Summary
We presenteren een centrifugale microfluïdisch apparaat met motoraandrijving dat celsferioïden kan cultiveren. Met behulp van dit apparaat kunnen sferoïden van enkelvoudige of meervoudige celtypen gemakkelijk onder hoge zwaartekracht worden gecocultureerd.
Abstract
Een driedimensionale spheroid-celcultuur kan nuttiger resultaten verkrijgen in celexperimenten, omdat het de celmicroomgevingen van het levende lichaam beter kan simuleren dan de tweedimensionale celcultuur. In deze studie hebben we een elektrisch motorgestuurd lab-on-a-CD-platform (compact disc) gemaakt, een centrifugale microfluïdisch-gebaseerd spheroid (CMS)-cultuur systeem, om driedimensionale (3D) celsferoïden te maken die een hoge centrifugale kracht implementeren. Dit apparaat kan rotatiesnelheden variëren om zwaartekracht condities te genereren van 1 x g tot 521 x g. Het CMS-systeem is 6 cm in diameter, heeft 500 μm micro putten, en is gemaakt door molding met Polydimethylsiloxaan in een polycarbonaat mal premade door een computer numerieke besturings machine. Een barrière muur bij de ingang van het kanaal van het CMS-systeem maakt gebruik van centrifugale kracht om cellen gelijkmatig in de chip te verspreiden. Aan het einde van het kanaal is er een diagebied dat de cellen in staat stelt om de micro putjes in te voeren. Als demonstratie werden sferoïden gegenereerd door monocultuur en cocultuur van stamcellen en menselijke Long fibroblasten met een hoge zwaartekracht, met behulp van het systeem. Het CMS-systeem gebruikte een eenvoudig bedienings schema om cocultuurspheroids van verschillende structuren van concentrische, Janus en sandwich te produceren. Het CMS-systeem zal nuttig zijn in celbiologie en weefsel engineering studies die sferoïden en organoïde cultuur van enkele of meerdere celtypen vereisen.
Introduction
Het is gemakkelijker om biologische in vivo micro-omgevingen te simuleren met driedimensionale (3D) spheroid-celcultuur dan met tweedimensionale (2D) celkweek (bijv. conventionele Petri schaalcelcultuur) om fysiologisch realistische experimentele resultaten1. Op dit moment beschikbare spheroid-vormings methoden omvatten de hangende druppel techniek2, vloeistofoverlay-techniek3, Carboxymethyl cellulose techniek4, op magnetische kracht gebaseerde microfluïdische techniek5, en het gebruik van bioreactoren6. Hoewel elke methode zijn eigen voordelen heeft, is verdere verbetering van de reproduceerbaarheid, productiviteit en het genereren van cocultuursspheroïden noodzakelijk. Bijvoorbeeld, terwijl de magnetische kracht gebaseerde microfluïdische techniek5 relatief goedkoop is, moeten de effecten van sterke magnetische velden op levende cellen zorgvuldig worden overwogen. De voordelen van spheroid-cultuur, met name in de studie van mesenchymale stamcel differentiatie en proliferatie, zijn gemeld in verschillende onderzoeken7,8,9.
Het centrifugale microfluïdische systeem, ook bekend als lab-on-a-CD (compact disc), is handig om de vloeistof binnen eenvoudig te regelen en de rotatie van het substraat te benutten en is dus gebruikt in biomedische toepassingen zoals immunoassays10, colorimetrische assays voor het opsporen van biochemische markers11, nucleïnezuur versterking (PCR) testen, geautomatiseerde bloedanalyse systemen12, en all-in-One centrifugale microfluïdische apparaten13. De drijvende kracht die de vloeistof bestuurt, is de centripetale kracht die wordt gecreëerd door rotatie. Bovendien kunnen meerdere functies van mengen, valving en monster splitsing eenvoudig worden gedaan in dit enkele CD-platform. In vergelijking met de bovengenoemde biochemische analysemethoden zijn er echter minder proeven uitgevoerd om cd-platforms toe te passen op kweekcellen, met name sferoïden14.
In deze studie tonen we de prestaties van het centrifugale microfluïdische spheroid-systeem (CMS) door monocultuur of cocultuur van stamcellen die afkomstig zijn van menselijke adipeus (hASC) en humane Long fibroblasten (MRC-5). Dit artikel beschrijft in detail de onderzoeksmethodologie van onze groep15. Zo kan het spheroid Culture lab-on-a-CD-platform eenvoudig worden gereproduceerd. Er wordt een CMS-genererend systeem gepresenteerd dat bestaat uit een CMS-kweek chip, een chip houder, een DC-motor, een motor bevestiging en een draaiend platform. De Motorsteun is 3D bedrukt met acrylonitril butadieen styreen (ABS). De chip houder en het roterende platform zijn CNC (computer numerieke besturing) bewerkt met de PC (polycarbonaat). De rotatiesnelheid van de motor wordt geregeld van 200 tot 4.500 rpm door het coderen van een PID (proportioneel-integraal-afgeleid) algoritme op basis van Pulsbreedtemodulatie. De afmetingen zijn 100 mm x 100 mm x 150 mm en het weegt 860 g, waardoor het gemakkelijk te hanteren is. Met behulp van het CMS-systeem kunnen sferoïden onder verschillende zwaartekracht condities worden gegenereerd van 1 x g tot 521 x g, zodat de studie van de promotie van celdifferentiatie onder hoge zwaartekracht kan worden uitgebreid van 2D-cellen16,17 naar 3D spheroid. Cocultuur van verschillende soorten cellen is ook een belangrijke technologie voor het effectief nabootsen van de in vivo omgeving18. Het CMS-systeem kan eenvoudig monocultuur-sferoïden genereren, evenals cocultuursspheroids van verschillende structuurtypen (bijv. concentrisch, Janus en sandwich). Het CMS-systeem kan niet alleen worden gebruikt in eenvoudige spheroid-studies, maar ook in 3D-organoïde-studies, om menselijke orgaan structuren te overwegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. centrifugale microfluidic-gebaseerde spheroid (CMS) cultuur chip fabricage
- Maak PC-mallen voor de bovenste en onderste lagen van de CMS-kweek chip door CNC-bewerking. Gedetailleerde afmetingen van de chip worden gegeven in Figuur 1.
- Meng PDMS base en PDMS Uithardings middel in een verhouding van 10:1 (w/w) gedurende 5 min en plaats in een exsiccator voor 1 uur om luchtbellen te verwijderen.
- Na het gieten van het PDMS mengsel in de mallen van de CMS cultuur chip, verwijder luchtbellen voor 1 h meer en genezen in een warmte kamer bij 80 ° c voor 2 h.
- Plaats ze in de gestofzuigd plasma reiniger met de te verlijmen oppervlakken en stel ze bloot aan luchtgeassisteerd plasma met een vermogen van 18 W gedurende 30 sec.
- Bind de twee lagen van de CMS cultuur chip en plaats deze in de warmte kamer bij 80 °C gedurende 30 minuten om de adhesie sterkte te verhogen.
- Steriliseer de CMS Culture chip in een autoclaaf sterilisator bij 121 °C en 15 psi.
2. voorbereiding van de cel
- Ontdooit de 1 mL injectieflacon met 5 × 105– 1 × 106 HASCS-of MRC-5s-cellen in een waterbad van 36,5 °c gedurende 2 minuten.
- Voeg 1 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) toe aan een injectieflacon en meng zachtjes met een pipet van 1.000 μL.
- Zet 15 mL van de DMEM voorverwarmd tot 36,5 °C in een Petri schaaltje van 150 mm diameter met behulp van een pipet en voeg de cellen uit de injectieflacon toe.
- Na 1 dag, aspireren de DMEM en vervangen door 15 mL verse DMEM. Verander vervolgens de media elke 2 of 3 dagen.
- Om de cellen los te maken van de petrischaal, Voeg 4 mL trypsine toe aan de petrischaaltjes en plaats ze in een incubator bij 36,5 °C en 5% CO2 gedurende 4 min.
3. monocultuur-spheroid-vorming
- Zet 2,5 mL van 4% (w/v) pluronic F-127-oplossing in het inlaat gat van de CMS-kweek chip (Figuur 2a) terwijl u de chip draait met 500 – 1000 rpm en draai vervolgens de chip bij 4.000 rpm gedurende 3 minuten met behulp van het CMS-systeem (Figuur 2b).
Opmerking: de pluronic coating voorkomt celbevestiging aan de inlaatpoort terwijl de chip draait. Zorg ervoor dat er geen lucht in de micro putjes zit. - Incuberen de CMS cultuur chip gevuld met pluronische oplossing 's nachts bij 36,5 °C in 5% CO2.
- Verwijder de pluronische oplossing, spoel de resterende pluronische oplossing met DMEM uit en droog de chip voor 12 uur op een schone Bank.
- Voeg 2,5 mL DMEM toe aan de CMS Culture chip en draai de chip bij ~ 4.000 rpm gedurende 3 min voor het voorbevochtigen van de binnenkant van de chip.
- Stop de rotatie en trek 100 μL van de DMEM uit om ruimte te maken voor het injecteren van de celsuspensie.
- Voeg 100 μL celsuspensies toe die 5 × 105 hascs of 8 × 105 MRC-5s bevatten door Pipetteer de cellen gelijkmatig te verdelen door Pipetteer 3 – 5x voor resuspensie.
- Draai de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 minuten om de cellen in elke titer te overvullen met een centrifugale kracht.
Opmerking: overmatige rotatiesnelheid kan leiden tot het ontsnappen van de cel door de oplossing uitwerpen gaten. - Kweek de cellen gedurende 3 dagen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2, draaibaar bij 1000 – 2000 rpm. Verander elke dag het kweekmedium.
4. cocultuurspheroid-vorming
-
Concentrische sferoïden-vorming
- Voeg de eerste cellen, 2,5 × 105 hascs, en draai de chip op 3.000 rpm. Na 3 min, voeg de tweede cellen, 4 × 105 MRC-5S, en draai de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min. Injecteer een totaal van 100 μL celsuspensies door pipetteren. Wanneer de cellen worden geïnjecteerd, verschuift u de rotatiesnelheid naar 500-1000 rpm.
- Kweek de cellen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid% en 5% CO2 door te roteren op 1000 – 2000 rpm. De concentrische sferoïden worden binnen 24 uur aangemaakt. Voor lange termijn cultuur, verander het cultuurmedium elke dag.
-
Janus spheroid-formatie
- Voeg 100 μL celsuspensies met de eerste cellen, 2,5 × 105 hascs, toe door pipetteren terwijl de chip op 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Inincuberen van de chip bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2 door te roteren bij 1000 – 2000 rpm gedurende 3 uur.
- Voeg 100 μL celsuspensies met de tweede reeks cellen, 4 × 105 MRC-5S, toe door pipetteren terwijl de chip met 500 – 1000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Kweek de cellen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2 door te roteren op 1000 – 2000 rpm. De Janus sferoïden worden binnen 24 uur gecreëerd. Voor lange termijn cultuur, verander het cultuurmedium elke dag.
-
Sandwich-spheroid-vorming
- Voeg 100 μL celsuspensies met de eerste cellen, 1,5 × 105 hascs, toe door pipetteren terwijl de chip op 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Inincuberen van de chip bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid en 5% CO2 door te roteren bij 1000 – 2000 rpm gedurende 3 uur.
- Voeg 100 μL celsuspensies met de tweede cellen, 3 × 105 MRC-5S, toe door pipetteren terwijl de chip met een snelheid van 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Inincuberen van de chip bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid%, en 5% CO2 door te roteren bij 1000 – 2000 rpm gedurende 3 uur.
- Voeg 100 μL celsuspensies met de derde cellen, 1,5 × 105 hascs, toe door pipetteren terwijl de chip met een snelheid van 500 – 1.000 rpm draait. Draai vervolgens de chip bij 3.000 rpm gedurende 3 min.
- Kweek de cellen in de incubator bij 36,5 °C, > 95% luchtvochtigheid% en 5% CO2 door te roteren op 1000 – 2000 rpm. De sandwich sferoïden worden binnen 12 uur aangemaakt. Voor lange termijn cultuur, verander het cultuurmedium elke dag.
5. celkleuring
- Verwarm de celfluorescentie kleurstof op kamertemperatuur (20 °C).
- Voeg 20 μL watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) per injectieflacon toe om een 1 mm oplossing te maken.
- Verdun de fluorescentie tot een uiteindelijke werkconcentratie van 1 μM met behulp van DMEM.
- Voeg de fluorescentie toe aan de celsuspensie en breng zachtjes door met een pipet.
- Inincuberen 20 min bij 36,5 °C, vochtigheid van > 95%, en 5% CO2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De CMS cultuur chip met 6 cm diameter (Figuur 2) werd met succes gemaakt volgens het bovenstaande protocol. Eerst werd de chip afzonderlijk gemaakt van een toplaag en een onderlaag en vervolgens door plasmaverlijming aan elkaar gebonden. Resulterende sferoïden kunnen gemakkelijk worden verzameld door het loskoppelen van de chip. Het kanaal van de CMS cultuur chip bestaat uit een inlaatpoort en centrale, glijbaan en micro well regio's (Figuur 3). De cel-, medium-en pluronische oplossingen worden geïnjecteerd via een inlaatopening met een diameter van 5 mm. De geïnjecteerde cellen worden gelijkmatig verdeeld door resuspensie 3 – 5x in de inlaat haven regio. De cellen worden onderworpen aan centrifugale kracht in het centrale gebied en verspreiden zich naar buiten. Omdat het centrale gebied hoger is dan de micro well, kan het meer media bevatten, waardoor de sferoïden langer kunnen overleven. De hoogte van de titer is 0,4 mm en de hoogte van de centrale regio is 1,5 mm. zuig gaten zijn aanwezig in het midden van de centrale regio om eenvoudig de interne oplossingen te verwijderen. Het diagebied is een glooiend gebied dat de centrale regio en de regio titer verbindt. De cellen bewegen langs een helling van 45 ° en vestigen zich in de micro well-regio, waar de cellen zich vestigen, groeien en in de war zijn om spheroids te vormen. Micro putten gelegen op 14 mm van het midden van de chip zijn halfrylindrical met een hoogte van 400 μm en een diameter van 400 μm. In totaal kunnen er 100 sferoïden gelijktijdig in 100 micro putten worden gegenereerd.
Met behulp van de voorbereide CMS-chip kunnen sferoïden worden gegenereerd in de volgorde die wordt weergegeven in het Protocol (Figuur 4). Monocultuur en cocultuursspheroïden werden gegenereerd met hASC-en MRC-5-cellen. Om een monocultuur spheroid van elk type cel te genereren, werden 5 × 105 hascs of 8 × 105 MRC-5s geïnjecteerd. Het aantal geïnjecteerde cellen was onafhankelijk van de celgrootte. Timelapse-beelden van beide soorten cellen werden genomen bij 2.000 rpm tot dag 3 van de celcultuur (Figuur 5). Cocultuursspheroïden van hASCs en MRC-5s werden ook gegenereerd met concentrische, Janus en sandwich structuren. Om concentrische spheroïden te maken, werden de eerste cellen (2,5 × 105 hascs) geïnjecteerd en werden de tweede cellen (4 × 105 MRC-5s) 3 minuten later geïnjecteerd (Figuur 6a). Toen de eerste cellen werden geïnjecteerd, werden ze U-vormig door de hoge zwaartekracht, en toen de tweede cellen werden geïnjecteerd, verhuisden ze naar het midden van de U-vorm. Na verloop van tijd omcirkelde de eerste U-vormige cellen de tweede cellen en voltooide de concentrische spheroïden. Om Janus spheroids te maken werden de eerste cellen (2,5 × 105 hascs) geïnjecteerd en werden de tweede cellen (4 × 105 MRC-5s) 3 uur later geïnjecteerd (Figuur 6b). Toen het injectie-interval tussen de twee cellen lang was, veranderde de vorm van de eerste cellen van een U-vorm naar een elliptische vorm door celaggregatie. Zodra de tweede cellen werden toegevoegd aan de elliptische vorm van de eerste cellen, werden de Janus sferoïden gegenereerd. In het geval van de sandwich spheroids werden de eerste cellen (1,5 × 105 hascs) geïnjecteerd, werden de tweede cellen (3 × 105 MRC-5s) 3 uur later geïnjecteerd en werden de derde cellen (1,5 × 105 hascs) na een andere 3 h geïnjecteerd (figuur 6c ). Vergelijkbaar met de Janus spheroid, elke cel samengevoegd in een elliptische vorm, en de drie lagen gestapeld om sandwich spheroids te genereren. Ten slotte, om de langetermijnkweek capaciteit van het CMS aan te tonen, werden Hasc's gekweekt, blootgesteld aan hoge zwaartekracht gedurende 7 dagen, gevolgd door een live/dode test die werd uitgevoerd om aan te tonen dat de meeste cellen overleefden (Figuur 7). Ook werden foto's van alle micro putten van het CMS na 3 dagen van MRC-5s teelt genomen om een uitstekende uniformiteit en bolsiteit van sferoïden te tonen (Figuur 8).
Figuur 1: afmetingen van de bovenste en onderste lagen van een CMS cultuur chip. De PC Mold werd gemaakt met behulp van een CNC-machine en gerepliceerd met PDMS om een CMS cultuur chip te maken op basis van de tekening gemaakt door een 3D CAD (computer-aided design) programma. De vier cirkels aan de randen van de bovenste en onderste lagen zijn voor het uitlijnen van de twee lagen. Afmetingen zijn in millimeters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 2: foto's van het CMS-systeem. A) foto's van de voltooide CMS-kweek chip. De diameter van de chip is 6 cm en de diameter van de titer is 400 μm. De getallen boven de micro putjes vertegenwoordigen de individuele aantallen van de micro putjes van 1 tot 100. Deze getallen werden in de mal gegraveerd. Schaalbalk = 400 μm. (B) foto van het gehele CMS-systeem. Het CMS-systeem bestaat uit de CMS-kweek chip, chip houder, DC-motor en roterende platform. CMS-apparaten kunnen de zwaartekracht condities tot 521 x g genereren door middel van rotatiekracht. De chip houder voorkomt scheiding van de CMS cultuur chip door de hoge zwaartekracht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: kanaal componenten van het CMS. (A) Schematische beelden en (B) foto's van een DOORsnede van de CMS-kweek chip. De CMS cultuur chip bestaat uit een inlaatpoort en centrale, glij-en micro well regio's. Omdat de geïnjecteerde cellen niet passeren de barrière bij een rotatiesnelheid van minder dan 1.000 rpm, de barrière helpt bij de resuspensie van de cel en zelfs de verdeling naar de microwell. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: proces van het laden van cellen in de CMS cultuur chip. A) om te voorkomen dat cellen aan de onderzijde van de chip kleven, coat met 2,5 ml van de Pluronic F-127-oplossing bij 4.000 tpm. Wacht een dag totdat de coating wordt aangebracht. B) Verwijder de pluronische oplossing en vul het kanaal in met 2,5 ml van het DMEM-medium. C) Verwijder 100 μl van de DMEM en voeg 100 μL celsuspensie toe. Op dit moment, respenderen 3 – 5x zodat de cellen gelijkmatig worden verdeeld. (D) Verplaats de cellen naar de titer door de chip te roteren en kweek de cellen vervolgens gedurende 3 dagen bij 1.000 tot 2.000 rpm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: timelapse-foto van monocultuur-spheroïden van hASC-en MRC-5-cellen. Cellen werden geteeld voor 24 h bij 2.000 rpm. De spheroid werd gegenereerd binnen 24 h. schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: fluorescentie beelden van cocultuurspheroïden. A) concentrische spheroid-vormen waarin HASC-cellen (groen) de MRC-5-cellen (rood) omringen. B) Janus spheroid-vorm waarbij twee cellen symmetrisch zijn. C) sandwich-spheroid-vorm waarin HASC-lagen worden gestapeld tussen twee MRC-5-lagen. Schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: levende/dode assay van hASC op dag 7. De groene fluorescerende kleur representeert levende cellen en de rode fluorescerende kleur staat voor dode cellen. Schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: MRC-5-sferoïden op dag 3. Een relatief constant aantal cellen voert elke micro well in en Form sferioïden met een relatief constante bolvorm in het CMS-systeem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: oogsten van spheroïden. Gekweekte sferoïden kunnen worden geoogst door de twee lagen van de CMS cultuur chip te verdelen. De twee plasmagebonden lagen kunnen gemakkelijk met de hand worden gescheiden. Vervolgens worden de sferoïden verzameld uit de micro putten in de onderste laag, simpelweg door pipetteren. Schaalbalk = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het CMS is een gesloten systeem waarin alle geïnjecteerde cellen zonder verspilling de titer binnenkomen, wat het efficiënter en zuiniger maakt dan conventionele titer-based spheroid-generatie methoden. In het CMS-systeem wordt de media elke 12 – 24 h vervangen door een zuigopening die is ontworpen om de media in de chip te verwijderen (Figuur 3a). Tijdens het zuig proces van de media worden nauwelijks media uit de titer ontsnapt door de oppervlaktespanning tussen de media en de wand van de micro well. Een gebruiker kan de gevangen media eenvoudig verwijderen door in de buurt van de micro well-regio van de chip met een vinger te drukken, omdat de chip gemaakt van PDMS elastisch en flexibel is. Cellen in de titer blijven stabiel zonder te ontsnappen, zelfs met meerdere media wijzigingen. Om dezelfde kwaliteit van spheroid in alle 100 micro putten te bereiken, mag de rotatie van het apparaat niet excentrisch zijn en moet de chip axisymmetrical zijn. Anders kan een variabel aantal cellen elk goed binnenkomen en kunnen de grootte en vorm van de spheroid verschillen. In het conventionele micro well-systeem, omdat de lucht vaak in de micro put zit, is het noodzakelijk om de luchtbellen te verwijderen. Het CMS-systeem vereist echter niet het ballon verwijderingsproces, omdat de hoge centrifugale kracht die wordt gegenereerd door de rotatie ervoor zorgt dat de media de bubbels duwen en ze uit de micro putten persen.
Het CMS-systeem heeft ook zijn beperkingen in vergelijking met conventionele methoden. Het CMS-systeem vereist een grotere cultuur ruimte (bijv. grote incubator ruimte) omdat het een motor, draaiend platform en een controller omvat, en de totale grootte is ongeveer 100 mm x 100 mm x 150 mm (Figuur 2b). Daarnaast veroorzaakt het een lichte maar aanhoudende trilling. We verwachten dat de miniaturisatie van het systeem (hopelijk vergelijkbaar met de grootte van 6 goed platen) deze problemen zal oplossen.
Opgemerkt moet worden dat de gekweekte sferoïden kunnen worden verzameld door de twee plasmagebonden lagen van het CMS-systeem te scheiden (Figuur 9). De hechting van de twee lagen is sterk genoeg om te voorkomen dat de media tijdens de werking van het systeem lekken. Echter, vanwege het kleine hecht gebied, het is scheidbaar met de hand. De sferoïden kunnen eenvoudig van de onderste laag worden opgevangen door pipetten.
Het CMS-systeem heeft een betere reproduceerbaarheid en productiviteit dan conventionele methoden voor het genereren van spheroid. De conventionele methoden, zoals normale titer of hangende druppel methoden, zijn arbeidsintensieve. In het CMS-systeem is het echter veel gemakkelijker om het aantal sferoïden te verhogen door simpelweg de chip grootte te verhogen. Met dit apparaat is het ook mogelijk om organoïden te genereren die de cultuur van Multicell-types vereisen, wat niet gemakkelijk is in conventionele cultuur methoden. Naast de cellen in deze studie (hASC en MRC-5), kan CMS worden gebruikt voor de productie van spheroid met verschillende andere soorten cellen die spheroids kunnen vormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het basis wetenschaps onderzoeksprogramma (2016R1D1A1B03934418) en het bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) van het NRK, en gefinancierd door de Koreaanse overheid, MSIT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
