移动蒙版，突出显示在方形光标区域中选择的像素（补充图 1）。通过这次检查，可以从分析中排除强度极低的背景和区域。
  5. 生成所选 ROI 的 B 形图（图 5，第四列）。
  6. 保存与所选内容关联的 B 值的 ASCII 文件。
  7. 在图形软件中导入 ASCII 文件以计算数据的频率分布，并获取平均 B 值 = S.E（图 5，第五列）。
    注：如果数据是同质的，则 B 值的频率分布近似于高斯分布。
  8. 应用 eq. 15 得出每个单元在动力学运行的每个时间点的平均亮度 = - 1 [（计数/分子） 每个时间]。根据以下情况对数据进行规范化：

    其中是配体添加后在时间"t"处测量的平均 B 值，是时间 t=0（配体添加后 10-20 s）测量的平均 B 值。
    注：结果的规范化允许直接比较在不同日期进行的实验。它可补偿由于激光功率和技术波动而导致的测量亮度差异。
  9. 绘制标准化平均亮度与采集时间以建立动力学运行（图 6）。

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Representative Results

图5和补充表1显示了同一培养皿中两个代表性的HeLa-mEGFP-FGFR1细胞的结果。在添加FGF2配体后，在0分钟（图5A，上图）和7分钟（图5A，底部）捕获两个细胞。

图5还显示了两个代表性的HeLa细胞的结果，它们要么表示纯单体，GPI-mEGFP（图5B，上图），要么共价链接的二分位荧光，GPI-mEGFP-mEGFP（图5B，底部），暴露在细胞膜上，在相同的实验条件下被捕获。

HeLa-mEGFP-FGFR1 细胞中的平均表观亮度 B 从 1.070 ± 0.001 S.E. 增加到 1.141 ± 0.001 S.E.，而参考单体（图 5B，顶部）和二分体（图5B，底部）样本返回 B值分别为 1.070 ± 0.001 S.E. 和 1.141 = 0.001 S.E。因此，相比之下，FGFR1受体在开始时主要以细胞膜表面的单体形式存在，但在使用其规范配体FGF2刺激时，它正朝着主要的二分状态发展。平均而言，两个代表性细胞中FGFR1分子的流行状态明显不同。

通过将分析应用于同一盘中的多个单元，每个单元格捕获在不同的时间点，获得平均亮度作为时间函数（图 6A）。图 6 A中的动力学运行描述了在单元表面持续几分钟的缓慢二聚过程。FGF2诱导的FGFR1二聚体化和随后受体的内化是一个众所周知的机制34;因此，结果与目前关于FGFR1信号转导的概念完全一致，并证实了TIRF-N&B方法在研究细胞膜蛋白的寡聚性，以及确定细微单体-二聚体动力学。

结果的标准化平均亮度分析是比较不同配体对同一受体的影响的合适工具。图6B给出了一个例子。该协议使用相同的标准重复，并用非规范的FGFR1配体、NCAM-Fc（50μg/mL）刺激细胞。在这种情况下，动力学轮廓显示低聚混合物中受体的快速和循环过渡，也达到高于二聚体亮度值。重复观察归一化平均值 3。然而，N&B分析的局限性（只考虑了强度波动与时间的两个时刻）不能毫无疑问地证明三元形的形成。相同的标准化平均亮度可能是受体中较大寡聚物和单体组合的结果。然而，结果清楚地显示了两个配体对同一受体作用的时空差异。

Figure 1
图1：实验协议概述。（A） 细胞在玻璃底盘上镀，并转染荧光标记的受体.（B） 时序图像在配备TIRF 100x 1.46油镜和培养室的商业TIRF显微镜上拍摄。在此商业设置中，软件不允许内置 EMCCD 摄像机#1在获取 N&B 时序所需的极短曝光时间下工作。这是一个重要点，因为暴露时间限制了可以捕获的分子扩散的范围。暴露时间越短，可分析的分子扩散速度越快。从 0.5 到 1 ms 的暴露对于膜蛋白扩散来说足够快。因此，第二个 EMCCD 摄像机 （#2） 被添加到显微镜的附加端口中，以绕过显微镜软件直接在相机软件下工作。在此调整配置中，显微镜软件和摄像机#1仅用于 TIRF 校准。然后，使用摄像机#2在极短的曝光时间（如 1 ms）和最大 EM 增益下运行，从而获取 TIRF 时间序列。相机#2的像素大小为 124 nm，允许对图像进行过采样和分箱（参见协议第 6.2 节）。根据不同TIRF显微镜的特性，可以采用其他配置来获得成像速度，而使用sCMOS相机是不可取的，因为图像35中的噪音不是随机的。（C） 捕获后，时间序列作为质量检查进行检验。如果光漂白高于 10%，则丢弃系列，因为可以通过绘制平均帧强度与帧数来确定。如果在采集过程中细胞膜明显变形或细胞的平移，系列也会被丢弃。（D） 保存每个像素的平均强度。（E） 生成一个 B-I 直方图，表示图像的每个像素中的表观亮度 B。（F） B-I 直方图用于选择高于背景的 ROI。（G） 分析 B 值的频率分布，以确定平均 B 值 = S.E.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：N&B原理。N&B 通过测量荧光团在采集时间堆栈系列"K"图像期间进出照明体积时发生的荧光波动来量化荧光光量的平均寡聚状态。波动的振幅通过计算波动信号的方差（±2 ）和平均强度值之间的比率来统计地描述。在最简单的场景中 （A）中，当照明体积为空（即无荧光光波）时，该比率描述仪器噪声。如果荧光信号因流动荧光素（B，C）而波动，"额外"方差与扩散分子的分子亮度±（检测到的光子计数每分子和每秒）成正比。在（B），有 8 个单体扩散荧光道和 （C）， 相同的荧光草扩散为 2 四聚物寡聚物.在这两种情况下，平均强度相同，但标准偏差和亮度不同（1+，4Ω），因为波动的振幅不同。当荧光管不可移动或不存在时， ± = 0。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：TIRF显微镜。尽管 N&B 与配备多光子、连续波或脉冲单光子激光器以及模拟或光子计数探测器的光栅扫描显微镜运行同样良好，但 TIRF 显微镜是分子动态快速时间成像的理想选择在细胞表面或附近发生的事件，速度、分辨率和信号/噪声比（S/N）是其他成像技术无法实现的。（A） TIRF 显微镜采用完全内部反射原理，角度激发激光仅激发位于盖玻片玻璃水界面下方的荧光。激光照射试样的角度大于或等于折射的临界角度，而激发激光则完全反射。反射在试样中产生一个非常薄的电磁场，称为消逝波。样品的微小发光部分发出的荧光灯通过垂直放置在幻灯片下方的显微镜物镜收集。（B） 面板在给定波长上显示了一个给定波长的递延场与深度的相对强度，随着与表面距离的增加，该高度呈指数级减小，提供高轴向分辨率荧光图像。横向分辨率由目标的数值光圈和放大倍率以及检测摄像机的像素大小设定。细胞内部不发光，并且不会促进细胞内自荧光的信号。多角度 TIRF 显微镜允许选择各种穿透深度。它们提供取决于激发波长的刻度，对于单色 TIRF 图像，通常深度从 70 nm 到 250 nm 深。该协议选择的消逝照明深度为110 nm，这是使用低激光功率的必要性与荧光信号强度之间的折衷的结果，荧光信号的强度随着穿透深度的降低而急剧下降。重要的是要避免过大的消逝场，这些场可以照亮许多细胞内囊泡和细胞内荧光道种群。因此，根据样品类型，应探索几个穿透深度，寻找最佳组合：高信噪比、低激发功率、短曝光时间、短穿透深度。完成此优化后，所有控件和样本的穿透深度保持不变。（C） 在软件引导优化了消逝场的深度和方向后，代表HeLa-GPI-mEGFP单元的荧光和TIRF图像。多角度 TIRF 显微镜还允许优化消光场的方向。此步骤用于最小化散射（即强度急剧增大和图像较不清晰），可根据所用特定显微镜的说明进行。在该协议中，显微镜软件包括自动优化消光场的方向。有关手动优化，请参阅已发布的协议36，37。（D） 代表细胞在荧光中和TIRF照明优化后表示mEGFP-FGFR1构造。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4：捕获时间序列和校准摄像机对单个光子的响应。（A） 在裁剪传感器模式下的 HeLa-mEGFP-FGFR1 单元上捕获的 700 帧时间序列中的第一帧示例。相机芯片使用安装在 TIRF 显微镜上的双视图连接器（图 1B） 部分屏蔽（红色矩形）。内部校准区域在平均强度图像 （B） 中被识别，并通过绘制对数频率与数字电平 （D） 来估计摄像机参数的处理 （C）模拟检测系统（如 EMCCD 摄像机）可检测光子脉冲而不是光子计数，光子脉冲高度分布呈准指数。分布的第一部分是由于放大器和模拟数字转换器，它贡献了高斯读出噪声（信号记录引入的方差）。分布的填充最多的通道（即最频繁的值）是偏移量（eq 13）。使用对数图中的垂直光标，分布的第一部分与指数第二部分（高于 250 DL）分离，该部分表示摄像机对单个光子的平均响应（斜率是 eq. 12 中的 S 因子）。通过测量这些参数，可以估计采集过程中记录的光子密度。计数 （DL） 是伪色阶。像素大小 = 124 nm;图像格式= 256x256像素，穿透深度的消逝场 = 110 nm;校准 ROI #1 = 19x256 像素;校准 ROI #2 = 5x256 像素。DL = 数字电平。曝光 = 1 ms 和 EMGain（eq. 12、13 和 14 中的 G 因子） = 1000。请注意，在光子计数模式下工作且具有背景的摄像机相当于具有 S = 1 （eq. 12） 的模拟探测器，其测量方式为±2d和偏移（eq. 13），其测量方式与模拟系统18相同。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：FGFR1寡头化的N&B分析。（A） 代表结果来自同一盘中表达 mEGFP-FGFR1 的两个 HeLa 细胞，在添加 20 纳克/mL FGF2 后在时间 0 分钟（上）和 7 分钟（底部）捕获，以及（B） 两个表示参考结构 GPI-mEGFP （顶部） 的 HeLa 细胞和GPI-mEGFP-mEGFP（底部）。整个分析序列显示（从左到右）：时间序列的平均强度;绘制所有 B 值作为荧光强度的函数，其中颜色代码表示图像中具有相同 B 值的像素数，矩形光标分隔感兴趣区域 （ROI）、背景 （BG） 和非常低的区域强度 （LI）。请注意，不移动荧光道将给出 B 值 = 1，因为在没有波动的情况下 = = 0;所选 ROI 的 B 映射以及关联的 B 分布直方图。B 值分布配有高斯函数（虚线红线），用于计算平均表观亮度、B（全红线）和分布统计（补充表 1）B 值 = B' = B/S（eq. 15）;强度 = （ -偏移）/S;M = 单体;D = 二分器;刻度条 = 10 微米。原始数据时间序列在补充电影 1，补充电影 2，补充电影 3，和补充电影 4.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6：配体活化引起的FGFR1寡聚动力学。HeLa-mEGFP-FGFR1 细胞的标准化平均亮度（eq. 16）描述的代表性动力学运行，在20纳克/mL FGF2（A） 或50 μg/mL NCAM-Fc（B） 的刺激后。同一盘中的细胞在增加的时间点被捕获，从B分布直方图计算出表的平均亮度B= S.E.。这个数字是经过Zamai等人许可的《细胞科学杂志》（2019）31。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7：快速动力学和数据解释。从复制动力学运行中获得的所有标准化平均亮度值的散点图，其中 HeLa-mEGFP-FGFR1 细胞使用 NCAM-Fc （50 μg/mL） 或 FGF2 （20 纳克/mL） 进行刺激。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplemental Figure 1
补充图 1：MatLab 中分析例程的屏幕快照。N&B 图形用户界面 （GUI） MATLAB 例程的屏幕快照，显示初始分析步骤：上传时间序列;计算平均强度图像、计算强度配置文件、计算 B 映射和 B-I 直方图。请点击此处查看此图的较大版本。

参数 GPI-mEGFP GPI-mEGFP-mEGFP mEGFP-FGFR1 （时间 = 0'） mEGFP-FGFR1 （时间 = 10'）
高斯平均 B 值 1.070 1.141 1.070 1.141
平均 B 值上的 S.E. 0.001 0.001 0.001 0.001
B-vaue 分布的 S.D. 0.059 0.067 0.077 0.075
平均 B 值的 95% 置信区间 1.069 到 1.071 1.139 到 1.143 1.069 到 1.072 1.139 到 1.143
B 值 95% 置信区间的 S.D. 0.058 到 0.060 0.065 到 0.069 0.075 到 0.079 0.073 到 0.078
拟合约束 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0
S.E. 标准错误;S.D. 标准偏差

补充表 1：视光亮度分析。进行了图5中B分布的统计和高斯拟合参数。最小平方高斯拟合是在标准偏差 > 0 的限制下获得的，X 范围自动选择，最大迭代 = 1000。R 平方：mEGFP-FGFR1 单体 = 0.9957，mEGFP-FGFR1 二聚体 0.9940;GPI-mEGFP = 0.9985;GPI-mEGFP-mEGFP = 0.9970。

Supplemental Movie 1
补充影片 1：HeLa-mEGFP-FGFR1细胞的时间序列在时间 = FGF2刺激后0分钟（PBS中20纳克/mL，辅以0.01%BSA），如图5所示。该系列的 800 帧以 7 fps 的未压缩速度重现。图像格式 = 256 x 256 像素;像素大小 = 124 nm;内部校准区域被确定为深色横向带。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

Supplemental Movie 2
补充影片 2：HeLa-mEGFP-FGFR1 细胞图 5所示的时间序列在时间 = FGF2 刺激后 7 分钟（PBS 中 20 纳克/mL 辅以 0.01% BSA）800 帧系列在 7 fps 下未压缩。图像格式 = 256 x 256 像素;像素大小 = 124 nm;内部校准区域被确定为深色横向带。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

Supplemental Movie 3
补充电影 3：添加车辆后 HeLa-GPI-mEGFP 单元图 5所示的时间序列（PBS 辅以 0.01% BSA）。该系列的 1，000 帧以 7 fps 的未压缩速度重现。图像格式 = 256 x 256 像素;像素大小 = 124 nm;内部校准区域被确定为深色横向带。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

Supplemental Movie 4
补充影片 4：添加车辆后 HeLa-GPI-mEGFP-mEGFP 单元图 5所示的时间序列（PBS 辅以 0.01% BSA）。该系列的 1，000 帧以 7 fps 的未压缩速度重现。图像格式 = 256 x 256 像素;像素大小 = 124 nm;内部校准区域被确定为深色横向带。请点击此处查看此视频（右键单击下载）。

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Discussion

N&B 在选择细胞模型和标签策略时需要采取若干预防措施。它只能应用于在图像捕获期间保持稳定粘附的活细胞。由于整个细胞刚性位移引起的额外波动，可以通过适当的图像恢复方法38来处理。然而，一般当细胞移动时，细胞膜也会变形，结构变形，产生较大的额外方差，对膜蛋白的分析造成严重限制。在这项工作中，荧光结构在HeLa细胞系中表达，因为构成FGFR1可以忽略不计。构成蛋白的存在是一种需要避免的条件，否则可能会形成荧光和非荧光受体寡聚物的混合种群。因此，N&B分析仅基于荧光标记蛋白质群的亮度，它将返回对平均寡聚状态的不可靠估计。在应用 N&B 检测亮度仅增加 2 倍的受体二聚化事件时，这一方面尤其重要，例如 FGF2 配体存在时的 FGFR1 二聚化。在这种情况下，混合调暗器的存在可以完全隐藏 N&B 可检测到的二分化事件。荧光寡聚物与非荧光构成形式的污染是任何基于荧光检测的方法的潜在缺陷之一，除非标记的蛋白质在很大程度上被过度表达。然而，在蛋白质过度表达条件下的寡聚研究引起了人们对其功能意义的关注。瞬时转染细胞可能具有可变的荧光水平（即蛋白质浓度），并且可用于测试蛋白质浓度上平均亮度的独立性，因为 N&B 可应用于各种浓度，在探测器的线性响应条件下（参见亮度的定义，eq. 1）。

另一个制约因素是使用活细胞中稳定的荧光素对受体进行化学计量标签。光环标记、荧光蛋白（FP）或其他共价荧光标记是合适的标签，可精确获取细胞中每个蛋白质分子的结合荧光光量。为了降低N&B分析的复杂性，我们使用荧光蛋白或光晕标记，产生1比1的荧光蛋白到蛋白质标签。选择的FP必须是成熟形式的单体，具有可以忽略不计的自我关联倾向，否则，可能导致FP标记受体的人工寡头化。在此协议中，我们使用 （A207K） mEGFP，因为此单点突变废除了 mEGFP 自我聚合趋势，如前面所示 31、39、40 。无论标签策略如何，应检查荧光标记蛋白是否保留所选细胞模型中的生物活性，因为标记分子的功能对于将寡聚物事件与受体信号。在我们的模型中，我们证明了荧光（A207K）mEGFP-FGFR1的自磷酸化后，刺激转染细胞与受体配体FGF231。

N&B基于光照体积中分子的扩散。在数码相机检测中，曝光时间（即模拟检测中的像素驻点时间）必须足够短，以便捕获焦量中一个且只有一个粒子配置。也就是说，在曝光期间，荧光量进入或退出发光体积的概率非常小。接触时间必须短于荧光酸停留时间（+D），即荧光在发光体积中花费的平均时间。因此，在开始N&B实验之前，有必要对目标蛋白的停留时间（或扩散系数）有一些概念，这首先取决于亚细胞定位和分子质量。帧速率是相机获取图像然后完全读取图像所需的时间的反向，通常，它大约根据像素总数和读出速率计算，并结合曝光时间。即使帧速率不需要快速，循环时间（t循环），即帧速率和准备捕获下一帧的时间的总和的总和，可能会影响分析。这些约束可以概括为：t周期>> =D >t。如果循环时间太快，分子在这段时间内不会明显地从一个帧移动到下一个帧，并且将显示为不动（B = 1）。但是，由于分析需要数百帧，因此尽可能快地设置循环（以像素数增加或减小图像格式），以避免细胞位移和细胞膜失真，从而增加较大的额外方差在系列收购期间。在此协议示例中，最慢的循环时间是 22 毫秒，因此可以在 11 秒内获取 500 帧。

分子亮度不是绝对数量;它取决于荧光的分子特性（横截面和量子产量），基于实验设置（探测器和光学）以及激发条件，如激光功率。因此，TIRF-N&B 方法产生明显的亮度，因此，建立"参考单元模型"以单声寡状态表示参考构造至关重要。参考结构携带正在研究的蛋白质的相同荧光量标记 [这里，A207K） mEGFP]，它在同一亚细胞室（这里，等离子膜）中进行本地化。在这项工作中，我们使用糖氧磷脂酰胺醇 （GPI） 锚定 -（A207K） mEGFP 结构，我们已经反复证明是一个可靠的单体亮度标准，细胞表面受体标签与相同的荧光30，31.

一个主要缺点是氟荧光光漂白的发生，当同一细胞在动力学运行过程中反复暴露在光下，并导致对寡聚状态的低估时，很可能发生这种现象。为了防止这种情况，亮度动力学是通过合并不同时间点捕获的不同细胞的平均亮度而获得的（图6）。这就是说，在培养皿中，每个细胞都是动力学的不同时间点，培养皿代表整个动力学运行。

当寡聚动力学快速而复杂时，例如由非规范配体（NCAM31）引起的FGFR1寡聚，标准化平均亮度与时间的轮廓可以是可变的和不稳定的（图6B).在这种情况下，由于每次移动和聚焦新细胞、选择 ROI、捕获和检查/丢弃时间序列，因此无法通过在精确时间点读取细胞的复制盘来确定可重复性。因此，可以从亮度变化的动力学轮廓相似性和振幅来评估可重复性。

结果的概述如图7所示。散射图仅说明同一盘的细胞中测量的平均亮度，而忽略了每次捕获的时间。在此图中，两个配体在受体的寡聚状态上引起的主要差异仍然很明显，尽管所有动力学信息都被删除。然而，对于这两组实验（FGF2-与NCAM引起的寡头化），在图7中确定每次运行的平均值 = S.D.的传统方法会导致误导性的结论，因为FGF2刺激的FGFR1分子明显进入两个定义良好的状态，而NCAM诱导不稳定和循环的寡聚FGFR1混合物，这些混合物不能很好地用平均值 = S.D. 值表示。

总之，从实验的角度来看，N&B只需要使用配备快速采集模块和专用软件的显微镜。感兴趣的蛋白质可以贴上各种单体荧光蛋白或有机荧光草的标签，但定量测量需要满足几个条件：化学计量标签、参考亮度标准、检测器校准和无光漂白。在此背景下，N&B方法是破译活细胞中蛋白质的时空寡头化的有力工具。此外，最近在解决统计权重41的重新采样原始数据以及将荧光交叉相关光谱与交叉相关 N&B42相结合方面的最新进展正在改进和改进 N 的适用性蛋白质寡头化和相互作用研究的方法。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

CNIC由Ciencia、创新与大学部和Pro CNIC基金会支持，是塞韦罗·奥乔亚卓越中心（SEV-2015-0505）。我们还得到欧洲区域发展基金（FEDER）"欧洲区域发展基金"的支持。UC 感谢意大利癌症协会、国际癌症研究协会（现称全球癌症研究）和意大利卫生部的支持。A.T. 感谢"伦巴第大区万达松银行"部分支持他与PV奖学金"Progetto专业+ 伊万诺贝奇"2011-2012年的工作。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

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生物学， 问题 153， 受体簇， N&B， 数量和亮度， 力矩分析， 蛋白质寡聚物， 细胞膜， TIRF 显微镜
通过总内部反射荧光显微镜与数量和亮度分析相结合，活细胞中细胞表面受体的显微化动力学
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Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).

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