Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

Published: November 7, 2019 doi: 10.3791/60399
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Department of Mechanical Engineering, Graduate School, Chung-Ang University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, Seoul National University

Summary

Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.

Abstract

Üç boyutlu küresel hücre kültürü hücre deneylerinde daha yararlı sonuçlar elde edebilir çünkü canlı vücudun hücre mikro ortamlarını iki boyutlu hücre kültüründen daha iyi simüle edebilir. Bu çalışmada, yüksek santrifüj kuvvet uygulayan üç boyutlu (3D) hücre küreselleri oluşturmak için santrifüj mikroakışkan tabanlı küresel (CMS) kültür sistemi adı verilen, motorlu laboratuvar-on-a-CD (kompakt disk) platformu imal ettik. Bu cihaz 1 x g ile 521 x garasında yerçekimi koşulları oluşturmak için dönüş hızlarını değiştirebilirsiniz. CMS sistemi 6 cm çapında, yüz 400 μm mikrowells vardır ve bir bilgisayar sayısal kontrol makinesi tarafından önceden yapılmış bir polikarbonat kalıp polidimethylsiloxane ile kalıplama tarafından yapılır. CMS sisteminin kanal girişindeki bir bariyer duvarı, çipin içindeki hücreleri eşit olarak yaymak için santrifüj kuvveti kullanır. Kanalın sonunda, hücrelerin mikrokuyulara girmesini sağlayan bir slayt bölgesi vardır. Bir gösteri olarak, küresel ler sistemi kullanarak yüksek yerçekimi koşulları altında insan yağ kaynaklı kök hücre ve insan akciğer fibroblastlarının monokültür ve coculture tarafından üretildi. CMS sistemi, konsantrik, Janus ve sandviçin çeşitli yapılarının ortak kültür spheroidlerini üretmek için basit bir operasyon şeması kullansın. CMS sistemi, tek veya birden fazla hücre tipinin küresel ve organoid kültürünü gerektiren hücre biyolojisi ve doku mühendisliği çalışmalarında yararlı olacaktır.

Introduction

Biyolojik in vivo mikroortamları üç boyutlu (3D) küresel hücre kültürüne sahip simüle etmek, fizyolojik olarak daha gerçekçi deneysel üretmek için iki boyutlu (2D) hücre kültürüne (örn. geleneksel Petri kabı hücre kültürü) göre daha kolaydır. sonuçlar1. Şu anda mevcut küresel oluşum yöntemleri asma damla tekniği2dahil , sıvı-bindirme tekniği3, karboksimetil selüloz tekniği4, manyetik kuvvet tabanlı mikroakışkan tekniği5, ve kullanımı biyoreaktörler6. Her yöntemin kendine has yararları olmasına rağmen, tekrarlanabilirlik, üretkenlik ve kokültür spheroidlerinin üretilmesinde daha fazla iyileşme gereklidir. Örneğin, manyetik kuvvet tabanlı mikroakışkan teknik5 nispeten ucuz olmakla birlikte, güçlü manyetik alanların canlı hücreler üzerindeki etkileri dikkatle düşünülmelidir. Mezenkimal kök hücre farklılaşması ve çoğalması çalışmalarında özellikle sferoid kültürün yararları, çeşitli çalışmalarda bildirilmiştir7,8,9.

Santrifüj mikroakışkan sistem, aynı zamanda lab-on-a-CD (kompakt disk) olarak bilinen, kolayca içinde sıvı kontrol etmek ve substrat rotasyon istismar için yararlıdır ve böylece immünoassays10gibi biyomedikal uygulamalarda kullanılmıştır , biyokimyasal belirteçleri tespit etmek için kolorimetrik tahliller11, nükleik asit amplifikasyon (PCR) tahlilleri, otomatik kan analiz sistemleri12, ve all-in-one santrifüj mikroakışkan cihazlar13. Sıvıyı kontrol eden itici güç, rotasyontarafından oluşturulan merkezcil kuvvettir. Ayrıca, karıştırma, değerleme ve örnek bölme birden fazla işlevleri sadece bu tek CD platformu yapılabilir. Ancak, yukarıda bahsedilen biyokimyasal analiz yöntemleri ile karşılaştırıldığında, kültür hücrelerine CD platformları uygulayarak daha az çalışma olmuştur, özellikle küresel ler14.

Bu çalışmada santrifüj mikroakışkan esaslı küresel (CMS) sisteminin insan yağkaynaklı kök hücrelerin (hASC) ve insan akciğer fibroblastlarının monokültür veya kokültür ile performansını gösterdik (MRC-5). Bu yazı, grubumuzun araştırma metodolojisi15'iayrıntılı olarak açıklamaktadır. Böylece, küresel kültür lab-on-a-CD platformu kolayca çoğaltılabilir. CMS kültür çipi, yonga tutucu, DC motor, motor montaj ve dönen bir platformdan oluşan bir CMS üretim sistemi sunulmaktadır. Motor montaj akrilonitril bütadien stiren (ABS) ile basılmış 3D. Talaş tutucu ve dönen platform PC (polikarbonat) ile işlenmiş CNC (bilgisayar sayısal kontrol) vardır. Motorun dönüş hızı, darbe genişliği modülasyonuna dayalı bir PID (orantılı-integral-türevi) algoritması kodlayarak 200 ile 4.500 rpm arasında kontrol edilir. Boyutları 100 mm x 100 mm x 150 mm olup 860 g ağırlığındadır ve kullanımı kolaydır. CMS sistemi kullanılarak, küresel ler çeşitli yerçekimi koşulları altında oluşturulabilir 1 x g 521 x g,böylece yüksek yerçekimi altında hücre farklılaşma promosyon çalışma 2D hücrelerden uzatılabilir16,17 için 3D küresel. Çeşitli hücre türlerinin coculture da etkili in vivo ortamda taklit etmek için önemli birteknolojidir 18. CMS sistemi kolayca monokültür spheroids üretebilir, yanı sıra çeşitli yapı türlerinin coculture sheroids (örneğin, konsantrik, Janus, ve sandviç). CMS sistemi sadece basit küresel çalışmalarda değil, aynı zamanda 3Boyutlu organoid çalışmalarda, insan organ yapılarını göz önünde bulundurmak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Santrifüj mikroakışkan esaslı küresel (CMS) kültür çipi imalatı

  1. CNC işleme ile CMS kültür yongasının üst ve alt katmanları için PC kalıpları yapın. Çipin ayrıntılı boyutları Şekil 1'deverilmiştir.
  2. 5 dakika için 10:1 (w/w) oranında PDMS tabanını ve PDMS kür leme maddesini karıştırın ve hava kabarcıklarını temizlemek için 1 saat boyunca kurutucuya yerleştirin.
  3. CMS kültür çipkalıpiçine PDMS karışımı döktükten sonra, 1 saat daha fazla hava kabarcıkları kaldırmak ve 2 saat için 80 °C'de bir ısı odasında tedavi.
  4. Yüzeylere bakacak şekilde vakumlanmış plazma temizleyicisine yerleştirin ve 30 s için 18 W güçte hava destekli plazmaya maruz bırakın.
  5. CMS kültür çipinin iki tabakasını bağlayıp yapışma gücünü artırmak için 80 °C'de 30 dk ısı haznesine yerleştirin.
  6. CMS kültür çipini 121 °C ve 15 psi'de otoklav sterilizatörde sterilize edin.

2. Hücre hazırlama

  1. 5 × 105–1 × 106 hASCveya MRC-5s hücrelerini içeren şişenin 1 mL'ini 36,5 °C'de 2 dk su banyosunda eritin.
  2. Bir şişeye 1 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM) ekleyin ve 1.000 μL'lik pipetle hafifçe karıştırın.
  3. DMEM'in 15 mL'ini 36,5 °C'ye kadar önceden ısıtılmış bir pipet kullanarak 150 mm çapındaki Petri kabına koyun ve şişedeki hücreleri ekleyin.
  4. 1 gün sonra DMEM'i aspire edin ve 15 mL taze DMEM ile değiştirin. Daha sonra, her 2 veya 3 günde bir ortamı değiştirin.
  5. Hücreleri Petri kabından ayırmak için Petri tabaklarına 4 mL tripsin ekleyin ve 4 dakika boyunca 36,5 °C'de bir kuvöze ve %5 CO2'ye yerleştirin.

3. Monokültür küresel formasyonu

  1. 2,5 mL% 4 (w / v) pluronic F-127 çözeltisi CMS kültür çipi(Şekil 2A)giriş deliğine 500-1.000 rpm yonga dönerken ve daha sonra CMS sistemi(Şekil 2B)kullanarak 3 dakika için 4.000 rpm fiş döndürün .
    NOT: Pluronik kaplama, talaş dönerken giriş portuna hücre bağlanmasını önler. Havanın mikrokuyularda sıkışmadığından emin olun.
  2. CmS kültür çipi pluronik çözelti ile bir gecede 36,5 ° C 5% CO2dolu kuluçka .
  3. Pluronik çözeltiyi çıkarın, kalan pluronik solüsyonu DMEM ile yıkayın ve talaş temiz bir tezgahta 12 saat kurulayın.
  4. CMS kültür çipine 2,5 mL DMEM ekleyin ve çipin içini ıslatmak için 3 dakika boyunca ~4.000 rpm'de çipi döndürün.
  5. Hücre süspansiyonuna yer açmak için dönüşü durdurun ve 100 μL DMEM çekin.
  6. 5 × 105 hASC veya 8× 105 MRC-5s içeren hücre süspansiyonları 100 μL ekleyin düzgün bir şekilde yeniden süspansiyon için 3-5x pipetleme ederek hücreleri dağıtın.
  7. 3 dakika boyunca 3000 rpm'de çipi döndürerek her mikrokuyudaki hücreleri santrifüj kuvvetle tuzağa düşürün.
    NOT: Aşırı dönme hızı çözelti fırlatma deliklerinden hücre kaçışına neden olabilir.
  8. Kültür 36.5 °C, >95% nem ve% 5 CO2,1.000-2.000 rpm dönen kuvözde 3 gün boyunca hücreleri. Kültür ortamını her gün değiştirin.

4. Eşkültür küresel oluşumu

  1. Eşmerkezli küresel ler oluşumu
    1. İlk hücreleri ekleyin, 2.5 × 105 hASCs, ve 3.000 rpm de çip döndürün. 3 dakika sonra, ikinci hücreleri ekleyin, 4 × 105 MRC-5s, ve 3 dk için 3.000 rpm de çip döndürün. Hücreler enjekte edildiğinde, dönme hızını 500-1.000 rpm'ye kaydırın.
    2. Kültür kuvöz hücreleri 36.5 °C, >95% nem% ve 5% CO2 1.000-2.000 rpm döner ekinde. Eşmerkezli küreseller 24 saat içinde oluşturulur. Uzun vadeli kültür için, kültür ortamını her gün değiştirin.
  2. Janus küresel formasyonu
    1. Çip 500-1.000 rpm'de dönerken pipetleme yaparak ilk hücreleri içeren 100 μL hücre süspansiyonları ekleyin, 2,5 × 105 hASC. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    2. Çipi 36,5 °C, >%95 nem ve %5 CO2'de 1.000-2.000 rpm'de 3 saat boyunca döndürerek kuluçkaya yatırın.
    3. Talaş 500-1.000 rpm'de dönerken pipetleme yaparak ikinci hücre kümesi olan 4 × 105 MRC-5s içeren hücre süspansiyonlarının 100 μL'sini ekleyin. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    4. Kültür kuvöz hücreleri 36.5 °C, >95% nem, ve 5% CO2 1.000-2.000 rpm dönerek. Janus küresel leri 24 saat içinde oluşturulur. Uzun vadeli kültür için, kültür ortamını her gün değiştirin.
  3. Sandviç küresel formasyonu
    1. Çip 500-1.000 rpm'de dönerken pipetleme yaparak ilk hücreleri içeren 100 μL hücre süspansiyonları ekleyin. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    2. Çipi 36,5 °C, >%95 nem ve %5 CO2'de 1.000-2.000 rpm'de 3 saat boyunca döndürerek kuluçkaya yatırın.
    3. İkinci hücreleri içeren hücre süspansiyonları 100 μL ekleyin, 3 × 105 MRC-5s, çip 500-1.000 rpm dönerken pipetleme tarafından. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    4. Çipi 36,5 °C, >%95 nem oranı ve %5 CO2'de 1.000-2.000 rpm'de 3 saat boyunca döndürerek kuluçkaya yatırın.
    5. Üçüncü hücreleri içeren hücre süspansiyonları 100 μL ekleyin, 1.5 × 105 hASCs, çip 500-1.000 rpm dönerken pipetleme tarafından. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.
    6. Kültür kuvöz hücreleri 36.5 °C, >95% nem% ve 5% CO2 1.000-2.000 rpm döner ekinde. Sandviç küreselleri 12 saat içinde oluşturulur. Uzun vadeli kültür için, kültür ortamını her gün değiştirin.

5. Hücre boyama

  1. Hücre floresan boyasını oda sıcaklığına (20 °C) ısıtın.
  2. 1 mM çözeltisi yapmak için şişe başına 20 μL susuz dimetilsülfoksit (DMSO) ekleyin.
  3. DMEM kullanarak floresan'ı 1 μM'lik son çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
  4. Hücre süspansiyonuna floresan ekleyin ve pipet kullanarak yavaşça askıya alın.
  5. 36,5 °C'de 20 dk inkübün, nem >%95 ve %5 CO2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıdaki protokole göre 6 cm çapında CMS kültür çipi(Şekil 2)başarıyla yapılmıştır. İlk olarak, çip bir üst tabaka ve bir alt tabakadan ayrı olarak yapılmış ve daha sonra plazma yapıştırma ile birbirine bağlanmış. Elde edilen küreseloidler çipi ayırarak kolayca toplanabilir. CMS kültür yongasının kanalı bir giriş portu ve merkezi, slayt ve microwell bölgelerinden oluşur(Şekil 3). Hücre, orta ve pluronik çözeltiler 5 mm çapında bir giriş deliğinden enjekte edilir. Enjekte edilen hücreler giriş noktası bölgesinde 3-5x resuspension ile eşit olarak dağıtılır. Hücreler orta bölgede santrifüj kuvvete maruz kalınır ve dışa doğru yayılır. Merkezi bölge mikrokuyudan daha yüksek olduğu için, daha fazla ortam içererek küresel lerin daha uzun süre hayatta kalmalarını sağlar. Mikrokuyunun yüksekliği 0,4 mm, merkezi bölgenin yüksekliği 1,5 mm'dir. İç çözeltileri kolayca çıkarmak için merkezi bölgenin merkezinde emme delikleri bulunur. Slayt bölgesi, merkezi bölgeyi ve mikrokuyu bölgesini birbirine bağlayan eğimli bir alandır. Hücreler 45° eğim boyunca hareket eder ve mikrokuyu bölgesine yerleşirler, burada hücreler yerleşir, büyür ve küresel bir şekilde tangle olur. Çipin merkezinden 14 mm uzaklıkta bulunan mikrokuyular 400 m yüksekliğinde ve 400 m çapında yarı silindiriktir. 100 mikrokuyuda aynı anda toplam 100 küresel üretilebilir.

Hazırlanan CMS çipi kullanılarak protokolde gösterilen sırada küresel oidler oluşturulabilir (Şekil 4). HASC ve MRC-5 hücreleri ile monokültür ve coculture spheroidler üretildi. Her hücre tipinden monokültür spheroidi üretmek için 5 × 105 hASC veya 8 × 105 MRC-5 enjekte edildi. Enjekte edilen hücre sayısı hücre büyüklüğünden bağımsızdı. Her iki hücre türünün hızlandırılmış görüntüleri hücre kültürünün 3. gününe kadar 2.000 rpm'de alınmıştır(Şekil 5). HASC'lerin ve MRC-5'lerin coculture spheroidleri de konsantrik, Janus ve sandviç yapılarla üretildi. Konsantrik küresel ler yapmak için ilk hücrelere (2,5 × 105 hASC) enjekte edildi ve ikinci hücrelere (4 × 105 MRC-5s) 3 dakika sonra enjekte edildi(Şekil 6A). İlk hücreler enjekte edildiğinde, yüksek yerçekimi nedeniyle U şeklinde oldular, ve ikinci hücreler enjekte edildiğinde, U şeklinin ortasına taşındılar. Zamanla, ilk U-şekil hücreleri ikinci hücreleri çevreleyen ve konsantrik küresel tamamladı. Janus küreseloidleri yapmak için ilk hücrelere (2,5 × 105 hASC) enjekte edildi ve ikinci hücrelere (4 × 105 MRC-5s) 3 saat sonra enjekte edildi(Şekil 6B). İki hücre arasındaki enjeksiyon aralığı uzun olduğunda, ilk hücrelerin şekli hücre toplama ile U şeklinden eliptik şekle dönüştü. İkinci hücreler ilk hücrelerin eliptik şekline eklendikten sonra Janus küresel leri üretildi. Sandviç küreselleri durumunda, ilk hücrelere (1,5 × 105 hASC) enjekte edildi, ikinci hücrelere (3 × 105 MRC-5s) 3 saat sonra enjekte edildi ve üçüncü hücrelere (1,5 × 105 hASC) başka bir 3 saat sonra enjekte edildi(Şekil 6C ). Janus küresel benzer, her hücre eliptik bir şekle toplandı, ve üç tabaka sandviç küresel oluşturmak için yığılmış. Son olarak, CMS uzun vadeli kültür yeteneğini göstermek için, hASCs kültürlü, 7 gün boyunca yüksek yerçekimi maruz kalan bir canlı / ölü titret ilerki çoğu hücre hayatta olduğunu göstermek için yapılan(Şekil 7). Ayrıca, CMS tüm mikrowells fotoğrafları mükemmel tekdüzelik ve küresellik göstermek için MRC-5s ekimi 3 gün sonra alınmıştır(Şekil 8).

Figure 1
Şekil 1: CMS kültür yongasının üst ve alt katmanlarının boyutları. PC kalıp bir CNC makine kullanılarak yapılmış ve 3D CAD (bilgisayar destekli tasarım) programı tarafından oluşturulan çizim dayalı bir CMS kültür çipi yapmak için PDMS ile çoğaltılır. Üst ve alt katmanların kenarlarındaki dört daire, iki katmanı hizalamak içindir. Boyutlar milimetre cinsinden. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: CMS sisteminin fotoğrafları. (A) Tamamlanan CMS kültür çipinin fotoğrafları. Çipin çapı 6 cm, mikrokuyuçapı 400 m'dir. Mikrokuyuların üzerindeki sayılar, 1'den 100'e kadar olan mikrokuyuların tek tek sayılarını temsil eder. Bu numaralar kalıba kazınmış. Ölçek çubuğu = 400 μm. (B) Tüm CMS sisteminin fotoğrafı. CMS sistemi CMS kültür çipi, talaş tutucu, DC motor ve dönen platformdan oluşur. CMS cihazları dönüş kuvveti ile 521 x g'ye kadar yerçekimi koşulları oluşturabilir. Talaş tutucu, yüksek yerçekimi nedeniyle CMS kültür yongasının ayrılmasını önler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: CMS kanal bileşenleri. (A) ŞEmatik görüntüler ve (B) CMS kültür çipinin bir kesitinin fotoğrafları. CMS kültür yongası bir giriş noktası ve merkezi, slayt ve microwell bölgelerinden oluşur. Enjekte edilen hücreler bariyerden 1.000 rpm'den daha az bir dönüş hızında geçemediği için, bariyer hücrenin yeniden askıya alınmasına ve hatta mikrokuyuya dağıtıma yardımcı olur. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: CMS kültür çipine hücrelerin yüklenmesi işlemi. (A) Hücrelerin çipin altına yapışmasını önlemek için, 4.000 rpm pluronik F-127 çözeltisinin 2,5 mL'si ile katlayın. Kaplamanın uygulanması için bir gün bekleyin. (B) Pluronik çözeltiyi çıkarın ve kanalı 2,5 mL DMEM ortamı ile önceden doldurun. (C) DMEM'in 100 μL'sini çıkarın ve 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Şu anda, hücrelerin eşit olarak dağıtılması için 3-5x'i yeniden askıya alın. (D) Çipi döndürerek hücreleri mikrokuyuya taşıyın ve hücreleri 3 gün boyunca 1.000 ila 2.000 rpm arasında kültürlendirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: hASC ve MRC-5 hücrelerinin monokültür spheroidlerinin hızlandırılmış fotoğrafı. Hücreler 24 saat boyunca 2000 rpm'de yetiştirildi. Spheroid 24 saat. Ölçek çubuğu = 400 μm içinde üretildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Kokültür spheroidlerinin floresan görüntüleri. (A) HASC hücrelerinin (yeşil) MRC-5 hücrelerini çevrelediği konsantrik küresel şekiller (kırmızı). (B) İki hücrenin simetrik olduğu Janus küresel şekli. (C) HASC tabakalarının iki MRC-5 katmanı arasında yığılmış olduğu sandviç küresel şekli. Ölçek çubuğu = 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: 7. Yeşil floresan renk canlı hücreleri temsil eder ve kırmızı floresan renk ölü hücreleri temsil eder. Ölçek çubuğu = 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: 3. günde MRC-5 spheroidleri. Nispeten sabit sayıda hücre her mikrokuyu girer ve CMS sisteminde nispeten sabit küreselliğe sahip küreselleri oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Küresel lerin toplanması. Kültürlü küresel ler CMS kültür çipinin iki katmanını bölerek hasat edilebilir. Plazma ile bağlanmış iki tabaka elle kolayca ayrılabilir. Daha sonra küreseller sadece borulama ile alt tabakadaki mikrowelllerden toplanır. Ölçek çubuğu = 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CMS, enjekte edilen tüm hücrelerin atık olmadan mikrokuyu girdiği kapalı bir sistemdir ve bu da onu geleneksel mikrowell bazlı küresel üretim yöntemlerinden daha verimli ve ekonomik hale getirir. CMS sisteminde, ortam her 12-24 saatte bir çipteki ortamı çıkarmak için tasarlanmış bir emme deliğinden değiştirilir(Şekil 3A). Ortam emme işlemi sırasında, ortam ve mikrokuyu duvarı arasındaki yüzey gerilimi nedeniyle mikrokuyunun içinden neredeyse hiç ortam kaçamaz. PDMS'den yapılmış çip elastik ve esnek olduğundan, kullanıcı çipin mikrokuyu bölgesine parmakla basarak kapana kısılmış ortamı kolayca kaldırabilir. Mikrokuyudaki hücreler, birden fazla ortam değişikliği olsa bile kaçmadan sabit kalır. Tüm 100 mikrowells sheroid aynı kalitede elde etmek için, cihazın rotasyoneksantrik olmamalıdır, ve çip aksimetrik olmalıdır. Aksi takdirde, hücrelerin değişken sayıda her kuyu girebilir ve boyutu ve küresel şekli farklı olabilir. Geleneksel mikrokuyu sisteminde, hava genellikle mikrokuyuda sıkışıp kaldığı için, hava kabarcıklarını çıkarmak gerekir. Ancak, CMS sistemi kabarcık kaldırma işlemini gerektirmez, çünkü rotasyon tarafından oluşturulan yüksek santrifüj kuvveti ortamın kabarcıkları itmesine ve mikrokuyulardan sıkışmasına neden olur.

CMS sistemi de geleneksel yöntemlere göre kendi sınırlamaları vardır. CMS sistemi daha büyük bir kültür alanı (örneğin, büyük kuluçka alanı) bir motor, dönen platform ve bir denetleyiciden oluşur ve toplam boyutu yaklaşık 100 mm x 100 mm x 150 mm 'dir(Şekil 2B). Buna ek olarak, hafif ama kalıcı bir titreşime neden olur. Biz sistemin minyatürleştirme (umarım 6 kuyu plakaları boyutuna benzer) bu sorunları çözecektir bekliyoruz.

CmS sisteminin iki plazma bağlı tabakasını ayırarak kültürlü küreseloidlerin toplanabileceği unutulmamalıdır(Şekil 9). İki tabakanın bağlanması, sistem çalışması sırasında ortamın sızmasını önleyecek kadar güçlüdür. Ancak, küçük yapıştırma alanı sayesinde, elle ayrılmaz. Spheroids sadece borulama tarafından alt tabakadan toplanabilir.

CMS sistemi, geleneksel küresel üretim yöntemlerine göre daha iyi tekrarlanabilirliğe ve üretkenliğe sahiptir. Normal mikrokuyu veya asılı damlacık yöntemleri gibi geleneksel yöntemler emek yoğun. Ancak, CMS sisteminde, sadece çip boyutunu artırarak küresel lerin sayısını artırmak çok daha kolaydır. Bu cihaz ile, konvansiyonel kültür yöntemleri yapmak kolay değildir çok hücreli türleri, kültür gerektiren organoidler oluşturmak da mümkündür. Bu çalışmada hücrelere ek olarak (hASC ve MRC-5), CMS küresel üretim için küresel oidler oluşturabilirsiniz hücrelerin çeşitli türleri kullanılarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu araştırma, NMG'nin Temel Bilim Araştırma Programı (2016R1D1A1B03934418) ve NMG'nin Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) tarafından desteklenmiş ve Kore hükümeti MSIT tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Cubicon 3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) ATCC PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA Thermo Fisher Scientific C2925 10 mM
CellTracker Red CMTPX Thermo Fisher Scientific C34552 10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver Roland DGA EGX-350
DC motor Nurielectricity Inc. MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020 Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5) ATCC CCL-171
Inventor 2019 Autodesk 3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm JetBiofill CAD010150 Surface Treated
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Pluronic F-127 Sigma Aldrich 11/6/9003 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC) Acrylmall AC15PC 200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Trypsin Gibco 12604021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  3. Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
  4. Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
  5. Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
  6. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  7. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  8. Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
  9. Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
  10. Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
  11. Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
  12. Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
  13. Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
  14. Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
  15. Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
  16. Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
  17. Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
  18. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).

Tags

Biyomühendislik Sayı 153 3D küresel santrifüj mikroakışkan sistemler laboratuvar-on-a-CD santrifüj kuvvet hiperyerçekimi hücre toplama
Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee,… More

Kim, D., Lee, G. H., Park, J., Lee, J. C., Park, J. Y. Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids. J. Vis. Exp. (153), e60399, doi:10.3791/60399 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter