Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Платформа Lab-on-a-CD для генерации многоклеточных трехмерных сфероидов

Published: November 7, 2019 doi: 10.3791/60399
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Department of Mechanical Engineering, Graduate School, Chung-Ang University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, Seoul National University

Summary

Мы представляем моторное центробежное микрофлюидное устройство, которое может культивировать клеточные сфероиды. С помощью этого устройства, сфероиды одного или нескольких типов клеток могут быть легко сконкультурированы в условиях высокой гравитации.

Abstract

Трехмерная культура сфероидных клеток может получить более полезные результаты в клеточных экспериментах, поскольку она может лучше имитировать клеточную микросреду живого тела, чем двухмерную клеточную культуру. В этом исследовании мы изготовили электромоторную платформу Lab-on-a-CD (compact disc), называемую центробежной микрофлюидной системой культуры сфероидов (CMS), чтобы создать трехмерные (3D) клеточные сфероиды, реализующие высокую центробежную силу. Это устройство может варьировать скорость вращения для создания условий гравитации от 1 х г до 521 х г. Система CMS имеет 6 см в диаметре, имеет сто 400 мкм микроуэллов, и производится путем литья с полидиметилсилоксаном в поликарбонатной плесени, сделанной компьютерным аппаратом управления числом. Барьерная стена на входе канала системы CMS использует центробежную силу для равномерного равномерного распределения клеток внутри чипа. В конце канала есть область слайда, которая позволяет клеткам входить в микроколодцы. В качестве демонстрации, сфероиды были созданы монокультуры и кокультуры человеческих жиров полученных стволовых клеток и легких фибробластов человека в условиях высокой гравитации с помощью системы. Система CMS использовала простую схему работы для производства сфероидов кокультуры различных структур концентрических, Янус, и сэндвич. Система CMS будет полезна в клеточной биологии и исследованиях тканей, которые требуют сфероидов и органоидной культуры одного или нескольких типов клеток.

Introduction

Легче моделировать биологические микросреды in vivo с трехмерной (3D) культурой сфероидных клеток, чем с двухмерной (2D) клеточной культурой (например, обычной культурой клеток петри) для получения более физиологически реалистичного экспериментального результаты1. В настоящее время доступны методы формирования сфероидов включают висячие капли техники2, жидкая накладка техника3, carboxymethyl целлюлозы техники4, магнитной силы на основе микрофлюидной техники5, и использование биореакторы6. Хотя каждый метод имеет свои преимущества, необходимо дальнейшее улучшение воспроизводимости, производительности и генерации сфероидов кокультуры. Например, в то время как микрофлюидная техника5 на основе магнитной силы является относительно недорогой, влияние сильных магнитных полей на живые клетки необходимо тщательно рассмотреть. Преимущества сфероидной культуры, особенно в изучении мезенхимальной дифференциации стволовых клеток и распространения, были зарегистрированы в нескольких исследованиях7,8,9.

Центробежная микрофлюидная система, также известная как lab-on-a-CD (компактный диск), полезна для легкого контроля жидкости внутри и использования вращения субстрата и, таким образом, была использована в биомедицинских приложениях, таких как иммуноанализы 10, колорометрические анализы для обнаружения биохимических маркеров11,усиление нуклеиновой кислоты (ПЦР), автоматизированные системы анализа крови12и все-в-одном центробежные микрофлюидные устройства13. Движущей силой, контролирующей жидкость, является центростремительная сила, создаваемый вращением. Кроме того, несколько функций смешивания, вальвинга и разделения образцов можно сделать просто в этой единственной платформе компакт-диска. Однако, по сравнению с вышеупомянутыми методами биохимического анализа, было меньше испытаний, применяющих CD-платформы к культурным клеткам, особенно сфероидам14.

В этом исследовании мы показываем производительность центробежной микрофлюидной сфероидной системы (CMS) путем монокультуры или кокультуры стволовых клеток человека, полученных из жиров (hASC) и фибробластов легких человека (MRC-5). В этой статье подробно описывается методология исследования нашей группы15. Таким образом, платформа сфероидной культуры-на-CD может быть легко воспроизведена. Представлена система генерации CMS, включающая чип культуры CMS, держатель чипа, двигатель постоянного тока, моторную установку и вращающуюся платформу. Моторная крепление напечатано 3D с акрилонитрилом бутадиена стирола (ABS). Держатель чипа и вращающаяся платформа cNC (компьютерный цифровой контроль) отражаются с ПК (поликарбонат). Скорость вращения двигателя контролируется от 200 до 4500 об/мин путем кодирования PID (пропорционально-интегрально-производной) алгоритма на основе импульсно-ширинной модуляции. Его габариты 100 мм х 100 мм х 150 мм и вес 860 г, что делает его легким в обращении. Используя систему CMS, сфероиды могут быть созданы в различных условиях гравитации от 1 х г до 521 х г,поэтому изучение содействия дифференциации клеток в условиях высокой гравитации может быть продлено с 2D-клеток16,17 до 3D Сфероида. Кокультура различных типов клеток также является ключевой технологией для эффективного имитирования среды in vivo18. Система CMS может легко генерировать монокультурные сфероиды, а также сфероиды кокультуры различных типов структур (например, концентрические, янус ы, и сэндвич). Система CMS может быть использована не только в простых сфероидных исследованиях, но и в 3D органоидных исследованиях, для рассмотрения структур органов человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Центробежная микрофлюидная сфероидная (CMS) культура изготовления чипов

  1. Сделать ПК формы для верхнего и нижнего слоев чипа культуры CMS по ч. 00 м. Подробные размеры чипа приведены на рисунке 1.
  2. Смешайте базу PDMS и отвержение PDMS в соотношении 10:1 (w/w) в течение 5 мин и поместите в дешикатор на 1 ч для удаления пузырьков воздуха.
  3. После заливки смеси PDMS в формы чипа культуры CMS, удалить пузырьки воздуха на 1 ч больше и вылечить в тепловой камере при температуре камеры при температуре в 80 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
  4. Поместите их в пылесосом плазменный очиститель с поверхностями, которые будут связаны вверх и подвергать их воздух-помощь плазмы на мощность 18 Вт для 30 с.
  5. Скрепите два слоя чипа культуры CMS и поместите его в тепловую камеру при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы увеличить прочность стыкания.
  6. Стерилизовать чип культуры CMS в автоклавном стерилизаторе при 121 кв. и 15 пси.

2. Подготовка клеток

  1. Оттепели 1 мл флакона, содержащего 5 и 105-1 х 106 hASCs или клетки MRC-5s в водяной бане при 36,5 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
  2. Добавьте 1 мл модифицированного орла Dulbecco Medium (DMEM) в флакон и аккуратно смешайте с 1000-м пипеткой.
  3. Положите 15 мл DMEM предварительно нагревается до 36,5 градусов по Цельсию в 150 мм диаметром Петри блюдо с помощью пипетки и добавить клетки из флакона.
  4. После 1 дня, аспирация DMEM и заменить на 15 мл свежего DMEM. Впоследствии, изменить средства массовой информации каждые 2 или 3 дня.
  5. Чтобы отделить клетки от чашки Петри, добавьте 4 мл трипсина в блюда Петри и поместите их в инкубатор при 36,5 градуса х и 5% CO2 в течение 4 мин.

3. Монокультурное формирование сфероидов

  1. Положите 2,5 мл 4% (w/v) pluronic F-127 раствор в входе отверстие чипа культуры CMS(Рисунок 2A) при вращении чипа на 500-1000 об/ ч, а затем повернуть чип на 4000 об/мин в течение 3 минут с помощью системы CMS (Рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: плюроное покрытие предотвращает вложение клеток в порт входе во время вращения чипа. Убедитесь, что воздух не в ловушке в микроколодцах.
  2. Инкубировать чип культуры CMS заполнены с pluronic раствор ночь на 36,5 градусов по Цельсию в 5% CO2.
  3. Снимите плюронический раствор, промойте оставшийся плюронический раствор DMEM и высушите чип на 12 ч на чистой скамейке.
  4. Добавьте 2,5 мл DMEM в чип культуры CMS и поверните чип на 4000 об/мин в течение 3 минут для предварительного промотирования внутри чипа.
  5. Остановить вращение и вытащить 100 Зл DMEM, чтобы освободить место для введения подвески клетки.
  6. Добавьте 100 зЛ клеточных суспензий, которые содержат либо 5 х 10hASCs или 8 '105 MRC-5s путем pipetting Равномерно распространять клетки путем pipetting 3-5x для повторной приостановки.
  7. Поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 минут для ловушки клеток в каждом микроколодце центробежной силой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная скорость вращения может привести к побегу клеток через отверстия выброса раствора.
  8. Культура клеток в течение 3 дней в инкубаторе при 36,5 градуса цельсия, влажности и 5% CO2, вращаясь при 1000-2000 об/мин. Меняйте среду культуры каждый день.

4. Формирование сфероидов кокультуры

  1. Формирование концентрических сфероидов
    1. Добавьте первые ячейки, 2,5 и 105 hASCs, и поверните чип на 3000 об/мин. После 3 мин, добавить вторые клетки, 4 и 105 MRC-5s, и повернуть чип на 3000 об/ в минуту в течение 3 мин. Введите в общей сложности 100 qL клеточных суспензий путем pipetting. При введении клеток сдвинйте скорость вращения до 500-1000 об/мин.
    2. Культура клеток в инкубаторе при 36,5 градуса цельсия, йgt;95% влажности%, и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин. Концентрические сфероиды создаются в пределах 24 ч. Для долгосрочной культуры, изменить культуру среды каждый день.
  2. Янус сфероидное образование
    1. Добавьте 100 кЛ клеточных суспензий, содержащих первые ячейки, 2,5 и 105 hASCs, путем пайпетирования, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    2. Инкубировать чип при 36,5 градуса х с, влажности и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин в течение 3 ч.
    3. Добавьте 100 qL клеточных суспензий, содержащих второй набор ячеек, 4 и 105 MRC-5, путем пайпетирования, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    4. Культура клеток в инкубаторе при 36,5 градуса Цельсия, йgt;95% влажности, и 5% CO2 при повороте на 1000-2000 об/мин. Сфероиды Janus создаются в пределах 24 ч. Для долгосрочной культуры, изменить культуру среды каждый день.
  3. Формирование сфероидов сэндвича
    1. Добавьте 100 кЛ клеточных суспензий, содержащих первые ячейки, 1,5 и 105 hASCs, путем пайпетирования, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    2. Инкубировать чип при 36,5 градуса х с, влажности и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин в течение 3 ч.
    3. Добавьте 100 кЛ клеточных суспензий, содержащих вторые клетки, 3 х 105 MRC-5s, путем трубоукладки, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    4. Инкубировать чип при 36,5 градусах Цельсия, йgt;95% влажности%, и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин в течение 3 ч.
    5. Добавьте 100 кЛ клеточных суспензий, содержащих третьи клетки, 1,5 и 105 hASCs, путем пайпетирования, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    6. Культура клеток в инкубаторе при 36,5 градуса цельсия, йgt;95% влажности%, и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин. Сэндвич сфероиды создаются в пределах 12 ч. Для долгосрочной культуры, изменить культуру среды каждый день.

5. Окрашивание клеток

  1. Разогрейте краситель флуоресценции до комнатной температуры (20 градусов по Цельсию).
  2. Добавьте 20 зл. ангидроусдийульфоксида (DMSO) на флакон, чтобы сделать раствор 1 мМ.
  3. Разбавить флуоресценцию до конечной рабочей концентрации в 1 км с помощью DMEM.
  4. Добавьте флуоресценцию в суспензию клетки и аккуратно применяйте с помощью пипетки.
  5. Инкубировать 20 мин при 36,5 градусах Цельсия, влажности в размере 95%, и 5% CO2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чип культуры CMS диаметром 6 см(рисунок 2)был успешно изготовлен по вышеуказанному протоколу. Во-первых, чип был сделан отдельно от верхнего слоя и нижнего слоя, а затем связаны друг с другом плазменной связи. В результате сфероиды могут быть легко собраны путем отсоединения чипа. Канал чипа культуры CMS включает в себя входной порт и центральные, слайдовые и микроколодцы(рисунок 3). Клеточные, средние и плюронические растворы вводятся через впускное отверстие диаметром 5 мм. Вводимые ячейки равномерно распределяются путем повторного 3-5x в районе вхонного порта. Клетки подвергаются центробежной силе в центральном регионе и распространяются наружу. Поскольку центральный регион выше микроколодца, он может содержать больше носителей, что позволяет сфероидам дольше выживать. Высота микроколодца составляет 0,4 мм, а высота центрального региона - 1,5 мм. В центре центрального района присутствуют всасывающие отверстия для легкого удаления внутренних растворов. Область горки представляет собой наклонную область, соединяющую центральный регион и микровеллы. Клетки движутся по склону 45 "и оседают в области микроколодца, где клетки оседают, растут и запутываются, образуя сфероиды. Микровеллы, расположенные в 14 мм от центра чипа, полуцилиндрические с высотой 400 мкм и диаметром 400 мкм. В общей сложности 100 сфероидов могут быть созданы одновременно в 100 микроуэллов.

Используя подготовленный чип CMS, сфероиды могут быть сгенерированы в порядке, указанном в протоколе(рисунок 4). Монокультура и кокультуры сфероиды были созданы с hASC и MRC-5 клеток. Для создания монокультурного сфероида каждого типа клеток вводились 5 и10 hASCs или 8 и 105 MRC-5. Количество вводимых клеток не зависит от размера ячейки. Замедленное изображение обоих типов клеток было взято при 2000 об/мин до 3-го дня клеточной культуры(рисунок 5). Сфероиды кокультуры hASC и MRC-5 также были созданы с концентрическими, Janus и сэндвич-структурами. Чтобы сделать концентрические сфероиды, первые клетки (2,5 и 105 hASCs) были введены и второй клетки (4 х 105 MRC-5s) были введены 3 мин позже(рисунок 6A). Когда первые клетки были введены, они стали U-образными из-за высокой гравитации, и когда вторые клетки были введены, они двинулись к середине U-формы. Со временем первые U-образные клетки окружили вторые клетки и завершили концентрические сфероиды. Для того, чтобы сфероиды Janus, были введены первые клетки (2,5 и 105 hASCs), а вторые клетки (4 х 105 MRC-5s) были введены 3 ч позже(рисунок 6B). Когда интервал инъекций между двумя клетками был длинным, форма первых клеток изменилась с U-формы на эллиптической формы путем скопления клеток. После того, как вторые клетки были добавлены в эллиптической форме первых клеток, сфероиды Janus были созданы. В случае сэндвич сфероидов, первые клетки (1,5 и 105 hASCs) были введены, вторая клетка (3 х 105 MRC-5s) были введены 3 ч позже, а третьи клетки (1,5 и 105 hASCs) были введены после еще 3 ч ( Рисунок 6C) были введены после еще 3 ч ( Рисунок 6C) были введены после еще 3 ч ( Рисунок 6C) были введены после еще 3 ч ( Рисунок 6C) были введены после еще 3 ч (Рисунок 6C ). Подобно сфероиду Janus, каждая клетка агрегируется в эллиптической форме, и три слоя укладываются для создания сэндвич сфероидов. Наконец, чтобы продемонстрировать долгосрочные культурные возможности CMS, hASCs были культивированы, подвергаются высокой гравитации в течение 7 дней, а затем живой / мертвый ассс выполняется, чтобы показать, что большинство клеток выжили(Рисунок 7). Кроме того, фотографии всех микровелл CMS были сделаны после 3 дней культивирования MRC-5s, чтобы показать отличную однородность и сферичность сфероидов(рисунок 8).

Figure 1
Рисунок 1: Размеры верхнего и нижнего слоев чипа культуры CMS. PC плесень была сделана с помощью машины CNC и реплицируется с PDMS, чтобы сделать чип культуры CMS на основе чертежа, созданного 3D CAD (компьютерный дизайн) программы. Четыре круга по краям верхнего и нижнего слоев для выравнивания двух слоев. Размеры в миллиметрах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Фотографии системы CMS. (A) Фотографии завершенного чипа культуры CMS. Диаметр чипа составляет 6 см, а диаметр микроколодца 400 мкм. Номера над микровеллами представляют индивидуальные числа микровелл от 1 до 100. Эти цифры были выгравированы в форму. Шкала бар 400 мкм. (B) Фотография всей системы CMS. Система CMS включает в себя чип культуры CMS, держатель чипа, двигатель ПОСТОЯННОГО тока и вращающуюся платформу. Устройства CMS могут генерировать гравитационные условия до 521 х г за счет силы вращения. Держатель чипа предотвращает разделение чипа культуры CMS из-за высокой гравитации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: компоненты канала CMS. (A) Схематические изображения и (B) фотографии поперечного сечения чипа культуры CMS. Чип культуры CMS состоит из входной порт и центральных, слайдов и микроколодцов. Поскольку вводимые клетки не проходят через барьер со скоростью вращения менее 1000 об/мин, барьер помогает в повторной подвеске клетки и даже распределении в микроскважину. Шкала бар 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Процесс загрузки ячеек в чип культуры CMS. ()Для предотвращения клеток от прилипания к нижней части чипа, пальто с 2,5 мл раствора pluronic F-127 при 4000 об/мин. Подождите день для покрытия, которые будут применены. (B) Удалить плуронический раствор и заполнить канал с 2,5 мл среды DMEM. (C) Удалите 100 зл и добавьте 100 зл клеточной суспензии. В это время, resuspend 3-5x так, что клетки равномерно распределены. (D) Переместите клетки в микроскважину, вращая чип, а затем культуры клеток в течение 3 дней на 1000 до 2000 об / мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Покадровая фотография монокультурных сфероидов из hASC и мРК-5. Клетки выращивались по 24 ч при 2000 об/мин. Сфероид был создан в пределах 24 ч. Шкала бар 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Флуоресценция изображения сфероидов сокультуры. (A) Концентрические формы сфероидов, в которых клетки hASC (зеленые) окружают клетки MRC-5 (красный). (B) Janus сфероидной формы, в которой две клетки симметричны. (C) Сэндвич сфероидной формы, в которой слои hASC укладываются между двумя слоями MRC-5. Шкала бар 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Live / Мертвый ассс hASC на 7-й день. Зеленый флуоресцентный цвет представляет живые клетки, а красный флуоресцентный цвет — мертвые клетки. Шкала бар 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: MRC-5 сфероидов на 3-й день. Относительно постоянное количество клеток входят в каждый микроскважину и образуют сфероиды, имеющие относительно постоянную сферичность в системе CMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Сбор сфероидов. Культивированные сфероиды можно собирать путем деления двух слоев чипа культуры CMS. Два плазменных слоя можно легко отделить вручную. Затем сфероиды собираются из микровелл в нижнем слое просто путем пипетки. Шкала бар 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CMS является закрытой системой, в которой все инъекционные клетки попадают в микроскважину без отходов, что делает его более эффективным и экономичным, чем обычные методы генерации сфероидов на основе микроскважин. В системе CMS, средства массовой информации заменяется каждые 12-24 ч через всасывающее отверстие, предназначенное для удаления носителя в чипе(рисунок 3A). Во время процесса всасывания средств массовой информации, едва ли какие-либо средства массовой информации ускользает изнутри микроколодца из-за поверхностного натяжения между средствами массовой информации и стеной микроколодца. Пользователь может легко удалить захваченных средств массовой информации, нажав вблизи области микроколодца чипа пальцем, потому что чип из PDMS является эластичным и гибким. Клетки в микроколодце остаются стабильными, не избегая, даже с несколькими изменениями мультимедиа. Для достижения одинакового качества сфероида во всех 100 микровеллах вращение устройства не должно быть эксцентричным, а чип должен быть ассимичным. В противном случае, переменное количество клеток может войти в каждый колодец и размер и форма сфероида может отличаться. В обычной системе микроколодцов, поскольку воздух часто оказывается в ловушке в микроколодце, необходимо удалить пузырьки воздуха. Тем не менее, система CMS не требует процесса удаления пузырьков, потому что высокая центробежная сила, генерируемая вращением, заставляет носители толкать пузырьки и выжимать их из микроколодцев.

Система CMS также имеет свои ограничения по сравнению с обычными методами. Система CMS требует большего пространства культуры (например, большое пространство инкубатора), поскольку она включает в себя двигатель, вращающуюся платформу и контроллер, а ее общий размер составляет примерно 100 мм х 100 мм х 150 мм(рисунок 2B). Кроме того, он вызывает небольшую, но постоянную вибрацию. Мы ожидаем, что миниатюризация системы (надеюсь, аналогична размеру 6 скважинных пластин) решит эти вопросы.

Следует отметить, что культивированные сфероиды могут быть собраны путем разделения двух плазменных слоев системы CMS(рисунок 9). Связь двух слоев достаточно сильна, чтобы предотвратить утечку носителей во время работы системы. Однако из-за небольшой области склеивания она отделяется от руки. Сфероиды могут быть просто собраны из нижнего слоя путем pipetting.

Система CMS имеет лучшую воспроизводимость и производительность, чем обычные методы генерации сфероидов. Обычные методы, такие как обычный микровелл или висячие методы капель, являются трудоемкими. Однако в системе CMS гораздо проще увеличить количество сфероидов, просто увеличив размер чипа. С помощью этого устройства, это также можно генерировать органоиды, которые требуют культуры многоклеточных типов, что не легко сделать в обычных методов культуры. В дополнение к клеткам в этом исследовании (hASC и MRC-5), CMS может быть использован для производства сфероидов с использованием различных других типов клеток, которые могут образовывать сфероиды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований (2016R1D1A1B03934418) и Программой развития био- и медицинских технологий (2018M3A9H1023141) NRF и финансируется корейским правительством, MSIT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  3. Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
  4. Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
  5. Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
  6. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  7. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  8. Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
  9. Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
  10. Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
  11. Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
  12. Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
  13. Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
  14. Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
  15. Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
  16. Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
  17. Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
  18. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).

Tags

Биоинженерия Выпуск 153 3D сфероид центробежные микрофлюидные системы лаборатория-на-CD центробежная сила гипергравитация агрегация клеток
Платформа Lab-on-a-CD для генерации многоклеточных трехмерных сфероидов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee,… More

Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter