Summary
우리는 세포 효능의 주입 연구를 위한 충분한 수에 있는 관심 있는 유전자의 우수한 공동 발현을 가진 세포를 산출하는 rhesus macaque 말초 혈액 단핵 세포의 transduction 그리고 확장을 위한 9 일 프로토콜을 개략적으로 설명합니다.
Abstract
전염병과 암을 취급하는 신흥 면역 요법은 수시로 질병 표적으로 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 가진 세포 인구의 transduction를 관련시킵니다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포는 암 및 바이러스 감염을 치료하는 데 CAR 분자를 코딩하는 합성 유전자를 가진 T 세포의 형질전환을 수반한다. CAR 분자는 T 세포가 특히 암 또는 바이러스성 감염한 세포를 인식하고 죽이게 합니다. 세포는 또한 관심있는 그밖 유전자와 공동 변환될 수 있습니다. 예를 들면, 세포는 특정 위치에 세포를 표적으로 하는 단백질을 코딩하는 유전자와 공동 변환될 수 있습니다. 여기서, 우리는 바이러스 특이적 CAR 및 B 세포 여포 호밍 분자 케모카인 수용체 유형 5(CXCR5)를 코딩하는 유전자로 1차 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 트랜스듀싱하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 9 일이 걸리고 중앙 기억 표현형을 유지하는 변환된 T 세포 집단에서 유래합니다. 중앙 기억 또는 덜 분화 된 표현형의 유지 보수는 주입 후 세포의 지속성과 관련이 있는 것으로 나타났다. 더욱이, 이 방법으로 생성된 세포는 높은 수준의 생존율, 두 개의 형질전환된 유전자의 공동 발현의 높은 수준, 면역 치료 주입을 위한 충분한 양의 세포를 보여준다. 이 9일 프로토콜은 CAR-T 세포 및 다른 T 세포 면역 요법 접근법에 광범위하게 사용될 수 있다. 여기에 설명된 방법은 이전 간행물에 제시된 연구를 기반으로 합니다.
Introduction
세포 면역 요법은 암과 전염병을 포함한 질병을 치료하는 새로운 수단으로 부상하고 있습니다. 이 면역 요법 방법은 수시로 특정 분자를 표현하기 위하여 치료 세포를 유전으로 조작하는 관련시킵니다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 병에 걸린 세포에 분자를 특이하게 결합하는 세포외 도메인과 병들한 세포를 죽이는 면역 세포를 유발하는 신호 도메인을 가지는 CAR 분자를 발현하도록 설계되었습니다. CAR T 세포는 암 면역요법에 성공적으로 사용되고 있으며, B 세포 백혈병 치료에 특히 효과적이다1,,2,,3. CAR-T 세포는 또한 HIV와 같은 바이러스성 감염을 취급하기 위하여 개발되고 있습니다. HIV 특이적 CA는 바이러스성 감염된 세포의 표면에 봉투 단백질을 표적으로4. 면역 치료 세포는 또한 특정 조직 위치에 치료 세포를 표적으로 하는 호밍 분자를 발현하도록 설계될 수 있습니다. 우리는 바이러스 특이적인 CAR 뿐만 아니라 림프성 여포 homing 분자 CXCR55를변환하는 벡터를 개발했습니다.
인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 시미안 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한 일부 바이러스의 바이러스 복제는 이차 림프 조직에서 B 세포 여포 내에 집중되어6. B 세포 여포는 바이러스 특이적 CTL의 낮은 수준이 지속적인 바이러스복제를허용하는 다소 면역 특권 사이트입니다7,8. 이러한 이유로, CXCR5의 발현을 통해 모낭 내로 HIV/SIV 특이적 T 세포를 표적화하는 것은 바이러스감염세포의 여포저장소를 제거하기 위한전략이다 9,,10. 구체적으로, 우리는 CXCR5 공동 발현을 통해 B 세포 여포에 SIV 특이적 CAR T 세포를 표적으로 하고 있다.
이 프로토콜에서 우리는 CAR/CXCR5를 변환하고 치료 주입을 위한 충분한 양의 CAR/CXCR5 T 세포를 생성하기 위하여 PBMC를 확장하는 방법을 기술합니다. 이러한 방법으로 형질전환된 세포는 중앙 메모리 표현형을 유지한다. 연구에 따르면 중앙 기억 T 세포및 T기억줄기세포와 같이 분화된 표현형이 덜분화된 세포는분화세포(11,,12)보다더 잘 지속된다. 또한, 채택적으로 전달된 세포를 생성하도록 설계된 많은 프로토콜은 상대적으로 긴 배양 시간을 가지며, 이는 보다 분화된 표현형 및 감소된 지속성을 가지는세포(13)를초래한다. 더욱이, 비장의 폐에 표적 림프조직 대신에 폐 내에 축적된 배양시간이 긴 세포를 채택적으로 옮겼다14,,15. 여기서 설명하고 설명하는 방법에서, 우리는 중앙 기억 표현형을 유지하는 트랜스듀렉트 세포를 생산하기 위해 rhesus macaque PBMC를 신속하게 변환하고 확장합니다.
CD4와 CD8 T 세포는 모두 우리의 면역 요법 접근법에 포함되어 있습니다. 이러한 혼합 세포 집단은 임상 시험에서 CD8+ T 세포 생성물에서 CD4+ T 세포의 부재가 16을지속하기 위해 주입된 CD8 T 세포의 실패와 상관관계가 있었기 때문에 선택되었다. 여기서 설명된 방법은 T 세포 수용체를 강력하게 자극하고 클론 변성17,,18을피하기 위해 공동 자극 신호를 제공하는 항 CD3 및 항 CD28 항체로 PBMC를 활성화함으로써 시작됩니다.
활성화 후, 세포는 바이러스 특이적 CAR 및 림프구 호밍 분자 CXCR5를 인코딩하는 감마레트로바이러스 벡터로 트랜스화된다. 그런 다음 기저부에서 가스 투과성 멤브레인이 있는 비부착 세포 전파용으로 설계된 플레이트를 사용하여 트랜스듀싱 셀을 확장합니다. 이 막은 세포 생존 및 영양 가용성 향상으로 이어지는 우물의 바닥에 가스 교환을 허용19. 이러한 방법을 사용하여 생체 내 주입 연구를 위해 9 일 기간에 충분한 기능성 세포를 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 rhesus macaque T 세포를 변환하고 확장하기 위해 설계되었지만 종 별 활성화 항체를 약간 수정하여 다른 종의 세포와 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 이전에 발표 된 연구9,,20을기반으로합니다.
Protocol
참고: 이 rhesus PBMC 형질전환 프로토콜은 감마레트로바이러스 벡터의 사용을 필요로 한다. 감마레트로바이러스는 실험실에서 생산되거나 바이러스 성 생산 회사에 아웃소싱 될 수 있습니다. 실험실에서 생산은 1단계에서 설명된 프로토콜로 수행될 수 있으며 바이러스는 2단계에서 설명된 대로 적시될 수 있다. 바이러스가 현장에서 또는 생산 회사에 의해 생성되는지 여부, MOI (배양 세포에 대한 전염성 비리의 비율)는 3 단계에서 설명한 바와 같이 새로 생산 된 각 바이러스 제제 및 관심있는 세포에 대해 결정되어야합니다.
주의: 감마레트로바이러스 벡터 또는 기타 레트로바이러스 벡터를 사용하려면 실험실 코트 와 장갑 이중 층 사용과 같은 적절한 안전 예방 조치가 필요합니다. 바이러스의 모든 처리는 생물 안전 후드에서 발생해야합니다. 모든 파이펫은 30 분 동안 10 % 표백제용액으로 오염제거되어야합니다. 모든 액체 전염성 폐기물은 10 % 표백제의 최종 농도로 오염되어야합니다. 미생물학적 에어로졸의 방출을 방지하는 씰이 있는 이차 봉쇄는 원심분리에 필요합니다.
1. 감마레트로바이러스 주식 생산
- 형질 감염을 위한 플레이트 293T 세포. 전체 바이러스 제제는 항생제없이 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) + 10 % 태아 소 혈청 (FBS)에서 4.5 x 106 세포 / 플라스크에서 12 T75 플라스크가 필요합니다.
- 세포가 형질감염 전에 37°C에서 밤새 자라도록 한다.
- 1.5 mL 감소 혈청 매체에 60 μL의 형질감염 시약을 희석한다. 각 플라스크에 대해 하나의 튜브를 준비합니다. RT에서 5분 간 배양합니다.
- 각 플라스크에 대해, 감소 된 혈청 매체 및 다음 플라스미드의 1.5 mL을 포함하는 튜브를 준비하십시오 : 관심유전자를 포함하는 전사 플라스미드 9.0 μg, RD114 의 3 μg 및 VSV-G 의 1.2 μg (봉투 플라스미드), 3 μg의 개그 / 폴.
참고 : 봉투와 개그 / 폴 유전자는 레트로 바이러스 포장에 필요합니다. 우리의 레트로 바이러스 생산을 위해, 우리는 RD114 봉투를 모두 추가하고, 안정성을 추가하기 위해, VSV-G 봉투의 소량. - 희석된 플라스미드(1.4단계)를 희석된 형질감염 시약에 첨가합니다(1.3단계). 부드럽게 섞으세요. 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 신선한 완전한 매체의 5 mL을 공급하고 플라스크 당 3 mL의 형질 감염 시약 / 플라스미드 혼합물을 드롭 와이즈를 추가하고 37 °C에서 5-6 시간 동안 배양합니다.
- 플라스크에 5 mL의 신선한 배지를 추가하고 37 °C에서 42-43 시간 동안 배양하십시오.
- 48h의 총 트랜스펙션 시간 후, 4°C에서 3분 동안 1282 x g에서 매체 및 원심분리기를 수집하여 세포 이물질을 제거하였다.
- Aliquot는 향후 사용을 위해 적절한 부피로, 플래시는 에탄올/드라이 아이스 욕조에서 바이러스를 동결시키고 -80°C에 보관하십시오.
2. 감마레트로바이러스 의역
참고: 유효한 적기를 얻기 위해 바이러스의 여러 희석이 필요할 수 있습니다.
- 600,000 개의 세포에서 플레이트 293T 세포를 6 웰 플레이트에서 잘 하고 37 °C에서 24 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
- 세포로부터 배지를 제거하고 원하는 양의 DMEM + 10% FBS를 293T(2 mL 총 바이러스 부피)에 첨가한다.
- 해당 잘에 바이러스를 추가하고 혼합 부드럽게 소용돌이. 예를 들어, 4개의 웰에 각각 200 μL, 100 μL, 50 μL 및 25 μL을 추가합니다. 유세포 분석(모의 샘플)에 대한 바이러스가 없는 웰을 포함합니다.
- 37 °C에서 48 시간 동안 배양하십시오.
- 트립신-EDTA 0.5 mL를 추가하고 37°C에서 4분 동안 인큐베이팅하여 293T 세포를 트립시니화합니다. DMEM 1.5 mL + 10% FBS를 추가하여 트립신을 막아주세요. 세포를 계산하고 자동화 된 세포 카운터 또는 혈세포계로 생존 가능성을 결정합니다.
- 셀 카운터를 사용하려면 10 μL의 셀을 trypan blue 10 μL에 넣고, 혼합하고, 챔버 슬라이드를 로드하고, 카운터에 삽입합니다. "캡처" 버튼을 눌러 셀을 계산합니다.
- 0.5-1 x 106 세포를 수집하고 유세포 측정에 의해 CAR 및 CXCR5 수준을 평가합니다(단계 9.5 참조). CXCR5와 함께 CD4 또는 MBL의 발현은 CAR 및 CXCR5를 공동 발현하는 293T 세포를 식별한다. 9.5.1단계에서 반응성 항체를 참조하십시오.
- 바이러스 성기를 계산합니다.
참고: 역가 계산을 위해 20% 이하의 트랜스덕션 레벨로 샘플을 선택합니다.- 다음 수식을 사용하여 적시를 계산합니다.
전율 단위/mL = (배양에 있는 세포의 수)(형화된 세포의 비율)/배양에 추가된 바이러스의 양
- 다음 수식을 사용하여 적시를 계산합니다.
3. 새로 생산된 바이러스 제제 및 관심 세포를 위한 최적의 MOI 결정
- 감마레트로바이러스 제제의 1차 PBMC 및 2중 희석과 함께 트랜스덕션 프로토콜(섹션 4-9)을 따르십시오.
- 유세포측정에 의한 관심 유전자의 발현 수준을 평가한다(단계 9.5).
- 세포 생존력의 손실없이 최대 전위를 허용하는 바이러스의 농도를 선택하십시오.
4. 항 CD3 항체로 웰 코팅으로 T 세포 활성화용 플레이트 준비
- 인산완충식염수(PBS)에서 스톡을 10 μg/mL로 희석하여 항마카크 CD3 항체(FN18)를 준비한다.
- 6웰 플레이트에 2 mL/웰을 분배합니다. 37°C에서 2시간 동안 배양하, 또는, 플레이트를 4°C에서 밤새 배양할 수 있다.
- PBS 및 언바운드 항체를 흡인한다. 2 mL의 PBS로 우물을 두 번 헹구고 즉시 PBMC플레이트에 사용하십시오.
5. 플레이트 바인딩 안티 CD3 및 용해성 안티 CD28로 Rhesus PBMC 자극
- 소량의 얼음이 남아있을 때까지 부드러운 교반으로 37 °C 수조에서 기본 rhesus PBMC를 해동하십시오.
- 후드에서 원유관으로 세포를 부드럽게 피펫합니다. 기본 배지 1 mL로 바이알을 헹구고 천천히 세포에 추가하십시오. 다음으로, 천천히 세포에 따뜻한 기본 배지의 9 mL를 추가합니다.
참고: 이 단계는 확장할 수 있지만 한 번에 4개 이상의 바이알을 해동하지 마십시오. - 600 x g에서 22°C에서 5분 동안 세포를 펠렛한다. 상급체를 흡인한 다음 소량의 성장 배지에서 펠릿을 다시 중단합니다. 최종 농도가 2 x 106 셀/mL이어야 하기 때문에 이 시점에서 세포의 농도가 2 x 106 셀/mL을 초과하도록 볼륨을 선택합니다.
- 트리판 블루로 세포를 염색하고 세포를 세어 실행 가능한 세포의 수를 결정한다.
참고 : 이것은 표준 혈전계 또는 자동화 된 세포 카운터로 수행 할 수 있습니다. 우리는 생존 력과 라이브 셀의 수를 표시하는 자동화 된 셀 카운터를 사용합니다.- 카운터를 사용하려면 10 μL trypan 파란색에 10 μL의 셀을 추가하고 챔버 슬라이드를 로드하고 카운터에 삽입하십시오. "캡처" 버튼을 눌러 셀을 계산합니다.
- 세포 농도를 부피로 곱하여 총 세포 수를 계산한 다음 성장 배지에서 세포를 2 x 10 6 셀/mL로 희석합니다.6 도금 전에 T 세포 활성화에 필요한 공동 자극 신호를 제공하기 위해 5 μg/mL의 최종 농도에 안티 CD28을 추가하십시오.
- 파이펫 세포를 안티 CD3 코팅 플레이트에 넣습니다. 웰당 3-6 x 106 개의 세포를 추가하고 (양호한 대상은 웰 당 2 mL 미디어에서 4 x 106 셀임) 5 %CO2에서37 °C에서 2 일 동안 배양하십시오.
6. 피브로넥틴 코팅 플레이트 준비
참고: PBMC 및 T 세포는 인테그린 수용체 VLA-4 또는 VLA-5를 발현하고 섬유넥틴 매개 전이에 대한 좋은 표적이다.
- 플레이트를 코팅하기 전에 먼저 멸균 PBS에서 1:100을 희석하여 피브로넥틴 시약을 준비합니다.
- 멸균 피브로넥틴 용액의 피펫 2 mL을 6웰 플레이트의 각 웰내로. 실온에서 2시간 동안 부드럽게 바위 접시를 바위.
참고: 비처리된 세포 배양 등급의 조직 배양 플레이트 또는 접시를 이 단계에서 사용해야 합니다. - 포부로 피브로넥틴 용액을 제거한 다음 PBS에서 멸균 2% 소 혈청 알부민(BSA, 분수 V)의 1 mL로 차단합니다. 접시를 실온에서 30 분 동안 흔들어.
- BSA 용액을 흡인하고 2 mL의 PBS로 플레이트를 세척합니다. PBS의 포부 후, 피브로넥틴 코팅 플레이트는 씰 랩으로 밀봉되고 최대 1주일 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
참고 : 우리는 일반적으로 변환 하기 전에 하루 접시를 준비 합니다.
7. 활성화 된 rhesus PBMC의 전이
주의: 바이러스 성 벡터 또는 rhesus 마카크 PBMC와 함께 작동하려면 실험실 코트 및 장갑의 이중 층 사용과 같은 적절한 안전 예방 조치를 활용해야합니다. 바이러스와 세포의 모든 처리는 생물 안전 후드에서 발생해야합니다. 모든 파이펫은 30 분 동안 10 % 표백제용액으로 오염제거되어야합니다. 모든 액체 전염성 폐기물은 10 % 표백제의 최종 농도로 오염되어야합니다. 미생물학적 에어로졸의 방출을 방지하는 씰이 있는 이차 봉쇄는 원심분리에 필요합니다.
- 감마레트로바이러스 트랜스듀싱 벡터를 피브로넥틴 코팅에 잘 부착한다.
- 원심분리기를 2000 x g에서 약 30분 동안 실행하여 32°C로 따뜻하게 한다.
- 37°C 수조에서 무혈청 및 생장 매체를 모두 따뜻하게 합니다.
- 소량의 얼음만 남을 때까지 얼음 이나 37 °C 수조에서 유리병을 부드럽게 소용돌이치면서 바이러스를 녹입니다. 바이러스 성 제제의 저하를 피하기 위해 내용이 따뜻해지지 않도록하십시오.
- 레트로바이러스를 혈청없는 배지에서 소정의 최적 감염(MOI)으로 희석한다.
참고 : 우리의 감마 레트로 바이러스와 rhesus PBMC로, 우리는 0.5의 MOI가 최적 것을 발견했다.- 예 희석: 바이러스로 4개의 웰을 코팅하고 1.5 x 106 세포를 추가하려면, (4)(1.5 x 10 6)(0.5) = 3 x 106 TU가 필요하다.6 바이러스 성 적시가 1.1 TU / mL인 경우 5.3 mL 미디어에서 2.7 mL 바이러스를 사용하여 총 부피 8 mL을 사용합니다.
- 피브로넥틴 코팅 플레이트의 각 웰에 2 mL 희석 된 레트로 바이러스를 추가합니다.
- 네거티브 컨트롤 모의 변환 된 세포의 경우, 섬유넥틴 코팅 된 우물에 단독으로 미디어를 추가하십시오.
- 미리 온난한 32°C 원심분리기에 바이오세이프 커버와 원심분리기를 2000 x g의 2000 x g의 마이크로플레이트 캐리어에 2시간 동안 놓습니다.
참고: 바이러스 코팅 플레이트는 밤새 4°C에서 바이러스와 함께 즉시 사용하거나 보관할 수 있습니다. - 즉각적인 사용을 위해, 우물에서 바이러스 제제를 흡인하고 성장 배지 2 mL를 추가하십시오. 바이러스 코팅 된 우물이 마르지 않도록하십시오.
- 자극된 PBMC를 플레이트.
- 반전된 현미경을 사용하여 세포를 확인합니다. 세포는 건강하게 보일 것이고, 이는 그들이 둥글고 밝고 굴절된 빛이라는 것을 의미합니다. 그(것)들은 또한 자극을 나타내는 응집된 외관을 보여주어야 합니다.
- 표적 세포를 수집하고 50 mL 원엽 튜브로 옮김. 1 mL 성장 매체로 우물을 한 번 헹구고 원엽 튜브에 추가하십시오. 5.4단계에서와 같이 자동화된 셀 카운터를 가진 살아있는 셀의 수를 계산합니다.
참고 : 자극 된 세포는 응집될 것이며이 응집은 세포를 정확하게 계산하는 데 어려움을 초래할 수 있습니다. - 32°C에서 5분 동안 600 x g에서 원심분리하여 튜브 내의 세포를 펠렛. 세포 펠릿으로부터 배지를 흡인하고 1.5 x 10 6 세포/mL의 농도로 성장 배지에서 세포를 재중단시켰다.6
- 각 바이러스 코팅웰(단계 7.1에서 제조)에 총 1.5 x 106 세포/3 mL에 대해 1 mL의 세포 현탁액을 추가한다. 각 우물은 이미 2 mL 성장 매체를 포함하고 있습니다. 모의 변환 된 세포에 대해 동일한 단계를 수행하지만 바이러스를받지 않은 섬유넥틴 코팅 된 우물위에 접시를 놓습니다.
- 32 °C에서 10 분 동안 1000 x g에서 플레이트를 원심 분리합니다.
- 5%CO2에서 37 °C에서 48 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
8. 형질 전환 된 세포의 확장
- 5 mL 파이펫으로 우물의 내용을 위아래로 그려 셀을 다시 일시 중단한 다음 50 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 합니다.
- 각 웰에 1 mL의 성장 매체를 추가하고 멸균 전달 파이펫으로 위아래로 그려 서착 세포를 제거합니다.
- 5.4단계에서와 같이 자동화된 셀 카운터를 사용하여 세포를 카운트하여 총 세포 수 및 생존 가능성을 결정합니다.
- 원하는 경우, 유전자 발현 및 표현형을 평가하기 위해 유세포 측정을 위해 1 x 106 세포를 제거하십시오. 권장 항체 및 게이팅 전략은 9.5.1 단계 및 재료 표를 참조하십시오.
- 25°C에서 10분 동안 600 x g에서 세포를 원심분리한다.
- 매미를 흡인하고 팽창 매체에서 세포를 1 x 10 6 셀/mL의 농도로 재중단한다.6 5 mL의 세포가있는 6 웰 플레이트의 각 가스 투과성 우물을 종자. 웰당 25mL의 확장 매체를 조심스럽게 레이어링합니다.
참고 : 우리는 작은 볼륨에 세포를 추가한 다음 셀이 우물의 바닥에 남아 있도록 나머지 미디어를 계층화합니다. - 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 방해받지 않고 세포를 4일 동안 배양한다.
9. 확장 된 세포의 수집 및 형질 전환 된 세포 집단의 표현형을 평가
- 20 mL 매체를 제거하고 폐기하여 가스 투과성 우물에서 셀을 수집합니다. 세포를 방해 하지 않도록 주의 해야 합니다.
참고 : 우리는 단지 4 일 동안 세포를 확장하고이 시점에서 세포를 수집합니다. 그러나, 배양의 추가 일 원하는 경우, 세포를 방해하지 않고 매체의 20 mL를 제거하고 신선한 팽창 매체의 20 mL로 대체하십시오. - 나머지 용지를 위아래로 피펫하여 셀을 빼내도록 합니다. 세포가 잘 성장하면 미디어는 매우 흐린해야합니다.
- 멸균 전사 파이펫을 사용하여 3 mL 매체로 각 우물을 헹구어 잔류 세포를 수집합니다.
- 자동 카운터 또는 혈독계로 세포를 계산하여 생존 가능성과 세포 번호를 확인합니다.
- 유세포 분석 수행하여 형질 전환된 유전자 발현 및 세포 표현형을 결정합니다.
- 이 예에서, 내인성 rhCD4 및 rhCD4-MBL CAR 둘 다에 반응하는 클론인 CD4(M-T477)에 대하여 지시된 항체를 사용하여 rhesus macaque PBMC 표현형을 결정; 총 T 세포와 CD8 T 세포를 각각 염색하는 CD3(SP34-2) 및 CD8(RPA-T8)에 대하여; 세포의 기억 표현형을 결정하는데 사용되는 CD95(DX2) 및 공동 자극 분자 CD28(CD28.2)에 대하여; CXCR5(MU5UBEE) 및 MBL(3E7)에 대항하여 CXCR5 및 CD4-MBL CAR를 트랜스듀싱 셀에서 검출한다.
- 생존가능성을 평가하여 고칠 수 있는 생존용 염료로 평가하였습니다.
- 유세포측정을 위해 세포를 준비합니다.
- 총 튜브 수에 대한 항체 마스터 믹스를 구성합니다. PBS를 사용하여 총 볼륨까지 가져옵니다.
- 튜브 흐름에 셀을 추가합니다. 튜브 당 0.5-1 x 106 개의 세포를 놓습니다. 얼룩이 없는 세포뿐만 아니라 염색된 모의 화질 전환 세포와 같은 부정적인 대조군을 포함합니다.
- 세포에 2 mL의 PBS를 추가하고 실온 (RT)에서 5 분 동안 400 x g의 원심 분리기를 넣고 데넌트에 넣습니다.
- 튜브에 100 μL의 항체 혼합물을 넣고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 2 mL의 PBS, 400 x g의 원심 분리기를 RT에서 5 분 동안 추가하고 데넌트에서.
- 1% 파라포름데히드 300 μL을 넣고 15분 동안 배양합니다.
- RT및 데센트에서 5 분 동안 400 x g의 원심 분리기. 300 μL의 PBS를 넣고 섞습니다.
- 유량 세포계에서 각 샘플에 대해 150,000개의 이벤트를 수집합니다.
- 흐름 분석 소프트웨어로 데이터를 분석합니다.
참고 : 게이팅 전략은 이전에20.- 형질전환 된 세포의 식별을 위해 림프구, 싱글 트, 라이브, CD3 +및 MBL + CXCR5 +에 대한 게이트 셀.
- 중앙 메모리 집단의 식별을 위해 림프구, 싱글, 라이브 CD3+, CD8+, CD28+ CD95+에 대한 게이트 셀.
- 필요에 따라 셀을 사용하십시오. 세포는 트랜스웰 이동 분석기9 또는 시험관내 세포 사멸5분석5,9와같은 기능의 시험관내 분석에 사용될 수 있다. 세포는 동물로 주입하는 데 사용할 수 있습니다. 또는, 90% FBS에 남아 있는 세포를 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 동결하여 나중에 사용하거나 분석합니다.
참고 : 비 인간 영장류에 입양 적으로 전달 된 세포의 주입을위한 대상 용량은 아직 확립되지 않았지만, 비 인간 영장류에서 출판 된 입양 전달 연구는 0.6 ~ 1.2 x 107 세포 / kg21,1 ~ 5 x 108 세포 / kg22 및 1.4 ~ 8 x 108 세포 / kg10을사용했습니다. 이 범위를 지침으로 사용하면이 9 일 프로토콜로 주입을위한 충분한 세포를 생성 할 수 있습니다.
Representative Results
세포 생산
이 출판물에 제시된 결과는 이전에 출판된 작업9,,20의결과와 유사합니다. 여기에 제시된 프로토콜을 활용하여, 우리는 일 5와 9 사이 세포의 적어도 8 배 확장을 기대합니다 (중앙값 11.1 배, 범위 8.7-13 배). 가스 투과성 웰은 5 x 106 세포의 시작 밀도에서 시드하였고, 4일 간의 성장 후, 웰당 55.6 x 106 셀의 중간 밀도를 달성하였다(범위 43.5-64.8 x 106)(그림 1A). Trypan Blue 제외를 가진 세포 계산은 세포가 프로토콜 전반에 걸쳐 높은 생존력을 유지한다는 것을 보여줍니다 (9 일 중앙값 85.8%, 범위 83-95%) (그림1B). 우리는 확장 하는 세포의 능력에 동물 가변성을 동물 찾을; 그러나, 1일에 50-100 x 106 세포의 시작 인구로, 우리는 1-2 x 108 세포/kg의 rhesus macaque 주입을 위한 충분한 세포를 생성하기 위하여 이 프로토콜을 이용했습니다.
형질전환된 유전자의 병용발현을 유세포분석으로모니터링하였다(도 2A). 이러한 확장 프로토콜의 5 일 및 9일 사이에 형질전환 된 세포의 표면에 CAR 및 CXCR5의 발현이 상대적으로 안정적이었다. 5일째에는 42.8%의 중앙값(범위 36.5-46.9%)이 세포의 CD4-MBL CAR와 CXCR5를 모두 시동하였고, 9일째에는 중간 발현이 47.6%(범위 44.5-64.5%)였다. 한 번의 변환으로 변환됩니다(그림2B). 일부 프로토콜은 두 번째 트랜스덕트(transduction)를 요구하지만, 프로토콜의 결론에 따라 총 트랜스듀렉트 셀의 관점에서 는 이점을 얻지 못했습니다(데이터는 표시되지 않음).
세포 표현형
트랜스듀백 세포는 그들의 기억 표현형을 모니터링하기 위해 유세포분석으로 분석하였다. 전과후, 순진한, 중앙 기억 및 이펙터 메모리 집단은 식별되지만(데이터는 도시되지 않음) 순진한 집단은 배양과 함께 손실되고 세포는 주로 5일째(그림3A)및 9일째(그림3B)에의해 확인된 바와 같이 중앙 기억 세포이다.+ + 이 급속한 transduction 및 확장 프로토콜의 사용은 주로 중앙 기억 세포인 세포를 생성하고 따라서 시험 동물로 주입될 때 증식하고 지속하기 위하여 확률이 높을 것입니다.
그림 1: 트랜스덕션 및 확장 프로토콜은 매우 실행 가능한 풍부한 트랜스듀렉션 셀을 생성합니다. (a)기체 투과용기에서 5일부터 9일까지 6마리의 상이한 동물로부터 형질전환세포의 팽창 및(B)동일한 6마리의 동물로부터 형질전환된 PBMC의 생존능. 자동 셀 카운터를 이용한 트라이판 블루 배제는 셀 번호 및 생존 가능성을 모니터링하는 데 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 형질전환 프로토콜은 두 개의 형질전환 된 유전자의 공동 발현을 유지하는 세포를 생성한다. (a)CD4-MBL CAR 및 CXCR5 둘 다의 발현을 입증하는 환전 및 팽창 프로토콜의 9일째에 rhesus PBMC의 대표적인 플로우 플롯. (B)유세포분석으로 측정된 배양물에서 5일과 9일에 6개의 상이한 동물로부터 형질전환된 rhesus PBMC상에서 CD4-MBL CAR 및 CXCR5의 발현. 게이트는 라이브, CD3+ 셀에 설정되었습니다. 트랜스듀싱셀은 MBL+ CXCR5+로 식별됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 9일 프로토콜에서 생성된 대부분의 세포는 중앙 메모리 표현형을 갖는다. 대표적인 유동 세포분석 플롯(A)5일차 및(B)9일째 CAR/CXCR5-변환 된 rhesus PBMC. 게이트는 라이브, CD3+, CD8+ 셀에 설정되었습니다. 중앙 메모리는 CD28+ CD95+로 정의되었습니다. 이펙터 메모리는 CD28-,CD95+로정의되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 항바이러스 CAR뿐만 아니라 여포 호밍 수용체인 CXCR5를 발현하는 T 세포 집단으로 이어지는 rhesus macaque PBMC를 변환하기 위해 감마레트로바이러스 벡터를 활용하는 T 세포 면역 요법 생산 전략을 설명합니다. 생체배양 시간의 총 8일로, 실행 가능한, 기능성 CAR T 세포는 전임상 효능 시험을 위해 비인간 영장류내로 주입하는 데 사용되는10,,21,,22 범위 내에 있는 양으로 생산된다.
전착 프로토콜의 성공은 건강하고 자극된 PBMC와 감마레트로바이러스의 품질 제제에 의존합니다. 성공적인 자극 및 전이를 달성하기 위해서는 수집 후 PBMC의 동결 및 수송에 적절한주의를 기울여야합니다. 이상적으로, 세포가 현장에서 수집되는 경우, 그들은 액체 질소로 출하되고 신속하게 장기 액체 질소 저장에 배치됩니다. 감마레트로바이러스에 의해 성공적으로 변환되려면 PBMC가 유사하게 활성화되어야 합니다. 하나는 안티 CD3 / 안티 CD28와 자극 후 세포의 클러스터링을 시각적으로 모니터링해야합니다. 제대로 활성화되지 않으면 전도 효율이 낮아집니다. 자극된 세포에서 생존 가능성을 모니터링하는 것도 중요합니다. 자극 단계 후 불쌍한 생존력은 일반적으로 덜 성공적인 형질전환으로 이어집니다. 바이러스 제제는 실험실에서 생산되든 아웃소싱이든 바이러스를 손상시키고 전도 효율을 손상시킬 수 있는 동결 해동 주기를 피하기 위해 일회용 aliquots에서 -80°C에 보관해야 합니다. 바이러스는 각 실험에서 일관된 양의 바이러스를 사용할 수 있도록 적시되어야 합니다. 전이에 바이러스를 사용할 때, 신속하게 바이러스를 해동하고 필요할 때까지 얼음에 저장. 프로모터, 인핸서 및 엔벨로프 단백질의 선택은 모두 표적 세포에서 의 형질전환 효율 및 이식유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 MOI는 경험적으로 결정되어야 합니다. 또한, 팽창을 위한 가스 투과성 웰을 가진 T 세포 및 플레이트를 지지하도록 설계된 매체의 사용은 형질전환 세포의 우수한 확장을 이끌었다. 그러나, 동물세포 팽창속도에서 동물가 변이성이 있다. 우리는 변환하고 확장하는 특정 세포 준비의 기능을 결정하기 위하여 예심 연구 결과 추천합니다. 확장 수준은 소규모 및 대규모 변환 모두에서 일관적입니다.
이 프로토콜의 사용으로, 우리는 시험 동물에 주입을 위한 2.5 x 109 세포까지 생성했습니다. 우리는 이 때 프로토콜을 확장하는 것이 불필요하다는 것을 것을을 발견했더라도, 6개의 웰 플레이트의 사용은 대규모 세포 준비에 제한이 있고 프로토콜은 더 많은 수의 세포를 생성하기 위하여 수정이 필요할 것입니다. 잠재적인 변형의 예로는 섬유넥틴 코팅 배양 백에서 형질전환을 수행하여 트랜스듀렉션된 세포의 수를 증가시키고 확장 단계에 대한 더 큰 가스 투과성 배양 용기를 활용하는 것이 포함한다. 아직 이러한 변경을 하지 는 않았지만 시판되는 제품을 활용하고 현재 프로토콜을 수정할 수 있습니다.
이 방법을 사용하여, 우리는 감염되지 않은 동물, SIV 감염 동물 및 항 레트로 바이러스 요법으로 치료된 SIV 감염 동물로부터 분리된 PBMC로부터 트랜스듀싱 된 세포를 생산했습니다(ART). 그러나, 우리는 ART 처리 된 세포(20)에서형광 효율의 감소를 지적했다. 이 감소는 아마도 약물에 의해 역 전사 체 및/또는 integrase의 억제 때문. ART 처리된 동물로부터세포의 환원은 PBMC를 수집하기 전에 또는 일반적으로 사용되는 ART 약물에 의해 영향을 받지 않는 대체 벡터의 사용을 통해 며칠 동안 ART를 중지시킴으로써 ART 약물의 세포내 수준을 감소시키는 것과 같은 이 프로토콜에 대한 수정을 요구할 것이다.
면역 요법을 위해 생산된 세포는 최소로 분화된 표현형이되어 주입 후12를지속하는 것이 중요합니다. 세포의 입양 전달을 위한 많은 프로토콜은 긴 배양 시간을 필요로 하지만, 감소된 생체 배양 시간은 CAR T 세포기능의감소 및 CAR T 세포 기능의 개선 모두와 상관관계가 있다. 이러한 감전 및 확장 프로토콜의 비교적 빠른 기간은 그들의 면역 치료 전위20의시험을 위한 충분한 세포를 여전히 생성하면서 원하는 중앙 기억 표현형의 유지를 허용한다.
이 T 세포 면역 요법 제품에 대한 생산 전략의 목표는 SIV 감염 세포를 인식하는 T 세포를 제조하는 것이며, B 세포 여포에서 바이러스 복제 부위로 트래픽을 유도하고 장기적으로 동물에서 지속될 것입니다. 항 레트로 바이러스 약물없이 기능성 치료. 인간 면역 요법 제품으로의 번역을 위해, 이 프로토콜은 인간 특이적 항체 및 사이토카인의 사용과 GMP 표준의 구현을 통해 인간 T 세포를 변환하기 위해 변형될 수 있으며, 이를 위한 기능적 치료법을 생산하는 궁극적인 목표 에이즈.
Disclosures
파멜라 스키너 박사는 마르팜 제약의 공동 창립자이자 최고 과학 책임자입니다.
Acknowledgments
본 연구는 NIH 보조금 5R01AI096966-06S1(PS, EC 및 EB), 1UM1AI26617(PS, EC, P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH 교부금 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A14 3380-01 (PS 및 EB), 1UM14126617 (PS 및 EC) 뿐만 아니라 교내 연구의 NIAID 부서와 NIH 교내 에이즈 표적 항 바이러스 프로그램에 의해 제공되는 자금. 이러한 연구에 사용된 항-CD3 및 항-CD28은 NIH 비인간 영장류 시약 자원(R24 OD010976, U24 AI126683)에 의해 제공되었다. 이러한 연구에서 사용되는 IL-2는 NCI 전임상 저장소에 의해 제공되었다. 이 CD4-MBL CAR/CXCR5 프로젝트의 협력자, 애리조나 대학의 엘리자베스 코닉 박사, NIH NIH의 에드워드 A 버거 박사, 위스콘신 국립 영장류 연구 센터의 에바 G 라카즈 박사, 위스콘신 국립 영장류 연구 센터의 에바 G 라카스 박사, 제프 하트 박사, 미네소타 대학의 제프 하트 박사, 미네소타 대학의 제프 하트 박사와 프레티 하란 박사, 미네소타 대학의 제프 하트 박사와 프레티 하란 박사, 애리조나 대학의 엘리자베스 코닉 박사, NIH, NIH, 박사 에바 G 라카즈 박사, 미네소타 대학의 제프 하트 박사와 프레티 하란 박사, 미네소타 대학의 하버드 대학의 제프 하트 박사와 프레티 하란 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 미네소타 대학의 스콧 맥아이버 박사, 프레드 허친슨 암 센터의 크리스토퍼 피터슨 박사, NIH의 매튜 트리벳 박사, 시애틀 아동 병원의 아그네 타라세비시우트 박사, 어린이 연구소의 콘래드 러셀 크루즈 박사에게 매우 도움이 되는 도움을 주었습니다. 또한 미네소타 대학교의 치판(Chi Phan) 씨와 조메리 알레그리아-베로칼(Jhomary Alegria-Berrocal) 씨가 감마레트로바이러스 생산을 위해, 위스콘신-매디슨 대학의 킴 바이스그라우(Kim Weisgrau) 씨가 rhesus macaque PBMC를 격리한 것에 대해 감사하게도 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
References
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