Summary
Vi presenterar en motordriven centrifugal mikroflödessystem enhet som kan odla cellspheroids. Med hjälp av denna enhet, spheroids av enstaka eller flera celltyper kan lätt coculodlas under hög gravitation villkor.
Abstract
En tredimensionell sfäroid cellkultur kan få mer användbara resultat i cell experiment eftersom det kan bättre simulera cell mikromiljöer i den levande kroppen än tvådimensionell cellkultur. I denna studie, vi fabricerade en elektrisk motor driven Lab-på-en-CD (Compact Disc) plattform, kallad en centrifugal microfluidic-baserade sfäroid (CMS) kultur system, att skapa tredimensionella (3D) cell spheroids genomföra hög centrifugalkraft. Denna enhet kan variera rotationshastigheter för att generera gravitation villkor från 1 x g till 521 x g. CMS-systemet är 6 cm i diameter, har 500 μm mikrobrunnar, och görs genom gjutning med Polydimetylsiloxan i en polykarbonat mögel premade av en dator numerisk kontroll maskin. En barriär vägg vid kanal ingången i CMS-systemet använder centrifugalkraft för att sprida celler jämnt inuti chipet. I slutet av kanalen finns en bild region som gör att cellerna kan komma in i mikrobrunnarna. Som en demonstration, spheroids genererades av monokultur och samodling av mänskliga adipose-härledda stamceller och mänskliga lung fibroblaster under hög gravitation villkor med hjälp av systemet. CMS-systemet används ett enkelt operativsystem för att producera coculture spheroids av olika strukturer av Concentric, Janus och Sandwich. CMS-systemet kommer att vara användbart i cellbiologi och vävnadstekniska studier som kräver spheroids och Organoid kultur av en eller flera celltyper.
Introduction
Det är lättare att simulera biologiska in vivo mikromiljöer med tredimensionell (3D) sfäroid cellkultur än med två-dimensionell (2D) cellkultur (t. ex. konventionell petriskål cellkultur) för att producera mer fysiologiskt realistiska experimentella resultat1. För närvarande tillgängliga sfäroid formation metoder inkluderar hängande droppe teknik2, vätska-overlay teknik3, karboxymetyl cellulosa teknik4, magnetisk kraft-baserade mikroflödessystem teknik5, och användning av bioreaktorer6. Även om varje metod har sina egna fördelar, ytterligare förbättring av reproducerbarhet, produktivitet, och generera coculture spheroids är nödvändigt. Till exempel, medan den magnetiska kraft-baserade mikroflödessystem teknik5 är relativt billigt, effekterna av starka magnetfält på levande celler måste noga övervägas. Fördelarna med sfäroid kultur, särskilt i studiet av mesenkymala stamceller differentiering och proliferation, har rapporterats i flera studier7,8,9.
Den centrifugal mikroflödessystem system, även känd som Lab-on-a-CD (Compact Disc), är användbart för att enkelt kontrollera vätskan inuti och utnyttja rotation av substratet och har därmed utnyttjats i biomedicinska tillämpningar såsom immunanalyser10, kolorimetriska analyser för detektion av biokemiska markörer11, test av nukleinsyramplifiering (PCR), automatiserade blodanalys system12, och allt-i-ett centrifugalmikrofluidiska enheter13. Den drivande kraften som styr vätskan är den centripetala kraft som skapas genom rotation. Dessutom kan flera funktioner för blandning, valving, och prov uppdelning göras helt enkelt i denna enda CD-plattform. Jämfört med de ovan nämnda biokemiska analysmetoderna har det dock förekommit färre försök att använda CD-plattformar för att odla celler, särskilt spheroids14.
I denna studie visar vi prestanda för centrifugalmikrofluidic-baserade sfäroid (CMS) system genom monokultur eller samodling av mänskliga adipose härledda stamceller (hASC) och mänskliga lung fibroblaster (MRC-5). Denna uppsats beskriver i detalj vår grupps forskningsmetodik15. Således kan sfäroid Culture Lab-on-a-CD-plattformen enkelt återges. Ett CMS-system bestående av ett CMS-kulturchip, en chip-hållare, en likströmsmotor, ett motor fäste och en roterande plattform presenteras. Motor fästet är 3D-tryckt med akrylnitril-butadienstyren (ABS). Chip hållaren och roterande plattform är CNC (Computer numerisk kontroll) bearbetas med PC (polykarbonat). Motorns rotationshastighet styrs från 200 till 4 500 rpm genom kodning av en PID-algoritm (proportionell-integral-derivata) baserad på pulsbredd modulering. Dess mått är 100 mm x 100 mm x 150 mm och den väger 860 g, vilket gör den lätt att hantera. Använda CMS-systemet, spheroids kan genereras under olika gravitation villkor från 1 x g till 521 x g, så studiet av celldifferentiering befordran under hög gravitation kan förlängas från 2D-celler16,17 till 3D sfäroid. Samodling av olika typer av celler är också en viktig teknik för att effektivt imitera in vivo miljö18. CMS-systemet kan enkelt generera monokultur spheroids, liksom samodling spheroids av olika struktur typer (t. ex., Concentric, Janus, och Sandwich). CMS-systemet kan utnyttjas inte bara i enkla sfäroid studier utan även i 3D Organoid studier, att överväga mänskliga organ strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. centrifugal microfluidic-baserade sfäroid (CMS) kultur chip Fabrication
- Gör PC formar för de övre och nedre lagren av CMS kultur chip genom CNC-bearbetning. Detaljerade mått på chippet anges i figur 1.
- Blanda PDMS Base och PDMS härdning agent vid ett förhållande av 10:1 (w/w) för 5 min och placera i en exsickator för 1 h för att ta bort luftbubblor.
- Efter hälla PDMS blandningen i formar av CMS kultur chip, ta bort luftbubblor för 1 h mer och bota i en värme kammare vid 80 ° c för 2 h.
- Placera dem i dammsugaren plasma renare med de ytor som ska limmas uppåt och utsätta dem för luft-Assisted plasma vid en effekt av 18 W för 30 s.
- Bond de två lagren av CMS kultur chip och placera den i värme kammaren vid 80 ° c i 30 min för att öka vidhäftning styrka.
- Sterilisera CMS kultur chip i en autoklav autoklav vid 121 ° c och 15 psi.
2. cell beredning
- Tina 1 mL av injektionsflaskan som innehåller 5 × 105– 1 × 106 hascs eller MRC-5s-celler i ett vattenbad vid 36,5 ° c i 2 minuter.
- Tillsätt 1 mL av Dulbecco ' s modifierade Eagle medium (DMEM) till en injektionsflaska och blanda försiktigt med en 1 000 μL pipett.
- Sätt 15 mL av DMEM förvärmas till 36,5 ° c i en petriskål med en diameter på 150 mm med hjälp av en pipett och tillsätt cellerna från injektionsflaskan.
- Efter 1 dag, aspirera DMEM och Ersätt med 15 mL färsk DMEM. Därefter, ändra Media varje 2 eller 3 dagar.
- För att lossa cellerna från petriskål, tillsätt 4 mL trypsin till Petriskålarna och placera dem i en inkubator vid 36,5 ° c och 5% CO2 för 4 min.
3. monokultur sfäroid formation
- Sätt 2,5 mL 4% (w/v) Pluronic F-127 lösning i inlopps hålet i CMS kultur chip (figur 2A) medan rotera chip vid 500-1000 rpm och sedan rotera chip på 4 000 RPM för 3 min med hjälp av CMS-systemet (figur 2b).
Anmärkning: den pluroniska beläggningen förhindrar att cellen fäster vid inlopps porten medan spånan roterar. Se till att luften inte fastnar i mikrobrunnarna. - Inkubera CMS kultur chip fylld med Pluronic lösning över natten vid 36,5 ° c i 5% CO2.
- Ta bort den pluroniska lösningen, tvätta ur den kvarvarande pluroniska lösningen med DMEM och torka chippet i 12 timmar på en ren bänk.
- Tillsätt 2,5 mL av DMEM till CMS kultur chip och rotera chip på ~ 4 000 RPM för 3 min för fuktning insidan av chip.
- Stoppa rotationen och dra ut 100 μL av DMEM för att göra plats för injicering av cellsuspensionen.
- Tillsätt 100 μL cellsuspensioner som innehåller antingen 5 × 105 hascs eller 8 × 105 MRC-5s genom att Pipettera jämnt fördela cellerna genom att Pipettera 3 – 5x för resuspension.
- Rotera chip på 3 000 RPM för 3 min att fälla celler i varje mikrobrunn med centrifugalkraft.
Obs: överdriven rotationshastighet kan orsaka cell flykt genom lösningens ejektionshål. - Odla cellerna i 3 dagar i inkubatorn vid 36,5 ° c, > 95% luftfuktighet och 5% CO2, roterande vid 1000 – 2000 rpm. Byt kultur medium varje dag.
4. samodling sfäroid formation
-
Koncentriska spheroids bildas
- Tillsätt de första cellerna, 2,5 × 105 hascs, och rotera chip på 3 000 RPM. Efter 3 min, tillsätt de andra cellerna, 4 × 105 MRC-5s, och rotera chip på 3 000 rpm i 3 min. injicera totalt 100 μl cellsuspensioner genom pipettering. När cellerna injiceras, flytta rotationshastigheten till 500-1000 rpm.
- Odla cellerna i inkubatorn vid 36,5 ° c, > 95% luftfuktighet% och 5% CO2 genom att rotera vid 1000 – 2000 rpm. De koncentriska spheroiderna skapas inom 24 timmar. För långsiktig kultur, ändra kultur mediet varje dag.
-
Janus sfäroid formation
- Tillsätt 100 μL cellsuspensioner som innehåller de första cellerna, 2,5 × 105 hascs, genom pipettering medan spånan roterar vid 500 – 1000 rpm. Rotera sedan chippet på 3 000 rpm i 3 minuter.
- Inkubera chippet vid 36,5 ° c, > 95% luftfuktighet och 5% CO2 genom att rotera vid 1000 – 2000 rpm i 3 timmar.
- Tillsätt 100 μL av de cellsuspensioner som innehåller den andra uppsättningen celler, 4 × 105 MRC-5s, genom pipettering medan spånan roterar vid 500 – 1000 rpm. Rotera sedan chippet på 3 000 rpm i 3 minuter.
- Odla cellerna i inkubatorn vid 36,5 ° c, > 95% luftfuktighet och 5% CO2 genom att rotera vid 1000 – 2000 rpm. Janus spheroids skapas inom 24 h. För långsiktig kultur, ändra kultur mediet varje dag.
-
Smörgås sfäroid formation
- Tillsätt 100 μL cellsuspensioner som innehåller de första cellerna, 1,5 × 105 hascs, genom pipettering medan spånan roterar vid 500 – 1000 rpm. Rotera sedan chippet på 3 000 rpm i 3 minuter.
- Inkubera chippet vid 36,5 ° c, > 95% luftfuktighet och 5% CO2 genom att rotera vid 1000 – 2000 rpm i 3 timmar.
- Tillsätt 100 μL cellsuspensioner som innehåller de andra cellerna, 3 × 105 MRC-5s, genom pipettering medan spånan roterar vid 500 – 1000 rpm. Rotera sedan chippet på 3 000 rpm i 3 minuter.
- Inkubera chippet vid 36,5 ° c, > 95% luftfuktighet% och 5% CO2 genom att rotera vid 1000 – 2000 rpm i 3 timmar.
- Tillsätt 100 μL cellsuspensioner som innehåller de tredje cellerna, 1,5 × 105 hascs, genom pipettering medan spånan roterar vid 500 – 1000 rpm. Rotera sedan chippet på 3 000 rpm i 3 minuter.
- Odla cellerna i inkubatorn vid 36,5 ° c, > 95% luftfuktighet% och 5% CO2 genom att rotera vid 1000 – 2000 rpm. Smörgås spheroids skapas inom 12 h. För långsiktig kultur, ändra kultur mediet varje dag.
5. cell färgning
- Värm cellfluorescensfärgen till rumstemperatur (20 ° c).
- Tillsätt 20 μL vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO) per injektionsflaska för att få en 1 mM lösning.
- Späd fluorescensen till en slutlig arbets koncentration på 1 μM med DMEM.
- Tillsätt fluorescensen till cellsuspensionen och Omsuspendera försiktigt med hjälp av en pipett.
- Inkubera 20 min vid 36,5 ° c, luftfuktighet på > 95% och 5% CO2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den 6 cm diameter CMS kultur chip (figur 2) gjordes framgångsrikt efter ovanstående protokoll. Först, chip gjordes separat från ett toppskikt och ett bottenskikt och sedan limmas samman av plasma bindning. Resulterande spheroids kan enkelt samlas in genom att lossa chippet. Kanalen för CMS-kulturchip består av en inloppsport och en central-, glid-och mikrobrunn-region (figur 3). Cell-, medium-och pluroniska lösningar injiceras genom ett inloppshål med en diameter på 5 mm. De injicerade cellerna fördelas jämnt genom resuspension 3 – 5x i inloppsport regionen. Cellerna utsätts för centrifugalkraften i den centrala regionen och sprids utåt. Eftersom den centrala regionen är högre än mikrobrunn, kan den innehålla mer media, vilket gör att sfäoiderna att överleva längre. Mikroborrens höjd är 0,4 mm och höjden på den centrala regionen är 1,5 mm. sug hålen är närvarande i mitten av den centrala regionen för att enkelt ta bort de interna lösningarna. Bild regionen är ett sluttande område som förbinder den centrala regionen och regionen mikrobrunn. Cellerna rör sig längs en 45 ° lutning och bosätta sig i mikrobrunn regionen, där cellerna bosätta sig, växa och trassel till form spheroids. Mikrobrunnar som ligger 14 mm från chippet centrum är semicylindriska med en höjd av 400 μm och en diameter på 400 μm. Totalt 100 spheroids kan genereras samtidigt i 100 mikrobrunnar.
Med hjälp av det förberedda CMS-chip kan spheroids genereras i den ordning som anges i protokollet (figur 4). Monokultur och samodling spheroids genererades med hASC och MRC-5 celler. För att generera en monokultur sfäroid av varje typ av cell, 5 × 105 hascs eller 8 × 105 MRC-5s injicerades. Antalet injicerade celler var oberoende av cellstorleken. Tids fördröjnings bilder av båda typerna av celler togs vid 2 000 RPM till dag 3 i cellkulturen (figur 5). Samodling spheroids av hASCs och MRC-5s genererades också med koncentriska, Janus, och Sandwich strukturer. För att göra koncentriska spheroids injicerades de första cellerna (2,5 × 105 hascs) och de andra cellerna (4 × 105 MRC-5s) injicerades 3 min senare (figur 6a). När de första cellerna injicerades, de blev U-formade på grund av hög gravitation, och när de andra cellerna injicerades, de flyttade till mitten av U-form. Med tiden, de första U-formade celler omringade de andra cellerna och avslutade koncentriska spheroids. För att göra Janus spheroids, de första cellerna (2,5 × 105 hascs) injicerades, och de andra cellerna (4 × 105 MRC-5s) injicerades 3 h senare (figur 6b). När injektions intervallet mellan de två cellerna var långt ändrades formen på de första cellerna från en U-form till en elliptisk form genom cell aggregering. När de andra cellerna lades till elliptiska formen av de första cellerna, Januspheroids genererades. När det gäller smörgås spheroids, de första cellerna (1,5 × 105 hascs) injicerades, de andra cellerna (3 × 105 MRC-5s) injicerades 3 h senare, och de tredje cellerna (1,5 × 105 hascs) injicerades efter ytterligare 3 h (figur 6c ). Liknar den Janus sfäroid, varje cell aggregeras till en elliptisk form, och de tre lagren staplade för att generera smörgås spheroids. Slutligen, för att visa den långsiktiga kulturen kapacitet CMS, hASCs var odlade, utsätts för hög gravitation för 7 dagar följt av en levande/död analys utförs för att visa att de flesta celler överlevde (figur 7). Också, bilder av alla mikrobrunnar av CMS togs efter 3 dagar MRC-5s odling för att Visa Utmärkt enhetlighet och sfäricitet spheroids (figur 8).
Figur 1: dimensionerna för de övre och undre lagren i ett CMS-kulturchip. PC mögel gjordes med hjälp av en CNC-maskin och replikeras med PDMS att göra ett CMS kultur chip baserat på ritningen som skapats av en 3D CAD (datorstödd design) program. De fyra cirklarna vid kanterna av de övre och nedre lagren är för att justera de två lagren. Måtten är i millimeter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fotografier av CMS-systemet. (A) fotografier av det färdiga CMS-kulturchipet. Diametern på chip är 6 cm och diametern på mikrobrunn är 400 μm. Numrerar ovanför mikrobrunnarna föreställer individ numrerar av microbrunnarna från 1 till 100. Dessa siffror var graverade i mögel. Skalstapel = 400 μm. (B) fotografi av hela CMS-systemet. CMS-systemet består av CMS-kulturchip, chip-hållare, likströmsmotor och roterande plattform. CMS-enheter kan generera gravitations förhållanden upp till 521 x g genom rotations kraft. Chip hållaren förhindrar separation av CMS kultur chip på grund av hög gravitation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CMS-kanalens kanalkomponenter. (A) schematiska bilder och (B) fotografier av ett tvärsnitt av CMS kultur chip. CMS kultur chip består av en inloppsport och Central, Slide, och mikrobrunn regioner. Eftersom de injicerade cellerna inte passerar genom barriären vid en rotationshastighet på mindre än 1 000 rpm, hjälper barriären i resuspension av cellen och även distribution till microwell. Scale bar = 2 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: processen att ladda celler i CMS kultur chip. (A) för att förhindra att celler fastnar längst ner på chipet, täck med 2,5 ml av Pluronic F-127 lösning vid 4 000 RPM. Vänta en dag för att beläggningen ska appliceras. (B) ta bort den pluroniska lösningen och förfyll kanalen med 2,5 ml av DMEM-mediet. Cta bort 100 μl av DMEM och tillsätt 100 μl cellsuspension. Vid denna tid, Omsuspendera 3 – 5x så att cellerna fördelas jämnt. (D) flytta cellerna till mikrobrunn genom att rotera chip, och sedan odla cellerna i 3 dagar vid 1 000 till 2 000 RPM. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: fotografi av monokulturspheroids av hASC-och MRC-5-celler. Celler odlades för 24 h vid 2 000 RPM. Sfäroid genererades inom 24 h. Scale bar = 400 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: fluorescens-bilder av samkulturspheroids. (A) koncentriska sfäroid-former där HASC-celler (gröna) omger MRC-5-celler (röd). (B) Janus sfäroid form där två celler är symmetriska. (C) smörgås sfäroid form där HASC skikt staplas mellan två MRC-5 skikt. Skalstapel = 400 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: levande/död analys av hASC på dag 7. Den gröna fluorescerande färgen representerar levande celler och den röda fluorescerande färgen representerar döda celler. Skalstapel = 400 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: spheroids MRC-5 på dag 3. Ett relativt konstant antal celler in varje mikrobrunn och form spheroids har relativt konstant sfäriskt i CMS-systemet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: skörd spheroids. Odlade spheroids kan skördas genom att dividera de två lagren av CMS kultur chip. De två plasmabundna lagren kan lätt separeras för hand. Då spheroiderna samlas in från mikrobrunnarna i bottenskiktet helt enkelt genom pipettering. Skalstapel = 400 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CMS är ett slutet system där alla injicerade celler in i mikrobrunn utan avfall, vilket gör det mer effektivt och ekonomiskt än konventionella mikrobrunn-baserade sfäroid generation metoder. I CMS-systemet byts Media varje 12 – 24 h genom ett sughål som är utformat för att ta bort materialet i chippet (figur 3a). Under Media sug processen, knappt någon Media flyr inifrån mikrobrunn på grund av ytspänningen mellan media och väggen i mikrobrunn. En användare kan enkelt ta bort fångade Media genom att trycka nära mikrobrunn regionen av chip med ett finger, eftersom chip gjorda av PDMS är elastisk och flexibel. Cellerna i mikrobrunnen förblir stabila utan att fly, även med flera Media förändringar. För att uppnå samma kvalitet sfäroid i alla 100 mikrobrunnar, rotation av anordningen bör inte vara excentrisk, och chippet bör vara axisymmetriska. I annat fall kan ett varierande antal celler komma in i varje brunn och spheroidets storlek och form kan skilja sig åt. I det konventionella mikrobrunn systemet, eftersom luften är ofta fångade i mikrobrunn, är det nödvändigt att ta bort luftbubblor. Men CMS-systemet kräver inte processen Bubble Removal eftersom den höga centrifugalkraften som genereras av rotationen gör att medierna att driva bubblor och pressa ut dem från mikrobrunnarna.
CMS-systemet har också sina begränsningar jämfört med konventionella metoder. CMS-systemet kräver ett större odlingsutrymme (t. ex. stort inkubatorutrymme) eftersom det omfattar en motor, roterande plattform och en styrenhet, och dess totala storlek är cirka 100 mm x 100 mm x 150 mm (figur 2b). Dessutom orsakar det en liten men ihållande vibrationer. Vi förväntar oss att miniatyriseringen av systemet (förhoppningsvis liknar storleken på 6 bra tallrikar) kommer att lösa dessa frågor.
Det bör noteras att de odlade spheroiderna kan samlas in genom att separera de två plasmabundna lagren i CMS-systemet (figur 9). Limning av de två lagren är tillräckligt stark för att förhindra att Media läcker under systemdrift. Men på grund av den lilla limning område, är det separerbar för hand. Spheroids kan enkelt samlas in från bottenlagret genom pipettering.
CMS-systemet har bättre reproducerbarhet och produktivitet än konventionella metoder för sfäroid generation. De konventionella metoderna, såsom normala mikrobrunn eller hängande dropp metoder, är arbetsintensiva. Men i CMS-systemet, är det mycket lättare att öka antalet spheroids genom att helt enkelt öka marker storlek. Med denna enhet, det är också möjligt att generera organoider som kräver kultur av multicell typer, som inte är lätt att göra i konventionella kultur metoder. Förutom cellerna i denna studie (hASC och MRC-5), CMS kan användas för sfäroid produktion med hjälp av olika andra typer av celler som kan bilda spheroids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Basic Science Research program (2016R1D1A1B03934418) och bio & medicinsk teknik Development program (2018M3A9H1023141) av NRF, och finansieras av den koreanska regeringen, MSIT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
