Summary
نقدم جهاز ميكروفلويديك الطرد المركزي التي تعمل بالمحركات التي يمكن ان تزرع الخلايا خزان. باستخدام هذا الجهاز ، يمكن لخزان من أنواع الخلايا المفردة أو المتعددة ان تكون بسهوله الخياطة تحت ظروف الجاذبية العالية.
Abstract
ثقافة خليه كروي ثلاثية الابعاد يمكن الحصول علي نتائج أكثر فائده في تجارب الخلايا لأنها يمكن ان تحاكي أفضل البيئات المجهرية الخلية من الجسم الحي من ثقافة الخلية ثنائيه الابعاد. في هذه الدراسة ، ونحن ملفقه الكهربائية يحركها المحرك مختبر علي a-CD (القرص المضغوط) منصة ، ودعا الطرد المركزي القائم علي كروي (CMS) نظام الثقافة ، لخلق ثلاثي الابعاد (3D) خليه خزان تنفيذ قوه الطرد المركزي عاليه. هذا الجهاز يمكن ان تختلف سرعات الدوران لتوليد ظروف الجاذبية من 1 × g إلى 521 x g. نظام CMS هو 6 سم في القطر ، لديه 500 μm ميكروويلس ، ويرصد من قبل صب مع polydimethylsiloxane في قالب البولي التي premade جهاز الكمبيوتر الرقمية التحكم. جدار حاجز عند مدخل القناة لنظام CMS يستخدم قوه الطرد المركزي لنشر الخلايا بالتساوي داخل رقاقه. في نهاية القناة ، توجد منطقه منزلقه تسمح للخلايا بدخول الميكروويلس. وكمظاهره ، تولدت خزان بالزراعة الاحاديه وزراعه الخلايا الجذعية المستمدة من الدهون البشرية والورم الليفي بالرئة البشرية تحت ظروف الجاذبية العالية باستخدام النظام. استخدم نظام CMS عمليه بسيطه لإنتاج خزان الزراعة من مختلف الهياكل المتمركزة ، يانوس ، وساندويتش. سيكون نظام CMS مفيدا في البيولوجيا الخلوية ودراسات هندسه الانسجه التي تتطلب خزان والثقافة العضوية لأنواع الخلايا المفردة أو المتعددة.
Introduction
فمن الأسهل لمحاكاة البيولوجية في البيئات المجهرية المجرية مع ثلاثي الابعاد (3D) ثقافة الخلية كروي من مع ثقافة الخلية ثنائي الابعاد (2D) (علي سبيل المثال ، التقليدية الثقافة الخلية طبق بيتري) لإنتاج التجريبية أكثر واقعيه من الناحية الفسيولوجية النتائج1. وتشمل الأساليب المتاحة حاليا كروي تشكيل الشنق تقنيه قطره2، تقنيه تراكب السائل3، تقنيه الكربوكسيل ميثيل السليلوز4، المغناطيسية المستندة إلى القوه ميكروفلويديك تقنيه5، واستخدام المفاعلات الحيوية6. علي الرغم من ان كل أسلوب له فوائده الخاصة ، والمزيد من التحسن في استنساخ ، والانتاجيه ، وتوليد خزان الزراعة ضروري. علي سبيل المثال ، في حين ان تقنيه ميكروفلويديك المستندة إلى القوه المغناطيسية5 غير مكلفه نسبيا ، يجب النظر بعناية في اثار المجالات المغناطيسية القوية علي الخلايا الحية. وقد تم الإبلاغ عن فوائد الثقافة الكروية ، ولا سيما في دراسة تمايز الخلايا الجذعية وانتشارها في العديد من الدراسات7و8و9.
نظام ميكروفلويديك الطرد المركزي ، والمعروف أيضا باسم مختبر علي a-CD (القرص المضغوط) ، مفيد للسيطرة بسهوله داخل السائل واستغلال دوران الركيزة ، التالي تم استخدامها في التطبيقات الطبية الحيوية مثل الاختبارات المناعية10، الاختبارات اللونية للكشف عن علامات البيوكيميائية11، تضخيم الحمض النووي (PCR) المقايسات ، ونظم تحليل الدم الألى12، والكل في واحد الطرد المركزي الاجهزه ميكروفلويديك13. القوه الدافعة للسيطرة علي السائل هي قوه الجاذبية التي تم إنشاؤها بواسطة التناوب. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن القيام بوظائف متعددة للخلط ، والاختلاط ، وتقسيم العينات ببساطه في هذا النظام الأساسي لقرص مضغوط واحد. ومع ذلك ، بالمقارنة مع أساليب التحليل البيوكيميائية المذكورة أعلاه ، كان هناك عدد اقل من التجارب التي تطبق منصات القرص المضغوط علي خلايا الثقافة ، وخاصه خزان14.
في هذه الدراسة ، ونحن نظهر أداء نظام الطرد المركزي القائم علي microfluidic كروي (CMS) من الزراعة الاحاديه أو زراعه الخلايا الجذعية المستمدة من الدهون البشرية (hASC) والورم الليفي الرئوي البشري (مومباسا-5). تصف هذه الورقة بالتفصيل المنهجية البحثية لمجموعتنا15. التالي ، فان الثقافة الكروية علي منصة مختبر علي a-CD يمكن بسهوله استنساخها. ويعرض نظام لتوليد CMS يضم رقاقه ثقافة CMS ، حامل رقاقه ، محرك DC ، جبل المحرك ، ومنصة الدورية. المحرك جبل 3D المطبوعة مع اكريلونيتريل البيوتادين (ABS). حامل رقاقه ومنصة الدورية هي CNC (الكمبيوتر التحكم العددي) تشكيله مع جهاز الكمبيوتر (البولي). يتم التحكم في سرعه دوران المحرك من 200 إلى 4,500 لفه في الدقيقة عن طريق ترميز خوارزميه PID (التناسبية المتكاملة) استنادا إلى تعديل عرض النبض. ابعادها هي 100 مم × 100 مم × 150 ملم ويزن 860 غرام ، مما يجعل من السهل التعامل معها. باستخدام نظام CMS ، يمكن ان تتولد خزان تحت ظروف الجاذبية المختلفة من 1 × ز إلى 521 x ز، التالي فان دراسة تعزيز التمايز الخلية تحت الجاذبية العالية يمكن تمديدها من الخلايا 2d16،17 إلى 3d كروي. الزراعة من أنواع مختلفه من الخلايا هو أيضا التكنولوجيا الرئيسية لمحاكاة بشكل فعال في بيئة الجسم الحيوي18. نظام CMS يمكن بسهوله توليد خزان الزراعة الاحاديه ، فضلا عن خزان الزراعة من أنواع مختلفه من الهيكل (علي سبيل المثال ، المتمركزة ، يانوس ، وساندويتش). ويمكن استخدام نظام CMS ليس فقط في دراسات كروي بسيطه ولكن أيضا في دراسات organoid 3D ، للنظر في هياكل الجهاز البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الطرد المركزي microfluidic القائم علي كروي (CMS) ثقافة تصنيع رقاقه
- جعل قوالب الكمبيوتر للطبقات العلوية والسفلية من رقاقه ثقافة CMS عن طريق التصنيع باستخدام الحاسب الألى. وترد الابعاد التفصيلية للشريحة في الشكل 1.
- مزيج PDMS قاعده وعامل معالجه PDMS بنسبه 10:1 (ث/ث) لمده 5 دقائق ومكان في المجفف ل 1 ح لأزاله فقاعات الهواء.
- بعد سكب خليط PDMS في قوالب الثقافة CMS رقاقه ، وأزاله فقاعات الهواء ل 1 ح أكثر وعلاج في غرفه الحرارة في 80 درجه مئوية لمده 2 ساعة.
- ضعها في منظف البلازما مكنسة مع الأسطح التي ستواجه المستعبدين وتعريضهم لبلازما بمساعده الهواء في قوه 18 واط لمده 30 ثانيه.
- السندات طبقتين من رقاقه ثقافة CMS ووضعها في غرفه الحرارة في 80 درجه مئوية لمده 30 دقيقه لزيادة قوه التصاق.
- تعقيم رقاقه الثقافة CMS في معقم الاوتوكلاف في 121 درجه مئوية و 15 psi.
2-اعداد الخلايا
- ذوبان 1 مل من القارورة التي تحتوي علي 5 × 105– 1 × 10 6 hascs أو الخلاياالسادسة -5s في حمام مائي في 36.5 درجه مئوية لمده 2 دقيقه.
- أضف 1 مل من النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) إلى قارورة واخلط برفق مع ماصه 1,000 μL.
- وضع 15 مل من DMEM يسخن إلى 36.5 درجه مئوية في طبق بيتري قطرها 150 مم باستخدام ماصه وأضافه الخلايا من القارورة.
- بعد يوم واحد ، يستنشق DMEM واستبدال مع 15 مل من DMEM الطازجة. وبعد ذلك ، تغيير الوسائط كل يومين أو ثلاثه أيام.
- لفصل الخلايا من طبق بيتري ، أضافه 4 مل من التريبسين إلى اطباق بيتري ووضعها في حاضنه في 36.5 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده 4 دقائق.
3. تشكيل كروي الزراعة الاحاديه
- وضع 2.5 مل من 4 ٪ (ث/الخامس) الحل 127 التعددية في فتحه مدخل من رقاقه ثقافة CMS (الشكل 2A) في حين تناوب رقاقه في 500-1000 دوره في الدقيقة ومن ثم تدوير رقاقه في 4,000 دوره في الدقيقة لمده 3 دقائق باستخدام نظام CMS (الشكل 2a).
ملاحظه: الطلاء التعددي يمنع مرفق الخلية إلى منفذ مدخل في حين تدور رقاقه. تاكد من ان الهواء ليس محصورا في الميكروويلس. - احتضان رقاقه ثقافة CMS مليئه الحل التعددي بين عشيه وضحيها في 36.5 درجه مئوية في 5 ٪ CO2.
- قم بازاله المحلول التعددي ، واغسل المحلول التعددي المتبقي مع DMEM ، وجفف الرقاقة لمده 12 ساعة علي مقعد نظيف.
- أضافه 2.5 mL من DMEM إلى رقاقه ثقافة CMS وتدوير رقاقه في ~ 4,000 دوره في الدقيقة لمده 3 دقائق لترطيب المسبق داخل رقاقه.
- وقف التناوب وسحب 100 μL من DMEM لتوفير مساحة لحقن تعليق الخلية.
- أضافه 100 μL من تعليق الخلية التي تحتوي علي اما 5 × 105 hascs أو 8 × 105 الجمهوري-5s من خلال التنضيد توزيع الخلايا بشكل موحد عن طريق التنضيد 3-5s لأعاده التعليق.
- تدوير رقاقه في 3,000 لفه في الدقيقة لمده 3 دقائق لفخ الخلايا في كل microwell من قبل قوه الطرد المركزي.
ملاحظه: سرعه الدوران المفرط يمكن ان يسبب هروب الخلية من خلال الثقوب طرد الحل. - ثقافة الخلايا لمده 3 أيام في الحاضنة في 36.5 درجه مئوية ، > 95 ٪ الرطوبة ، و 5 ٪ CO2، بالتناوب في 1000-2000 دوره في الدقيقة. تغيير الثقافة المتوسطة كل يوم.
4. تكوين كروي الزراعة
-
تشكيل خزان المتمركزة
- أضافه الخلايا الاولي ، 2.5 × 105 hascs ، وتدوير رقاقه في 3,000 rpm. بعد 3 دقائق ، أضافه الخلايا الثانية ، 4 × 105 مومباسا-5s ، وتدوير رقاقه في 3,000 لفه في الدقيقة لمده 3 دقائق. حقن ما مجموعه 100 μl من تعليق الخلية عن طريق التنضيد. عندما يتم حقن الخلايا ، وتحويل سرعه الدوران إلى 500-1000 دوره في الدقيقة.
- ثقافة الخلايا في الحاضنة في 36.5 درجه مئوية ، > 95 ٪ الرطوبة ٪ ، و 5 ٪ CO2 بالتناوب في 1000-2000 دوره في الدقيقة. يتم إنشاء خزان المتمركزة في غضون 24 ساعة. للثقافة طويلة الأجل ، تغيير الثقافة المتوسطة كل يوم.
-
يانوس كروي تشكيل
- أضافه 100 μL من تعليق الخلية التي تحتوي علي الخلايا الاولي ، 2.5 × 105 hascs ، عن طريق التنضيد في حين ان رقاقه تدور في 500-1000 دوره في الدقيقة. ثم ، تدوير رقاقه في 3,000 لفه في الدقيقة لمده 3 دقائق.
- احتضان رقاقه في 36.5 درجه مئوية ، > 95 ٪ الرطوبة ، و 5 ٪ CO2 بالتناوب في 1000-2000 دوره في الدقيقة لمده 3 ساعات.
- أضافه 100 μL من تعليق الخلية التي تحتوي علي المجموعة الثانية من الخلايا ، 4 × 105 الجمهوري-5s ، عن طريق التنضيد في حين ان رقاقه تدور في 500-1000 دوره في الدقيقة. ثم ، تدوير رقاقه في 3,000 لفه في الدقيقة لمده 3 دقائق.
- ثقافة الخلايا في الحاضنة في 36.5 درجه مئوية ، > 95 ٪ الرطوبة ، و 5 ٪ CO2 بالتناوب في 1000-2000 دوره في الدقيقة. يتم إنشاء خزان يانوس في غضون 24 ساعة. للثقافة طويلة الأجل ، تغيير الثقافة المتوسطة كل يوم.
-
كروي تشكيل ساندويتش
- أضافه 100 μL من تعليق الخلية التي تحتوي علي الخلايا الاولي ، 1.5 × 105 hascs ، عن طريق التنضيد في حين ان رقاقه تدور في 500-1000 دوره في الدقيقة. ثم ، تدوير رقاقه في 3,000 لفه في الدقيقة لمده 3 دقائق.
- احتضان رقاقه في 36.5 درجه مئوية ، > 95 ٪ الرطوبة ، و 5 ٪ CO2 بالتناوب في 1000-2000 دوره في الدقيقة لمده 3 ساعات.
- أضافه 100 μL من تعليق الخلية التي تحتوي علي الخلايا الثانية ، 3 × 105 الجمهوري-5s ، عن طريق التنضيد في حين ان رقاقه تدور في 500-1000 دوره في الدقيقة. ثم ، تدوير رقاقه في 3,000 لفه في الدقيقة لمده 3 دقائق.
- احتضان رقاقه في 36.5 درجه مئوية ، > 95 ٪ الرطوبة ٪ ، و 5 ٪ CO2 بالتناوب في 1000-2000 دوره في الدقيقة لمده 3 ساعات.
- أضافه 100 μL من تعليق الخلية التي تحتوي علي الخلايا الثالثة ، 1.5 × 105 hascs ، عن طريق التنضيد في حين ان رقاقه تدور في 500-1000 دوره في الدقيقة. ثم ، تدوير رقاقه في 3,000 لفه في الدقيقة لمده 3 دقائق.
- ثقافة الخلايا في الحاضنة في 36.5 درجه مئوية ، > 95 ٪ الرطوبة ٪ ، و 5 ٪ CO2 بالتناوب في 1000-2000 دوره في الدقيقة. يتم إنشاء خزان ساندويتش في غضون 12 ساعة. للثقافة طويلة الأجل ، تغيير الثقافة المتوسطة كل يوم.
5. تلطيخ الخلية
- يسخن صبغه الخلية الفلورية إلى درجه حرارة الغرفة (20 درجه مئوية).
- أضافه 20 μL من ثنائي ميثيل سولفوكسيد لامائية (DMSO) لكل قنينة لجعل محلول 1 ملم.
- تمييع الفلوري إلى تركيز العمل النهائي من 1 μM باستخدام DMEM.
- أضافه الفلوري إلى تعليق الخلية وأعاده التعليق برفق باستخدام ماصه.
- احتضان 20 دقيقه في 36.5 درجه مئوية ، والرطوبة من > 95 ٪ ، و 5 ٪ CO2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تمت بنجاح الشريحة الثقافة CMS قطرها 6 سم (الشكل 2) بعد البروتوكول المذكور أعلاه. أولا ، تم صنع الرقاقة بشكل منفصل عن طبقه علويه وطبقه سفليه ومن ثم المستعبدين معا عن طريق الترابط البلازما. الخزان الناتجة يمكن جمعها بسهوله عن طريق فصل الرقاقة. وتتالف قناه الشريحة الثقافية CMS من منفذ مدخل ومناطق مركزيه ومنزلقه وميكروبئر (الشكل 3). يتم حقن الخلايا والحلول المتوسطة والتعددية من خلال فتحه مدخل بقطر 5 ملم. يتم توزيع الخلايا المحقونة بالتساوي من خلال أعاده التعليق 3 – 5x في منطقه منفذ المدخل. وتخضع الخلايا لقوه الطرد المركزي في المنطقة الوسطي وتنتشر إلى الخارج. لان المنطقة الوسطي هي اعلي من microwell ، فانه يمكن ان تحتوي علي المزيد من وسائل الاعلام ، مما يسمح لخزان للبقاء لفتره أطول. ارتفاع microwell هو 0.4 مم وارتفاع المنطقة الوسطي هو 1.5 مم. توجد ثقوب شفط في وسط المنطقة الوسطي لأزاله الحلول الداخلية بسهوله. منطقه الشريحة هي منطقه المنحدرة التي تربط بين المنطقة الوسطي ومنطقه microwell. تتحرك الخلايا علي طول منحدر 45 درجه وتستقر في منطقه microwell ، حيث تستقر الخلايا ، وتنمو ، ومتشابكة لتشكل خزان. ميكروويلس تقع 14 ملم من مركز الرقاقة هي semicylindrical مع ارتفاع 400 μm وقطرها 400 μm. ويمكن توليد ما مجموعه 100 خزان في وقت واحد في 100 ميكروويلس.
باستخدام رقاقه CMS المعدة ، يمكن إنشاء خزان بالترتيب الموضح في البروتوكول (الشكل 4). وقد تولدت خزان الزراعة الاحاديه والزراعة الاحيائيه مع خلايا hASC و-5. لتوليد كروي الزراعة الاحاديه لكل نوع من الخلايا ، تمحقن 5 × 10 5 hascs أو 8 × 105 الجمهورية المومباسا الجمهوري-5s. وكان عدد الخلايا المحقونة مستقلا عن حجم الخلية. التقطت صور الفاصل الزمني لكلا النوعين من الخلايا عند 2,000 لفه في الدقيقة حتى اليوم 3 من ثقافة الخلايا (الشكل 5). وقد تم أيضا توليد خزان الزراعة المستديمة لل hASCs و-5s مع الهياكل المتمركزة ، يانوس ، وساندويتش. لجعل خزان المتمركزة ، تم حقن الخلايا الاولي (2.5 × 105 hascs) وتم حقن الخلايا الثانية (4 × 105 الجمهوري-5s) 3 دقائق في وقت لاحق (الشكل 6a). عندما تم حقن الخلايا الاولي ، أصبحوا علي شكل حرف U بسبب الجاذبية العالية ، وعندما تم حقن الخلايا الثانية ، انتقلوا إلى منتصف الشكل U. مع مرور الوقت ، طوقت الخلايا الاولي U الشكل الخلايا الثانية وأكملت خزان المتمركزة. لجعل يانوس خزان ، تم حقن الخلايا الاولي (2.5 × 105 hascs) ، وتم حقن الخلايا الثانية (4 × 105 الجمهوري-5s) 3 ح في وقت لاحق (الشكل 6b). عندما كان الفاصل الزمني للحقن بين الخليتين طويلا ، تغير شكل الخلايا الاولي من شكل U إلى شكل اهليلجيه بواسطة تجميع الخلايا. وبمجرد أضافه الخلايا الثانية إلى الشكل الاهليلجيه للخلايا الاولي ، تم إنشاء خزان يانوس. في حاله خزان ساندويتش ، تم حقن الخلايا الاولي (1.5 × 105 hascs) ، والخلايا الثانية (3 × 105 السادسة-5s) تم حقن 3 ح في وقت لاحق ، والخلايا الثالثة (1.5 × 105 hascs) تم حقن بعد آخر 3 ساعة (الشكل 6c ). علي غرار كروي يانوس ، كل خليه تجميعها في شكل بيضاوي الصورة ، والطبقات الثلاث مكدسه لتوليد ساندويتش خزان. وأخيرا ، ولإثبات القدرة الثقافية الطويلة الأجل لهذه اليه ، كانت المراكز مثقفه ومعرضه للجاذبية العالية لمده 7 أيام يليها فحص حي/ميت اجري لإظهار ان معظم الخلايا قد نجا (الشكل 7). أيضا, صورت من [ال ميكروويلس] من ال [سم] كان أخذت بعد 3 أيام من [مومباسا-5 س] زراعه ان يبدي تماثل ممتازة وكرويه من خزان (شكل 8).
الشكل 1: ابعاد الطبقات العليا والسفلي من رقاقه ثقافة CMS. تم صنع قالب PC باستخدام اله CNC ونسخها مع PDMS لجعل رقاقه ثقافة CMS استنادا إلى الرسم الذي تم إنشاؤه بواسطة برنامج CAD 3D (تصميم بمساعده الكمبيوتر). الدوائر الاربعه علي حواف الطبقات العليا والسفلي هي لمحاذاة طبقتين. الابعاد في ملليمتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور لنظام CMS. (ا) صور لرقاقه ثقافة CMS المكتملة. قطر الرقاقة هو 6 سم وقطر microwell هو 400 μm. وتمثل الأرقام الواردة أعلاه ميكروويلس الأرقام الفردية لميكروويلس من 1 إلى 100. وقد نقشت هذه الأرقام في العفن. شريط مقياس = 400 μm. (ب) صوره لنظام CMS بأكمله. ويضم نظام CMS رقاقه ثقافة CMS ، حامل رقاقه ، محرك DC ، ومنصة الدورية. يمكن للاجهزه CMS توليد ظروف الجاذبية تصل إلى 521 x g من خلال قوه التناوب. حامل رقاقه يمنع فصل رقاقه الثقافة CMS بسبب الجاذبية العالية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مكونات القناة في CMS. (ا) صور تخطيطيه و (ب) صور لمقطع عرضي من رقاقه ثقافة CMS. تتكون رقاقه الثقافة CMS من منفذ مدخل والمناطق المركزية ، والشرائح ، و microwell. لان الخلايا المحقونة لا تمر عبر الحاجز بسرعة دوران اقل من 1,000 لفه في الدقيقة ، فان الحاجز يساعد في أعاده تعليق الخلية وحتى التوزيع علي microwell. شريط مقياس = 2 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: عمليه تحميل الخلايا في رقاقه ثقافة CMS. (ا) لمنع الخلايا من التصاق إلى الجزء السفلي من رقاقه ، معطف مع 2.5 mL من الحل 127 التعددية في 4,000 دوره في الدقيقة. انتظر يوما ليتم تطبيق الطلاء. (ب) أزاله الحل التعددي والتعبئة المسبقة للقناه مع 2.5 مل من المتوسطة dmem. (C) أزاله 100 ΜL من dmem و Add 100 μl من تعليق الخلية. في هذا الوقت ، أعاده التعليق 3-5x بحيث يتم توزيع الخلايا بالتساوي. (د) نقل الخلايا إلى microwell عن طريق تدوير رقاقه ، ومن ثم الثقافة الخلايا لمده 3 أيام في 1,000 إلى 2,000 دوره في الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صوره بالفاصل الزمني لخزان الاحاديه الزراعة لخلايا الهجيم والخلية الخامسة. ونميت الخلايا لمده 24 ساعة في 2,000 لفه في الدقيقة. تم إنشاء كروي في غضون 24 ساعة. شريط مقياس = 400 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الصور الفلورية لخزان الزراعة. (ا) الاشكال الكروية المتمركزة التي تحيط فيها خلايا hasc (الخضراء) خلايا الخلية الخامسة (الحمراء). (ب) يانوس كروي الشكل الذي تكون فيه خليتان متناظرتين. (ج) شكل كروي السندويشات التي تكون فيها طبقات hasc مكدسه بين طبقتين من الطبقات الثنائية-5. شريط مقياس = 400 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الفحص الحي/الميت لل hASC في اليوم السابع. يمثل لون الفلورسنت الأخضر الخلايا الحية ويمثل لون الفلورسنت الأحمر الخلايا الميتة. شريط مقياس = 400 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: خزان-5 في اليوم الثالث. وهناك عدد ثابت نسبيا من الخلايا التي تدخل كل microwell وشكل خزان وجود كرويه ثابته نسبيا في نظام CMS. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: حصاد الخزان. يمكن حصاد الخزان المستزرعة عن طريق تقسيم طبقتين من رقاقه ثقافة CMS. يمكن فصل طبقتي البلازما المستعبدين بسهوله باليد. ثم يتم جمع خزان من الميكروويلس في الطبقة السفلي ببساطه عن طريق التنضيد. شريط مقياس = 400 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
و CMS هو نظام مغلقه فيها جميع الخلايا المحقونة دخول microwell دون النفايات ، مما يجعلها أكثر كفاءه واقتصادا من الأساليب التقليدية الكروية الجيل الصغرى. في نظام CMS ، يتم استبدال وسائل الاعلام كل 12-24 ساعة من خلال ثقب شفط مصممه لأزاله وسائل الاعلام في رقاقه (الشكل 3A). خلال عمليه شفط وسائل الاعلام ، بالبالكاد اي وسائل الاعلام يهرب من داخل microwell بسبب التوتر السطحي بين وسائل الاعلام وجدار microwell. يمكن للمستخدم بسهوله أزاله وسائل الاعلام المحاصرين عن طريق الضغط بالقرب من منطقه microwell من رقاقه مع اصبع ، لان رقاقه مصنوعة من PDMS مرنه ومرنه. تبقي الخلايا في microwell مستقره دون الهروب ، حتى مع تغييرات وسائط متعددة. لتحقيق نفس نوعيه كروي في جميع ميكروويلس 100 ، لا ينبغي ان يكون دوران الجهاز غريب الأطوار ، وينبغي ان تكون رقاقه أكسيسيميتريكال. والا ، فان عددا متغيرا من الخلايا قد يدخل كل بئر ويمكن ان يختلف حجم وشكل الكروي. في نظام microwell التقليدية ، وذلك لان الهواء في كثير من الأحيان المحاصرين في microwell ، فمن الضروري لأزاله فقاعات الهواء. ومع ذلك ، فان نظام CMS لا يتطلب عمليه أزاله الفقاعات لان قوه الطرد المركزي العالية المتولدة عن الدوران تسبب وسائل الاعلام لدفع الفقاعات والضغط عليها من الميكروويلس.
ولنظام CMS أيضا حدوده مقارنه بالأساليب التقليدية. ويتطلب نظام CMS حيزا ثقافيا أكبر (علي سبيل المثال ، مساحة حاضنه كبيره) لأنه يضم محركا ، ومنصة دواره ، ووحده تحكم ، ويبلغ حجمه الإجمالي حوالي 100 مم × 100 مم × 150 مم (الشكل 2 ب). الاضافه إلى ذلك ، فانه يسبب اهتزاز طفيف ولكن المستمر. ونتوقع ان يؤدي تصغير النظام (الذي يؤمل ان يكون مماثلا لحجم 6 لوحات جيده) إلى حل هذه القضايا.
وتجدر الاشاره إلى انه يمكن جمع الخزان المستزرعة عن طريق فصل طبقتي البلازما المستعبدين من نظام CMS (الشكل 9). الترابط بين طبقتين قويه بما فيه الكفاية لمنع وسائل الاعلام من تسرب اثناء تشغيل النظام. ومع ذلك ، نظرا لمنطقه الترابط الصغيرة ، فانه يمكن فصله باليد. يمكن جمع الخزان ببساطه من الطبقة السفلية عن طريق التنضيد.
نظام CMS لديه أفضل استنساخ والانتاجيه من الأساليب التقليدية للجيل الكروي. الأساليب التقليدية ، مثل microwell العادية أو شنقا طرق القطيرات ، والعمالة الكثيفة. ومع ذلك ، في نظام CMS ، فانه من الأسهل بكثير لزيادة عدد خزان ببساطه عن طريق زيادة حجم رقاقه. مع هذا الجهاز ، فمن الممكن أيضا لتوليد العضوية التي تتطلب ثقافة أنواع متعددة ، والتي ليس من السهل القيام به في أساليب الثقافة التقليدية. بالاضافه إلى الخلايا في هذه الدراسة (hASC و-5) ، يمكن استخدام CMS للإنتاج كروي باستخدام أنواع أخرى مختلفه من الخلايا التي يمكن ان تشكل خزان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث العلمية الاساسيه (2016R1D1A1B03934418) وبرنامج تطوير التكنولوجيا الطبية & البيولوجية (2018M3A9H1023141) من الحكومة الكورية الجنوبية ، والتي تمول من قبل وزاره الدولة ، MSIT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
