Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lab-on-a-CD plattform for generering flercellede tredimensjonal Spheroids

Published: November 7, 2019 doi: 10.3791/60399
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Department of Mechanical Engineering, Graduate School, Chung-Ang University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, Seoul National University

Summary

Vi presenterer en motor drevet sentrifugal mikrovæskebasert innretning som kan dyrke celle spheroids. Ved hjelp av denne enheten, kan spheroids av én eller flere celletyper lett cocultured under høy gravitasjon forhold.

Abstract

En tredimensjonal spheroid cellekultur kan få mer nyttige resultater i celle eksperimenter fordi det kan bedre simulere celle microenvironments av den levende kroppen enn to-dimensjonal cellekultur. I denne studien, fabrikkert vi en elektrisk motor-drevet Lab-on-a-CD (Compact Disc) plattform, kalt en sentrifugal mikrovæskebasert-baserte spheroid (CMS) kultur system, for å lage tredimensjonale (3D) celle spheroids implementere høy sentrifugalkraft. Denne enheten kan variere rotasjonshastighet for å generere tyngdekraft forhold fra 1 x g til 521 x g. CMS-systemet er 6 cm i diameter, har 500 μm microwells, og er laget av molding med Polydimethylsiloxan i en polykarbonat mold forhåndslagde av en datamaskin numerisk kontroll maskin. En barriere vegg ved kanal inngangen til CMS-systemet bruker sentrifugalkraften til å spre celler jevnt inne i brikken. På slutten av kanalen, det er en skyve område det innrømmer cellene å gå inn det microwells. Som en demonstrasjon, spheroids ble generert av monokultur og coculture av menneskelig fett-avledet stamceller og menneskelige lunge fibroblaster under høy gravitasjon forhold ved hjelp av systemet. CMS-systemet brukte en enkel operasjon ordning for å produsere coculture spheroids av ulike strukturer i konsentriske, Janus, og sandwich. CMS-systemet vil være nyttig i cellebiologi og vev engineering studier som krever spheroids og organoid kultur av én eller flere celletyper.

Introduction

Det er lettere å simulere biologisk in vivo microenvironments med tredimensjonal (3D) spheroid cellekultur enn med to-dimensjonale (2D) cellekultur (for eksempel konvensjonelle Petri parabol cellekultur) for å produsere mer fysiologisk realistisk eksperimentell resultater1. Foreløpig tilgjengelig spheroid formasjon metoder inkluderer hengende slipp teknikk2, Liquid-overlay teknikk3, carboxymethyl cellulose teknikk4, magnetisk Force-baserte mikrovæskebasert teknikk5, og bruk av bioreaktorer6. Selv om hver metode har sine egne fordeler, er det nødvendig med ytterligere forbedring i reproduserbarhet, produktivitet og generering av coculture spheroids. For eksempel, mens den magnetiske Force-baserte mikrovæskebasert teknikk5 er relativt billig, effekten av sterke magnetiske felt på levende celler må vurderes nøye. Fordelene med spheroid kultur, spesielt i studiet av mesenchymal stilk cellen differensiering og spredning, er rapportert i flere studier7,8,9.

Sentrifugal mikrovæskebasert systemet, også kjent som Lab-on-a-CD (CD-plate), er nyttig for enkelt å kontrollere væsken inne og utnytte rotasjonen av underlaget og har dermed blitt utnyttet i biomedisinsk applikasjoner som immunanalyser10, fargemetrisk analyse for å oppdage biokjemiske markører11, nukleinsyre acid forsterkning (PCR) analyser, automatiserte blod analyse systemer12og alt-i-ett sentrifugal mikrovæskebasert enheter13. Drivkraften som kontrollerer væsken er den sentripetal kraften som skapes ved rotasjon. Ytterligere, mangfoldig funksjonene av blander, valving, og eksemplar splitting kan gjort bare i denne enkelt CD plattform. Men sammenlignet med de ovenfor nevnte biokjemiske analysemetoder, har det vært færre forsøk å bruke CD-plattformer til kultur celler, spesielt spheroids14.

I denne studien viser vi ytelsen til sentrifugal mikrovæskebasert-baserte spheroid (CMS)-systemet ved monokultur eller coculture av humane fett avledede stamceller (hASC) og humant lunge fibroblaster (MRC-5). Dette dokumentet beskriver i detalj vår gruppes forskningsmetode15. Således, det spheroid kulturen laboratorium-opp på-en-CD plattform kan lett reprodusert. En CMS genererer system bestående av et CMS kultur chip, en chip holder, en DC motor, en motor Mount, og en roterende plattform, er presentert. Motor braketten er 3D trykt med akrylnitril butadien styren (ABS). Chip holder og roterende plattform er CNC (datamaskin numerisk kontroll) bearbeidet med PC (polykarbonat). Rotasjonshastigheten til motoren styres fra 200 til 4 500 RPM ved å kode en PID (proporsjonal-Integral-derivat) algoritme basert på puls-bredde moduleringshjul. Dens dimensjoner er 100 mm x 100 mm x 150 mm og den veier 860 g, noe som gjør det enkelt å håndtere. Ved hjelp av CMS-systemet, kan spheroids genereres under ulike tyngdekraften forhold fra 1 x g til 521 x g, så studiet av celle differensiering forfremmelse under høy gravitasjon kan utvides fra 2D-celler16,17 til 3D spheroid. Coculture av ulike typer celler er også en viktig teknologi for effektivt å etterligne in vivo miljø18. Det CMS system kanne lett utvikle monokultur spheroids, likeledes idet coculture spheroids av forskjellige struktur typer (e.g., konsentrisk, Janus, og sandwich). CMS-systemet kan utnyttes ikke bare i enkle spheroid studier, men også i 3D-organoid studier, for å vurdere menneskelige organ strukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sentrifugal mikrovæskebasert-basert spheroid (CMS) kultur chip fabrikasjon

  1. Lag PC muggsopp for toppen og bunnen lag av CMS kulturen chip av CNC maskinering. Detaljerte dimensjoner av brikken er gitt i figur 1.
  2. Bland PDMS base og PDMS herding agent i forholdet 10:1 (w/w) i 5 min og plasser i en desikator for 1 t for å fjerne luftbobler.
  3. Etter støping av PDMS blandingen i formene av CMS kultur chip, fjerne luftbobler for 1 t mer og kur i et varme kammer ved 80 ° c for 2 t.
  4. Plasser dem i støvsuges plasma renere med overflater som skal bindes vendt opp og utsette dem for luft-assistert plasma ved en effekt på 18 W for 30 s.
  5. Bond de to lagene i CMS kultur chip og legg den i varme kammeret ved 80 ° c i 30 min for å øke vedheft styrke.
  6. Sterilisere CMS kulturen chip i en autoklav steriliseringsapparat ved 121 ° c og 15 PSI.

2. celle forberedelse

  1. Tin 1 mL hetteglasset med 5 × 105– 1 × 106 hASCs eller MRC-5s celler i et vannbad ved 36,5 ° c i 2 min.
  2. Tilsett 1 mL Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) til et hetteglass og bland forsiktig med en 1 000 μL pipette.
  3. Sett 15 mL av DMEM-prewarmed til 36,5 ° c i en 150 mm diameter Petri rett ved hjelp av en pipette og tilsett cellene fra hetteglasset.
  4. Etter 1 dag, aspirer DMEM og Erstatt med 15 mL fersk DMEM. Deretter endrer Media hver 2 eller 3 dager.
  5. For å løsne cellene fra Petri parabolen, tilsett 4 mL Trypsin til Petri retter og plassere dem i en inkubator på 36,5 ° c og 5% CO2 for 4 min.

3. monokultur spheroid formasjon

  1. Putte 2,5 mL av 4% (w/v) pluronic F-127 løsning inn i innløp hull av det CMS kulturen flis (skikkelsen 2a) stund roterer det flis for 500 – 1000 RPM og så dreie det flis for 4 000 RPM for 3 min benytter det CMS system (skikkelsen 2b).
    Merk: det pluronic belegget hindrer celle feste til innløps porten mens brikken roterer. Sørg for at luften ikke er fanget i microwells.
  2. Ruge CMS kultur chip fylt med pluronic løsning over natten på 36,5 ° c i 5% CO2.
  3. Fjern den pluronic løsningen, vask ut den resterende pluronic løsningen med DMEM, og tørk brikken i 12 timer på en ren benk.
  4. Legg 2,5 mL DMEM til CMS kulturen chip og rotere chip på ~ 4 000 RPM for 3 min for prewetting innsiden av brikken.
  5. Stopp rotasjonen og trekk ut 100 μL av DMEM for å gi plass til injeksjonsbruk av celle fjæringen.
  6. Tilsett 100 μL av celle suspensjoner som inneholder enten 5 × 105 hASCs eller 8 × 105 MRC-5s av pipettering jevnt distribuere cellene ved pipettering 3-5x for blanding.
  7. Roter brikken ved 3 000 RPM for 3 min å felle celler i hver mikrotiterplateleser av sentrifugalkraften.
    Merk: overdreven rotasjonshastighet kan føre til celle flukt gjennom løsning utstøting hull.
  8. Kultur cellene i 3 dager i inkubator ved 36,5 ° c, > 95% fuktighet, og 5% CO2, roterende på 1000-2000 RPM. Endre kultur medium hver dag.

4. Coculture spheroid formasjon

  1. Konsentrisk spheroids formasjon
    1. Legg de første cellene, 2,5 × 105 hASCs, og roter chip på 3 000 rpm. Etter 3 min, tilsett andre celler, 4 × 105 MRC-5s, og roter brikken ved 3 000 RPM i 3 min. injiser totalt 100 μL av celle suspensjoner ved pipettering. Når cellene injiseres, Skift rotasjonshastigheten til 500-1000 RPM.
    2. Kultur cellene i inkubator ved 36,5 ° c, > 95% luftfuktighet%, og 5% CO2 ved å rotere på 1000-2000 RPM. De konsentriske spheroids er opprettet innen 24 timer. For lang tids kultur, endre kultur medium hver dag.
  2. Janus spheroid-formasjon
    1. Tilsett 100 μL av celle suspensjoner som inneholder de første cellene, 2,5 × 105 hASCs, ved pipettering mens brikken roterer på 500 – 1000 RPM. Deretter roterer du brikken ved 3 000 RPM i 3 min.
    2. Ruge chip ved 36,5 ° c, > 95% fuktighet, og 5% CO2 ved å rotere ved 1000-2000 RPM for 3 t.
    3. Tilsett 100 μL av celle suspensjoner som inneholder det andre settet med celler, 4 × 105 MRC-5s, ved pipettering mens brikken roterer på 500-1000 RPM. Deretter roterer du brikken ved 3 000 RPM i 3 min.
    4. Kultur cellene i inkubator ved 36,5 ° c, > 95% fuktighet, og 5% CO2 ved å rotere på 1000-2000 RPM. Janus spheroids er opprettet innen 24 timer. For lang tids kultur, endre kultur medium hver dag.
  3. Sandwich spheroid dannelse
    1. Tilsett 100 μL av celle suspensjoner som inneholder de første cellene, 1,5 × 105 hASCs, ved pipettering mens brikken roterer på 500 – 1000 RPM. Deretter roterer du brikken ved 3 000 RPM i 3 min.
    2. Ruge chip ved 36,5 ° c, > 95% fuktighet, og 5% CO2 ved å rotere ved 1000-2000 RPM for 3 t.
    3. Tilsett 100 μL av celle suspensjoner som inneholder de andre cellene, 3 × 105 MRC-5s, ved pipettering mens brikken roterer på 500 – 1000 RPM. Deretter roterer du brikken ved 3 000 RPM i 3 min.
    4. Ruge chip ved 36,5 ° c, > 95% fuktighet%, og 5% CO2 ved å rotere ved 1000-2000 RPM for 3 t.
    5. Tilsett 100 μL av celle suspensjoner som inneholder de tredje cellene, 1,5 × 105 hASCs, ved pipettering mens brikken roterer på 500 – 1000 RPM. Deretter roterer du brikken ved 3 000 RPM i 3 min.
    6. Kultur cellene i inkubator ved 36,5 ° c, > 95% luftfuktighet%, og 5% CO2 ved å rotere på 1000-2000 RPM. Den sandwich spheroids er opprettet innen 12 h. For lang tids kultur, endre kultur medium hver dag.

5. celle farging

  1. Varm celle fluorescens fargestoff til romtemperatur (20 ° c).
  2. Tilsett 20 μL vannfri dimetylsulfoksid (DMSO) per hetteglass for å lage en 1 mM løsning.
  3. Fortynne fluorescens til en endelig arbeids konsentrasjon på 1 μM med DMEM.
  4. Legg fluorescens til celle fjæringen og resuspend forsiktig ved hjelp av en pipette.
  5. Ruge 20 min ved 36,5 ° c, fuktighet på > 95%, og 5% CO2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den 6 cm diameter CMS kultur chip (figur 2) ble vellykket gjort etter ovennevnte protokollen. Først ble brikken laget separat fra et topplag og et nederste lag, og deretter limt sammen av plasma binding. Resulterende spheroids kan enkelt samles ved å løsne chip. Kanalen for CMS kultur chip består av en innløps port og sentrale, slide, og mikrotiterplateleser regioner (Figur 3). Celle-, medium-og pluronic-løsninger injiseres gjennom et innløps hull med en diameter på 5 mm. De innsatte cellene er jevnt fordelt med blanding 3 – 5x i innløps havneområdet. Cellene er utsatt for sentrifugalkraften i den sentrale regionen og spre utover. Fordi den sentrale regionen er høyere enn mikrotiterplateleser, kan den inneholde flere medier, slik at spheroids å overleve lenger. Høyden på mikrotiterplateleser er 0,4 mm og høyden på den sentrale regionen er 1,5 mm. suge hull er til stede i midten av den sentrale regionen for enkelt å fjerne de interne løsningene. Raset regionen er et skrånende område som forbinder den sentrale regionen og mikrotiterplateleser regionen. Cellene beveger seg langs en 45 ° skråning og bosette seg i mikrotiterplateleser regionen, der cellene bosette seg, vokse, og floke å danne spheroids. Microwells ligger 14 mm fra midten av brikken er semicylindrical med en høyde på 400 μm og en diameter på 400 μm. Totalt 100 spheroids kan genereres samtidig i 100 microwells.

Ved hjelp av forberedt CMS chip, spheroids kan genereres i den rekkefølgen som vises i protokollen (Figur 4). Monokultur og coculture spheroids ble generert med hASC og MRC-5 celler. For å generere en monokultur spheroid for hver type celle, ble 5 × 105 hASCs eller 8 × 105 MRC-5s injisert. Antallet celler som ble injisert, var uavhengig av cellestørrelsen. Time-lapse bilder av begge typer celler ble tatt på 2 000 rpm til dag 3 av cellekultur (figur 5). Coculture spheroids av hASCs og MRC-5s ble også generert med konsentriske, Janus og sandwich-strukturer. For å gjøre konsentriske spheroids, ble de første cellene (2,5 × 105 hASCs) injisert, og de andre cellene (4 × 105 MRC-5s) ble injisert 3 minutter senere (figur 6a). Når de første cellene ble injisert, ble de U-formet på grunn av høy gravitasjon, og når de andre cellene ble injisert, flyttet de til midten av U-formen. Over tid, den første U-form celler omkranset de andre cellene og fullførte den konsentriske spheroids. For å gjøre Janus spheroids, ble de første cellene (2,5 × 105 hASCs) injisert, og de andre cellene (4 × 105 MRC-5s) ble injisert 3 timer senere (figur 6b). Når injeksjons intervallet mellom de to cellene var lang, ble formen på de første cellene endret fra en U-form til en elliptisk form ved celle aggregering. Når de andre cellene ble lagt til elliptisk form av de første cellene, ble Janus spheroids generert. I tilfelle av sandwich spheroids, de første cellene (1,5 × 105 hASCs) ble injisert, de andre cellene (3 × 105 MRC-5s) ble injisert 3 t senere, og de tredje cellene (1,5 × 105 hASCs) ble injisert etter en 3 h (figur 6C ). Ligner på Janus spheroid, hver celle aggregert i en elliptisk form, og de tre lagene stablet til å generere sandwich spheroids. Til slutt, for å demonstrere den langsiktige kulturen evnen til CMS, hASCs var kultivert, utsatt for høy gravitasjon i 7 dager etterfulgt av en live/Dead analysen utført for å vise at de fleste cellene overlevde (figur 7). Også bilder av alle microwells av CMS ble tatt etter 3 dager med MRC-5s dyrking å vise utmerket ensartethet og sfærisitet av spheroids (Figur 8).

Figure 1
Figur 1: mål på toppen og bunnen lag av en CMS kultur chip. PC mold ble gjort ved hjelp av en CNC-maskin og kopiert med PDMS å lage en CMS kultur chip basert på tegningen opprettet av en 3D CAD (dataassistert konstruksjon) program. De fire sirklene på kantene av de øverste og nederste lagene er for å samkjøre de to lagene. Dimensjonene er i millimeter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: fotografier av CMS-systemet. (A) bilder av den fullførte CMS kultur chip. Diameteren på brikken er 6 cm og diameteren på mikrotiterplateleser er 400 μm. Tallene over microwells representerer de individuelle tallene til microwells fra 1 til 100. Disse tallene ble gravert inn i mold. Scale bar = 400 μm. (B) fotografi av hele CMS systemet. CMS-systemet består av CMS-kulturen chip, chip holder, DC motor, og roterende plattform. CMS-enheter kan generere tyngdekraft forhold opp til 521 x g gjennom rotasjons kraft. Chip holder hindrer separasjon av CMS kulturen chip på grunn av høy gravitasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kanal komponenter i CMS. (A) skjematisk bilder og (B) fotografier av et tverrsnitt av CMS kultur chip. CMS kultur chip består av en innløps port og sentrale, slide, og mikrotiterplateleser regioner. Fordi injisert cellene ikke passerer gjennom barrieren ved en rotasjonshastighet på mindre enn 1 000 RPM, hjelper barrieren i blanding av cellen og til og med fordeling til mikrotiterplateleser. Scale bar = 2 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: prosessen med å laste celler inn i CMS kultur chip. (A) for å hindre celler fra å stikke til bunnen av brikken, frakk med 2,5 ml av pluronic F-127 løsning på 4 000 rpm. Vent en dag for belegget som skal brukes. (B) Fjern pluronic løsningen og forhåndsutfylle kanalen med 2,5 ml av DMEM medium. (C) Fjern 100 ΜL av DMEM og tilsett 100 μL av celle fjæring. På denne tiden, resuspend 3 – 5x slik at cellene er jevnt fordelt. (D) flytte celler til mikrotiterplateleser ved å rotere brikken, og deretter kultur cellene for 3 dager på 1 000 til 2 000 rpm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: time-lapse fotografi av monokultur spheroids av hASC og MRC-5 celler. Celler ble dyrket i 24 timer ved 2 000 rpm. Spheroid ble generert innen 24 h. Scale bar = 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: fluorescens bilder av coculture spheroids. (A) konsentriske spheroid-figurer der hASC-celler (grønne) omgir MRC-5-celler (rød). (B) Janus spheroid-figur der to celler er symmetriske. (C) sandwich spheroid form der hASC-lag er stablet mellom to MRC-5-lag. Scale bar = 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Live/Dead-analysen av hASC på dag 7. Den grønne fluorescerende fargen representerer levende celler og den røde fluorescerende fargen representerer døde celler. Scale bar = 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: MRC-5-spheroids på dag 3. Et relativt konstant antall celler inn hver mikrotiterplateleser og form spheroids har relativt konstant sfærisitet i CMS systemet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: høsting spheroids. Kultivert spheroids kan høstes ved å dele de to lagene i CMS kulturen chip. De to plasma-limt lag kan lett skilles for hånd. Da spheroids er Hentet fra microwells i det nederste laget ganske enkelt ved pipettering. Scale bar = 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CMS er et lukket system der alle injisert celler inn i mikrotiterplateleser uten avfall, noe som gjør den mer effektiv og økonomisk enn konvensjonelle mikrotiterplateleser-baserte spheroid generasjon metoder. I CMS-systemet erstattes mediene hver 12 – 24 h gjennom et suge hull som er utformet for å fjerne mediene i brikken (figur 3a). Under Media suge prosessen, unnslipper knapt noen medier fra innsiden av mikrotiterplateleser på grunn av overflatespenningen mellom mediene og veggen av mikrotiterplateleser. En bruker kan enkelt fjerne de fanget mediene ved å trykke nær mikrotiterplateleser regionen av brikken med en finger, fordi brikken laget av PDMS er elastisk og fleksibel. Celler i mikrotiterplateleser forblir stabile uten å unnslippe, selv med flere medie endringer. For å oppnå den samme kvaliteten på spheroid i alle 100 microwells, bør rotasjonen av anordningen ikke være eksentrisk, og brikken skal være axisymmetrical. Ellers kan et variabelt antall celler komme inn i hver brønn, og størrelsen og formen på spheroid kan avvike. I det konvensjonelle mikrotiterplateleser systemet, fordi luften er ofte fanget i mikrotiterplateleser, er det nødvendig å fjerne luftbobler. Imidlertid ikke CMS systemet ikke krever boble fjerning prosessen fordi den høye sentrifugalkraften generert av rotasjon fører til at mediene til å skyve bobler og klem dem ut fra microwells.

CMS-systemet har også sine begrensninger i forhold til konvensjonelle metoder. CMS systemet krever en større kultur plass (f. eks stor inkubator plass) som det består av en motor, roterende plattform, og en kontroller, og den totale størrelsen er ca 100 mm x 100 mm x 150 mm (figur 2b). I tillegg fører det til en liten, men vedvarende vibrasjon. Vi forventer at miniatyrisering av systemet (forhåpentligvis ligner på størrelse med 6 brønn plater) vil løse disse problemene.

Det bør bemerkes at den kultivert spheroids kan samles inn ved å skille de to plasma-limt lag av CMS-systemet (figur 9). Bindingen av de to lagene er sterk nok til å hindre at mediet lekker under systemdrift. Men på grunn av den lille bonding området, er det separable for hånd. Spheroids kan enkelt hentes fra det nederste laget av pipettering.

CMS-systemet har bedre reproduserbarhet og produktivitet enn konvensjonelle metoder for spheroid generasjon. De konvensjonelle metodene, som normal mikrotiterplateleser eller hengende dråpe metoder, er arbeidskrevende. Men i CMS-systemet, er det mye lettere å øke antall spheroids ved å øke chip størrelse. Med denne enheten, er det også mulig å generere organoids som krever kultur av multicell typer, som ikke er lett å gjøre i konvensjonelle kultur metoder. I tillegg til cellene i denne studien (hASC og MRC-5), kan CMS brukes til spheroid produksjon ved hjelp av ulike andre typer celler som kan danne spheroids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research program (2016R1D1A1B03934418) og bio & Medical Technology Development program (2018M3A9H1023141) av NRF, og finansiert av den koreanske regjeringen, MSIT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  3. Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
  4. Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
  5. Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
  6. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  7. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  8. Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
  9. Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
  10. Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
  11. Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
  12. Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
  13. Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
  14. Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
  15. Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
  16. Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
  17. Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
  18. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).

Tags

Bioteknologi 3D-spheroid sentrifugal mikrovæskebasert systemer Lab-on-a-CD sentrifugalkraft hypergravity celle aggregering
Lab-on-a-CD plattform for generering flercellede tredimensjonal Spheroids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee,… More

Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter