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Bioengineering

सेंट्रल मेमोरी फेनोटाइप के रखरखाव के साथ नौ दिनों में प्राथमिक टी कोशिकाओं का ट्रांसडक्शन और विस्तार

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60400
Automatic Translation
1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Summary

हम रीसस मकाक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के ट्रांसडक्शन और विस्तार के लिए 9 दिन के प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं जो कोशिका प्रभावकारिता के जलसेक अध्ययन के लिए पर्याप्त संख्या में ब्याज के जीन की उत्कृष्ट सह-अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं की पैदावार करते हैं।

Abstract

संक्रामक रोगों और कैंसर के इलाज के लिए उभरते इम्यूनोथेरपी में अक्सर रोग-लक्ष्यीकरण प्रोटीन को एन्कोडिंग जीन के साथ सेलुलर आबादी का ट्रांसड्यूक्शन शामिल होता है। उदाहरण के लिए, कैंसर और वायरल संक्रमणों के इलाज के लिए चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -टी कोशिकाओं में सिंथेटिक जीन के साथ टी कोशिकाओं का ट्रांसड्यूक्शन शामिल है जो कार के अणुओं को एन्कोडिंग करते हैं। कार के अणु टी कोशिकाओं को विशेष रूप से पहचानते हैं और कैंसर या वायरल संक्रमित कोशिकाओं को मारते हैं। कोशिकाओं को ब्याज के अन्य जीन के साथ भी सह-पार किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को जीन एन्कोडिंग प्रोटीन के साथ सह-पार किया जा सकता है जो कोशिकाओं को विशिष्ट स्थानों पर लक्षित करते हैं। यहां, हम प्राथमिक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) को स्थानांतरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें जीन वायरस-विशिष्ट कार और बी सेल कूप होमिंग अणु केमोकिन रिसेप्टर टाइप 5 (CXCR5) को एन्कोडिंग करते हैं। इस प्रक्रिया में नौ दिन लगते हैं और परिणामस्वरूप ट्रांसड्यूड टी सेल आबादी होती है जो एक केंद्रीय मेमोरी फेनोटाइप बनाए रखता है। एक केंद्रीय स्मृति या कम विभेदित फेनोटाइप के रखरखाव को जलसेक के बाद कोशिकाओं के हठ के साथ संबद्ध करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, इस विधि के साथ उत्पादित कोशिकाएं व्यवहार्यता के उच्च स्तर, दो ट्रांसड्यूड जीन की सह-अभिव्यक्ति के उच्च स्तर और इम्यूनोथेराप्यूटिक इन्फ्यूजन के लिए कोशिकाओं की बड़ी मात्रा दिखाती हैं। इस नौ दिन के प्रोटोकॉल मोटे तौर पर कार-टी सेल और अन्य टी सेल इम्यूनोथेरेपी दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां वर्णित विधियां हमारे पिछले प्रकाशनों में प्रस्तुत अध्ययनों पर आधारित हैं।

Introduction

सेलुलर इम्यूनोथेरपी कैंसर और संक्रामक रोगों सहित रोगों के इलाज के लिए एक नए साधन के रूप में उभर रहे हैं । इन इम्यूनोथेरेपी विधियों में अक्सर विशिष्ट अणुओं को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से चिकित्सीय कोशिकाओं में हेरफेर करना शामिल होता है। उदाहरण के लिए, चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाओं को एक कार अणु को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जाता है जिसमें एक बाह्य डोमेन होता है जो विशेष रूप से रोगग्रस्त कोशिकाओं पर अणुओं को बांधता है और एक सिग्नलिंग डोमेन जो रोगग्रस्त कोशिकाओं को मारने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्रिगर करता है। कैंसर इम्यूनोथेरपी में कार टी कोशिकाओं का सफलतापूर्वक उपयोग किया जा रहा है, और बी सेल ल्यूकेमिया1,2,2,3के इलाज में विशेष रूप से प्रभावी रहा है। एचआईवी जैसे वायरल संक्रमणों के इलाज के लिए कार-टी कोशिकाएं भी विकसित की जा रही हैं। एचआईवी विशिष्ट CARs वायरल संक्रमित कोशिकाओं4की सतह पर लिफाफा प्रोटीन लक्ष्य । इम्यूनोथेरप्यूटिक कोशिकाओं को विशिष्ट ऊतक स्थानों पर चिकित्सीय कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए होमिंग अणुओं को व्यक्त करने के लिए भी इंजीनियर किया जा सकता है। हमने वैक्टर विकसित किए हैं जो वायरस-विशिष्ट कार के साथ-साथ लिम्फोड कूप होमिंग अणु CXCR55दोनों को स्थानांतरित करते हैं।

मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) और सिमियन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एसआईवी) सहित कुछ वायरसों की वायरल प्रतिकृति, माध्यमिक लिम्फोइड ऊतकों6में बी सेल रोम के भीतर केंद्रित है। बी सेल रोम कुछ हद तक प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त साइटें हैं जिनमें वायरस-विशिष्ट सीटीएल का निम्न स्तर चल रहे वायरल प्रतिकृति7,,8की अनुमति देता है। इन कारणों से, सीएक्ससीआर5 की अभिव्यक्ति के माध्यम से कूप में एचआईवी/SIV-विशिष्ट टी कोशिकाओं को लक्षित करना वायरल रूप से संक्रमित कोशिकाओं9,,10के कूप जलाशय को समाप्त करने की रणनीति है । विशेष रूप से, हम CXCR5 सह अभिव्यक्ति के माध्यम से बी सेल रोम के लिए SIV विशिष्ट कार टी कोशिकाओं को लक्षित कर रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल में हम कार/सीएक्ससीआर5 को स्थानांतरित करने और चिकित्सीय जलसेक के लिए पर्याप्त मात्रा की कार/सीएक्ससीआर 5 टी कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए पीबीएमसी का विस्तार करने की विधि का वर्णन करते हैं । इन तरीकों के साथ स्थानांतरित कोशिकाएं एक केंद्रीय स्मृति फेनोटाइप बनाए रखते हैं। अध्ययनों से पता चला है कि केंद्रीय स्मृति टी कोशिकाओं और टी मेमोरी स्टेम कोशिकाओं जैसे कम विभेदित फेनोटाइप वाली कोशिकाएं11,,12से अधिक विभेदित कोशिकाओं की तुलना में बेहतर बनी हुई हैं। इसके अलावा, दत्तक रूप से स्थानांतरित कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए डिज़ाइन किए गए कई प्रोटोकॉलों में अपेक्षाकृत लंबी संस्कृति का समय होता है जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाएं अधिक विभेदित फेनोटाइप और कम दृढ़ता13होती हैं। इसके अलावा, रीसस मकाक14,,15 में लक्षित लिम्फोइड ऊतकों के बजाय फेफड़ों के भीतर जमा लंबी संस्कृति के समय के साथ दत्तक रूप से स्थानांतरित कोशिकाओं को स्थानांतरितकर दिया। हम यहां वर्णन और प्रदर्शन करने वाले तरीकों में, हम एक केंद्रीय स्मृति फेनोटाइप बनाए रखने वाली ट्रांसड्यूड टी कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए रीसस मकाक पीबीएमसी को तेजी से स्थानांतरित और विस्तारित करते हैं।

सीडी 4 और सीडी 8 टी दोनों कोशिकाएं हमारे इम्यूनोथेरेपी दृष्टिकोण में शामिल हैं। इस मिश्रित सेल आबादी को इसलिए चुना गया था क्योंकि, नैदानिक परीक्षणों में, सीडी 8 + टी सेल उत्पाद में सीडी 4 + टी कोशिकाओं की अनुपस्थिति को 16जारी रखने के लिए संचार सीडी 8 टी कोशिकाओं की विफलता के साथ सहसंबद्ध किया गया था। यहां वर्णित विधियां पीबीएमसी को एंटी-सीडी 3 और एंटी-सीडी28 एंटीबॉडी के साथ सक्रिय करके शुरू होती हैं जो टी सेल रिसेप्टर को शक्तिशाली रूप से उत्तेजित करते हैं और क्लोनल एनेर्गिक17,,18से बचने के लिए सह-उत्तेजक संकेत प्रदान करते हैं।

सक्रियण के बाद, कोशिकाओं को वायरस-विशिष्ट कार और लिम्फोइड होमिंग अणु CXCR5 को एन्कोडिंग करने वाले गैमारेट्रोवायरल वेक्टर के साथ स्थानांतरित किया जाता है। इसके बाद गैर-अनुयायी कोशिका प्रचार के लिए डिज़ाइन की गई प्लेटों का उपयोग करके ट्रांसड्यूड कोशिकाओं का विस्तार किया जाता है जिसमें आधार पर गैस पारगम्य झिल्ली होती है। यह झिल्ली गैस विनिमय को कुएं के नीचे की अनुमति देती है जिससे कोशिका का अस्तित्व बढ़ जाता है और पोषक तत्वों की उपलब्धता19हो जाती है । इन तरीकों का उपयोग करके, वीवो इन्फ्यूजन अध्ययनों के लिए 9 दिन की समय सीमा में पर्याप्त कार्यात्मक कोशिकाओं का उत्पादन किया जा सकता है। हालांकि यह प्रोटोकॉल रीसस मकाक टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने और विस्तार ित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसमें प्रजातियों-विशिष्ट सक्रिय एंटीबॉडी के मामूली संशोधन के साथ, इसका उपयोग अन्य प्रजातियों की कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है। ये तरीके हमारे पहले प्रकाशितअध्ययन9,20पर आधारित हैं .

Protocol

नोट: इस रीसस पीबीएमसी ट्रांसड्यूक्शन प्रोटोकॉल के लिए गैमारेट्रोवायरल वेक्टर के उपयोग की आवश्यकता होती है। ध्यान दें कि गैमारेट्रोवायरस को या तो लैब में तैयार किया जा सकता है या वायरल प्रोडक्शन कंपनी को आउटसोर्स किया जा सकता है। प्रयोगशाला में उत्पादन चरण 1 में उल्लिखित प्रोटोकॉल के साथ किया जा सकता है और वायरस को चरण 2 में उल्लिखित के रूप में titered किया जा सकता है। चाहे वायरस साइट पर या एक उत्पादन कंपनी द्वारा उत्पादित किया जाता है, एक MOI (संस्कृति में कोशिकाओं के लिए संक्रामक virions का अनुपात) निर्धारित किया जाना चाहिए, के रूप में 3 कदम में उल्लिखित, प्रत्येक नए उत्पादित वायरल तैयारी और ब्याज की कोशिकाओं के लिए ।

सावधानी: गैमारेट्रोवायरल वेक्टर या अन्य रेट्रोवायरल वेक्टर के साथ काम करने के लिए प्रयोगशाला कोट के उपयोग और दस्ताने की दोहरी परतों जैसी उचित सुरक्षा सावधानियों की आवश्यकता होती है। वायरस की सभी हैंडलिंग बायोसेफ्टी हुड में होनी चाहिए। सभी पिपेट्स को 30 मिन के लिए 10% ब्लीच के समाधान में दूषित किया जाना चाहिए। सभी तरल संक्रामक अपशिष्ट को 10% ब्लीच की अंतिम एकाग्रता के साथ दूषित किया जाना चाहिए। माध्यमिक रोकथाम, एक सील के साथ जो माइक्रोबायोलॉजिकल एयरोसोल की रिहाई को रोकता है, केंद्रीकरण के लिए आवश्यक है

1. गैमारेट्रोवाइरल स्टॉक का उत्पादन

  1. ट्रांसफेक्शन के लिए प्लेट 293T कोशिकाएं। एक पूर्ण वायरस तैयार करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) में ४.५ x १०६ कोशिकाओं/फ्लास्क पर 12 T75 फ्लैक्स की आवश्यकता होती है ।
  2. कोशिकाओं को ट्रांसफेक्शन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें।
  3. 1.5 mL में ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के 60 माइक्रोन को पतला करें सीरम मीडिया को कम कर दिया। प्रत्येक फ्लास्क के लिए एक ट्यूब तैयार करें। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. प्रत्येक फ्लास्क के लिए, कम सीरम मीडिया और निम्नलिखित प्लाज्मिड के 1.5 mL वाली ट्यूब तैयार करें: 9.0 माइक्रोन ऑफ ए ट्रांसफर प्लाज्मिड जिसमें जीन (एस) ब्याज, RD114 का 3 μg और VSV-G (लिफाफा प्लाज्मिड) का 1.2 μg, और 3 μg गैग/पीओएल।
    नोट: रेट्रोवायरल पैकेजिंग के लिए लिफाफा और झूठ/पोल जीन की जरूरत है । हमारे रेट्रोवायरल उत्पादन के लिए, हम दोनों RD114 लिफाफा जोड़ते हैं और, अतिरिक्त स्थिरता के लिए, वीएसवी-जी लिफाफे की एक छोटी राशि।
  5. पतला ट्रांसफेक्शन रिएजेंट (चरण 1.3) में पतला प्लाज्मिड (चरण 1.4) जोड़ें। धीरे-धीरे मिलाएं। कमरे के तापमान पर 20 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
  6. कोशिकाओं को ताजा पूर्ण मीडिया की 5 किलोएल खिलाएं और ट्रांसफेक्शन रिएजेंट/प्लाज्मिड मिश्रण ड्रॉपवाइज प्रति फ्लास्क के 3 किलोल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-6 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. फ्लास्क में ताजा माध्यम का अतिरिक्त 5 mL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 42-43 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. 48 घंटे के कुल ट्रांसफेक्शन समय के बाद, सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिन के लिए 1282 x ग्राम पर मीडिया और अपकेंद्री एकत्र करें।
  9. भविष्य के उपयोग के लिए उपयुक्त मात्रा में Aliquot, फ्लैश एक इथेनॉल में वायरस फ्रीज/

2. गैमारेट्रोवायरस को टिटरिंग

नोट: एक वैध टिटर प्राप्त करने के लिए वायरस के कई कमजोर होने की आवश्यकता हो सकती है।

  1. प्लेट 293T कोशिकाएं 6-कूप प्लेट में 600,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से प्लेट ें और प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. कोशिकाओं से माध्यम निकालें और 293T (वायरस की 2 mL कुल मात्रा) के लिए DMEM + 10% FBS की वांछित राशि जोड़ें ।
  3. इसी में वायरस को अच्छी तरह से जोड़ें और मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे घूमता है। उदाहरण के लिए, 4 कुओं में क्रमश 200 माइक्रोन, 100 माइक्रोन, 50 माइक्रोन और 25 माइक्रोन जोड़ें। फ्लो साइटोमेट्री (मॉक सैंपल) के लिए वायरस के बिना एक अच्छी तरह से शामिल करें।
  4. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  5. ट्रिप्सिन्टिन-ईडीटीए के 0.5 मिलील को जोड़कर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिन के लिए इनक्यूबेटिंग करके 293T कोशिकाओं को प्रभावित करें। डीएमईएम + 10% एफबीएस के 1.5 mL जोड़कर ट्राइप्सिन को रोकें। कोशिकाओं की गणना करें और एक स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर के साथ व्यवहार्यता निर्धारित करें।
    1. सेल काउंटर का उपयोग करने के लिए, ट्राइपैन नीले रंग के 10 माइक्रोन में कोशिकाओं के 10 माइक्रोन जोड़ें, मिश्रण करें, कक्ष स्लाइड लोड करें, और काउंटर में डालें। कोशिकाओं को गिनने के लिए "कैप्चर" बटन पुश करें।
  6. 0.5-1 x 106 कोशिकाओं को इकट्ठा करें और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कार और सीएक्ससीआर 5 के स्तर का मूल्यांकन करें (चरण 9.5 देखें)। CXCR5 के साथ CD4 या एमबीएल की अभिव्यक्ति कार और CXCR5 को सह-व्यक्त करने वाली ट्रांसड्यूड 293T कोशिकाओं की पहचान करेगी। चरण 9.5.1 में प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी देखें।
  7. वायरल टिटर की गणना करें।
    नोट: टिटर की गणना के लिए 20% या उससे कम के ट्रांसड्यूक्शन स्तर के साथ नमूना चुनें।
    1. टिटर की गणना करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:
      ट्रांसड्यूक्शन यूनिट/एमएल = (संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या) (कोशिकाओं का% ट्रांसड्यूड)/वायरस की मात्रा संस्कृति में जोड़ा

3. एक नए उत्पादित वायरल तैयारी और ब्याज की कोशिकाओं के लिए इष्टतम MOI का निर्धारण

  1. प्राथमिक पीबीएमसी और गैमारेट्रोवायरल तैयारी के दो गुना कमजोर होने के साथ ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल (सेक्शन 4-9) का पालन करें।
  2. प्रवाह साइटोमेट्री (चरण 9.5) द्वारा ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करें।
  3. वायरस की एकाग्रता चुनें जो कोशिका व्यवहार्यता के नुकसान के बिना अधिकतम ट्रांसड्यूक्शन की अनुमति देता है।

4. एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी के साथ कोटिंग वेल्स द्वारा टी सेल एक्टिवेशन के लिए प्लेटें तैयार करना

  1. फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) में स्टॉक को 10 μg/mL तक कमजोर करके एंटी-मकाक सीडी3 एंटीबॉडी (FN18) तैयार करें ।
  2. 6-कूकर प्लेटों में 2 mL/well बांटें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट वैकल्पिक रूप से, प्लेटों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जा सकता है।
  3. पीबीएस और अनबाउंड एंटीबॉडी को एस्पिरेट करें। पीबीएस के 2 mL के साथ दो बार कुओं कुल्ला और तुरंत उपयोग करने के लिए पीबीएस प्लेट ।

5. प्लेट-बाउंड एंटी-सीडी 3 और घुलनशील एंटी-सीडी28 के साथ रीसस पीबीएमसी को उत्तेजित करना

  1. 37 डिग्री सेल्सियस वाटरबाथ में एक 37 डिग्री सेल्सियस वाटरबाथ में गल प्राथमिक रीसस पीबीएमसी, कोमल आंदोलन के साथ, जब तक कि बर्फ की सिर्फ एक छोटी राशि नहीं रहती है।
  2. हुड में, धीरे-धीरे कोशिकाओं को शंकुट्यूब में पिपेट करें। बुनियादी माध्यम के 1 mL के साथ शीशी कुल्ला और कोशिकाओं के लिए धीरे-धीरे जोड़ें। इसके बाद, धीरे-धीरे कोशिकाओं में गर्म बुनियादी माध्यम का एक अतिरिक्त 9 mL जोड़ें।
    नोट: इस कदम को बढ़ाया जा सकता है, लेकिन एक समय में 4 से अधिक शीशियों गल कभी नहीं ।
  3. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 600 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। अधिनायक को एस्पिरेट करें और फिर छोटी मात्रा में विकास माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें। एक मात्रा चुनें कि कोशिकाओं की एकाग्रता इस बिंदु पर 2 x 106 कोशिकाओं/mL से अधिक हो जाएगी क्योंकि अंतिम एकाग्रता 2 x 106 कोशिकाओं/mL होनी चाहिए ।
  4. ट्राइपैन नीले रंग के साथ दाग कोशिकाओं और व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की गिनती।
    नोट: यह एक मानक हीमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ किया जा सकता है। हम एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करते हैं जो लाइव कोशिकाओं की व्यवहार्यता और संख्या प्रदर्शित करता है।
    1. काउंटर का उपयोग करने के लिए, 10 μL ट्राइपैन नीले रंग में कोशिकाओं के 10 μL जोड़ें, मिश्रण, कक्ष स्लाइड लोड और काउंटर में डालें । कोशिकाओं को गिनने के लिए "कैप्चर" बटन पुश करें।
  5. मात्रा द्वारा कोशिका एकाग्रता गुणा करके कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें और फिर कोशिकाओं को विकास माध्यम में 2 x 106 कोशिकाओं/mL तक पतला करें । चढ़ाना से पहले, टी सेल सक्रियण के लिए एक आवश्यक सह-उत्तेजक संकेत प्रदान करने के लिए 5 μg/mL की अंतिम एकाग्रता में एंटी-सीडी28 जोड़ें।
  6. एंटी-सीडी 3 लेपित प्लेटों में पिपेट कोशिकाएं। 3-6 x 106 कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से जोड़ें (एक अच्छा लक्ष्य 2 mL मीडिया प्रति अच्छी तरह से 4 x 106 कोशिकाओं है) और 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट।

6. फिब्रोनेक्टिन-कोटेड प्लेटें तैयार करना

नोट: पीबीएमसी और टी कोशिकाएं पूर्णांक रिसेप्टर्स वीएलए-4 या वीएलए-5 व्यक्त करती हैं और फाइब्रोनेक्टिन-मध्यस्थता ट्रांसड्यूक्शन के लिए अच्छे लक्ष्य हैं।

  1. प्लेटों को कोटिंग करने से पहले, पहले बाँझ पीबीएस में 1:100 को कमजोर करके फाइब्रोनेक्टिन रिएजेंट तैयार करें।
  2. 6-अच्छी तरह की प्लेट के प्रत्येक कुएं में बाँझ फाइब्रोनेक्टिन समाधान का पिपेट 2 एमएल। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए धीरे रॉक प्लेटें।
    नोट: गैर इलाज, सेल संस्कृति ग्रेड ऊतक संस्कृति प्लेटों या व्यंजन इस कदम में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  3. आकांक्षा द्वारा फाइब्रोनेक्टिन समाधान निकालें और फिर पीबीएस में बाँझ 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए, अंश वी) के 1 mL के साथ ब्लॉक करें। 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों रॉक।
  4. बीएसए समाधान को एस्पिरेट करें और प्लेट को पीबीएस के 2 एमएल से धोएं। पीबीएस की आकांक्षा के बाद, फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड प्लेटों को सील रैप के साथ सील किया जा सकता है और एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: हम आमतौर पर ट्रांसड्यूक्शन से एक दिन पहले प्लेटें तैयार करते हैं।

7. सक्रिय रीसस पीबीएमसी का ट्रांसड्यूक्शन

सावधानी: वायरल वेक्टर के साथ या रीसस मकाक पीबीएमसी के साथ काम करने के लिए प्रयोगशाला कोट के उपयोग और दस्ताने की दोहरी परतों जैसे उचित सुरक्षा सावधानियों के उपयोग की आवश्यकता होती है। वायरस और कोशिकाओं की सभी हैंडलिंग जैव सुरक्षा हुड में होना चाहिए। सभी पिपेट्स को 30 मिन के लिए 10% ब्लीच के समाधान में दूषित किया जाना चाहिए। सभी तरल संक्रामक अपशिष्ट को 10% ब्लीच की अंतिम एकाग्रता के साथ दूषित किया जाना चाहिए। माइक्रोबायोलॉजिकल एयरोसोल की रिहाई को रोकता है कि एक मुहर के साथ माध्यमिक रोकथाम, केंद्रीकरण के लिए आवश्यक है।

  1. गैमारेट्रोवाइरल ट्रांसड्यूसिंग वेक्टर को फाइब्रोनेक्टिन-लेपित कुएं में अटैच करें।
    1. लगभग 30 00 x ग्राम पर चलने से 32 डिग्री सेल्सियस तक एक अपकेंद्रित्र गर्म करें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस वाटरबाथ में सीरम मुक्त और विकास मीडिया दोनों गर्म करें।
    3. बर्फ पर वायरस गल या धीरे से एक ३७ डिग्री सेल्सियस वाटरबाथ में शीशी घूमता द्वारा जब तक बर्फ की केवल कम मात्रा में रहता है । वायरल तैयारी के क्षरण से बचने के लिए, सामग्री को गर्म न होने दें।
    4. सीरम-मुक्त माध्यम में संक्रमण (एमओआई) की पूर्व निर्धारित इष्टतम बहुलता के लिए रेट्रोवायरस को पतला करें।
      नोट: हमारे गामारेट्रोवायरस और रीसस पीबीएमसी के साथ, हमने पाया है कि 0.5 का एमओआई इष्टतम है।
      1. उदाहरण कमजोर पड़ने के लिए: वायरस के साथ 4 कुओं को कोट करने और 1.5 x 106 कोशिकाओं को जोड़ने के लिए, (4) (1.5 x 106)(0.5) = 3 x 106 टीयू की आवश्यकता है। यदि वायरल टिटर 1.1 टीयू/एमएल है, तो 8 मीटर की कुल मात्रा के लिए 5.3 mL मीडिया में 2.7 mL वायरस का उपयोग करें।
    5. फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड प्लेट के प्रत्येक कुएं में 2 मिलीएम पतला रेट्रोवायरस जोड़ें।
    6. नकारात्मक नियंत्रण नकली-ट्रांसड्यूड कोशिकाओं के लिए, फाइब्रोनेक्टिन-लेपित कुओं में अकेले मीडिया जोड़ें।
    7. माइक्रोप्लेट वाहकों में प्लेटों को 2 घंटे के लिए 2000 x ग्राम पर बायोसेफ कवर और अपकेंद्री के साथ प्री-गर्म 32 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्री में रखें।
      नोट: वायरस लेपित प्लेटों का उपयोग तुरंत या संग्रहीत किया जा सकता है, वायरस के साथ, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    8. तत्काल उपयोग के लिए, कुओं से वायरस तैयार करने को एस्पिरेट करें और विकास माध्यम के 2 मिलील जोड़ें। वायरस कोटेड कुओं को सूखने से रखें।
  2. उत्तेजित पीबीएमसी प्लेट।
    1. उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की जांच करें। कोशिकाओं को स्वस्थ दिखना चाहिए, जिसका अर्थ है कि वे गोल, उज्ज्वल और अपवर्तित प्रकाश हैं। उन्हें उत्तेजना का संकेत देने वाली एक झुरमुट उपस्थिति भी दिखानी चाहिए।
    2. लक्ष्य कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें 50 मीटर शंकुट्यूब पर स्थानांतरित करें। 1 mL विकास मीडिया के साथ एक बार अच्छी तरह से कुल्ला और शंकुट्यूब में जोड़ें। कदम 5.4 में के रूप में स्वचालित सेल काउंटर के साथ रहने वाले कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
      नोट: उत्तेजित कोशिकाओं clumped हो जाएगा और इस clumping सही कोशिकाओं की गिनती में कठिनाइयों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
    3. 32 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 600 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा ट्यूबों में कोशिकाओं को गोली मार। सेल पैलेट से मीडिया को एस्पिरेट करें और विकास माध्यम में कोशिकाओं को १.५ x १०६ कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर फिर से निलंबित करें ।
    4. प्रत्येक वायरस-लेपित अच्छी तरह से (चरण 7.1 में तैयार) कुल 1.5 x 106 कोशिकाओं/3 mL के लिए सेल निलंबन का 1 मिलील जोड़ें। ध्यान दें कि प्रत्येक अच्छी तरह से पहले से ही 2 mL विकास माध्यम शामिल है। नकली-ट्रांसड्यूड कोशिकाओं के लिए एक ही कदम करें लेकिन उन्हें फाइब्रोनेक्टिन-लेपित कुओं पर प्लेट करें जिन्हें कोई वायरस नहीं मिला।
    5. 32 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 1000 x ग्राम पर प्लेटों को सेंट्रलाइज करें।
    6. 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें ।

8. ट्रांसड्यूड कोशिकाओं का विस्तार

  1. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और फिर 50 मीटर शंकुई ट्यूब पर स्थानांतरित करने के लिए 5 मीटर पाइप के साथ कुओं की सामग्री को ऊपर और नीचे खींचें।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से विकास मीडिया के 1 mL जोड़ें और अनुयायी कोशिकाओं को हटाने के लिए एक बाँझ हस्तांतरण पाइप के साथ ऊपर और नीचे आकर्षित ।
  3. कुल सेल संख्या और व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए कोशिकाओं की गणना चरण 5.4 में एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके।
  4. यदि वांछित हो, तो जीन अभिव्यक्ति और फेनोटाइप का आकलन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के लिए 1 x 106 कोशिकाओं को हटा दें। अनुशंसित एंटीबॉडी और गेटिंग रणनीति के लिए चरण 9.5.1 और सामग्री की तालिका देखें।
  5. 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 600 x ग्राम पर कोशिकाओं को केंद्रित करें।
  6. मीडिया को एस्पिरेट करें और विस्तार मीडिया में कोशिकाओं को 1 x 106 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं के 5 mL के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक गैस परगम्य अच्छी तरह से बीज । ध्यान से प्रति अच्छी तरह से विस्तार मीडिया के एक अतिरिक्त 25 mL परत ।
    नोट: हम कोशिकाओं को एक छोटी मात्रा में जोड़ते हैं और फिर शेष मीडिया परत करते हैं ताकि कोशिकाएं कुएं के नीचे बनी रहें।
  7. 4 दिनों के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर अव्यवस्थित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

9. विस्तारित कोशिकाओं का संग्रह और ट्रांसड्यूड सेल आबादी के फेनोटाइप का मूल्यांकन

  1. 20 मीटर मीडिया को हटाकर और त्यागकर गैस परगम्य कुओं से कोशिकाओं को इकट्ठा करें। कोशिकाओं को परेशान न करने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए।
    नोट: हम केवल 4 दिनों के लिए कोशिकाओं का विस्तार और इस बिंदु पर कोशिकाओं को इकट्ठा । हालांकि, यदि संस्कृति के अतिरिक्त दिन वांछित हैं, तो कोशिकाओं को परेशान किए बिना मीडिया के 20 मिलील को हटा दें और इसे ताजा विस्तार मीडिया के 20 मिलील से बदल ें।
  2. कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए शेष मीडिया को ऊपर और नीचे पिलेट करें। यदि कोशिकाएं अच्छी तरह से बढ़ी हैं तो मीडिया में बहुत बादल छाए रहने चाहिए ।
  3. बाँझ हस्तांतरण पाइप का उपयोग करना, किसी भी अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 3 mL मीडिया के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला।
  4. व्यवहार्यता और सेल नंबर की जांच करने के लिए स्वचालित काउंटर या हीमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
  5. ट्रांसड्यूड जीन अभिव्यक्ति और सेल फेनोटाइप निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री करें।
    1. इस उदाहरण में, सीडी 4 (एम-टी477) के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करके रीसस मकाक पीबीएमसी फेनोटाइप निर्धारित करें, एक क्लोन जो एंडोजेनस आरसीडी 4 और आरसीडी4-एमबीएल कार दोनों के साथ प्रतिक्रियाशील है; सीडी 3 (SP34-2) और सीडी 8 (आरपीए-T8) के खिलाफ जो क्रमशः कुल टी कोशिकाओं और सीडी 8 टी कोशिकाओं को दाग; डेथ रिसेप्टर सीडी95 (डीएक्स2) और सह-उत्तेजक अणु सीडी28 (सीडी28.2) के खिलाफ जिसका उपयोग कोशिकाओं की स्मृति फेनोटाइप निर्धारित करने के लिए किया जाता है; और CXCR5 (MU5UBEE) और एमबीएल (3E7) के खिलाफ ट्रांसड्यूड कोशिकाओं पर CXCR5 और सीडी4-एमबीएल कार का पता लगाने के लिए ।
    2. एक स्थिर व्यवहार्यता रंग के साथ व्यवहार्यता का आकलन किया गया था ।
    3. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं को तैयार करें।
      1. ट्यूबों की कुल संख्या के लिए एक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण बनाओ। पीबीएस का उपयोग करके कुल मात्रा तक लाएं।
      2. ट्यूब प्रवाह करने के लिए कोशिकाओं को जोड़ें। प्रति ट्यूब 0.5-1 x 106 कोशिकाओं को रखें। इस तरह के अनदाग कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दाग नकली ट्रांसड्यू कोशिकाओं के रूप में नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं ।
      3. कोशिकाओं में पीबीएस के 2 mL जोड़ें, कमरे के तापमान (आरटी) और decant पर 5 मिन के लिए ४०० x ग्राम पर अपकेंद्री ।
      4. ट्यूबों में एंटीबॉडी मिक्स के 100 माइक्रोन जोड़ें और आरटी में 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
      5. पीबीएस के 2 mL जोड़ें, आरटी और decant पर 5 मिन के लिए ४०० x ग्राम पर अपकेंद्री ।
      6. 1% पैराफॉर्मलडिहाइड के 300 माइक्रोन जोड़ें और 15 मिन के लिए इनक्यूबेट।
      7. आरटी और डेक्वेंट में 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। पीबीएस और मिक्स के 300 माइक्रोन जोड़ें।
    4. एक प्रवाह साइटोमीटर पर, प्रत्येक नमूने के लिए 150,000 घटनाओं का अधिग्रहण।
    5. फ्लो एनालिसिस सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण करें।
      नोट: गेटिंग रणनीति पहले20प्रकाशित किया गया था ।
      1. ट्रांसड्यूड कोशिकाओं की पहचान के लिए, लिम्फोसाइट्स, सिंगल्स, लाइव, सीडी3 +और एमबीएल +CXCR5 + पर गेट कोशिकाएं।
      2. केंद्रीय स्मृति आबादी की पहचान के लिए, लिम्फोसाइट्स, सिंगलेट, लाइव सीडी 3 +, सीडी8 +, सीडी 28 + सीडी95 + पर गेट कोशिकाएं।
  6. जरूरत के अनुसार कोशिकाओं का उपयोग करें। कोशिकाओं का उपयोग फ़ंक्शन के इन विट्रो परखों के लिए किया जा सकता है, जैसे ट्रांसवेल माइग्रेशन परख9 या इन विट्रो सेल हत्या परख5,,9। कोशिकाओं को जानवरों में जलसेक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, बाद में उपयोग या विश्लेषण के लिए 10% डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (DMSO) के साथ 90% एफबीएस में किसी भी शेष कोशिकाओं को फ्रीज करें
    नोट: जबकि एक रीसस मकाक में दत्तक स्थानांतरित कोशिकाओं के अर्क के लिए एक लक्ष्य खुराक अभी तक स्थापित नहीं है, गैर मानव वानरों में दत्तक हस्तांतरण अध्ययन प्रकाशित ०.६ से १.२ x १०७ कोशिकाओं/किलो21,1 से 5 x 108 कोशिकाओं/किलो22 और १.४ से 8 x 108 कोशिकाओं/किलो10का इस्तेमाल किया है । एक दिशानिर्देश के रूप में इस सीमा के साथ, जलसेक के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को इस 9 दिन के प्रोटोकॉल के साथ उत्पादित किया जा सकता है।

Representative Results

सेल उत्पादन
इस प्रकाशन में प्रस्तुत परिणाम हमारे पहले प्रकाशित कार्य9,20में उन लोगों के समान हैं . यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम 5 और 9 दिनों (औसत 11.1 गुना, सीमा 8.7-13 गुना) के बीच कोशिकाओं के कम से कम 8 गुना विस्तार की उम्मीद करते हैं। गैस परगम्य कुओं को 5 x 106 कोशिकाओं के शुरुआती घनत्व पर वरीयता दी गई थी और 4 दिनों के विकास के बाद, हमने प्रति अच्छी तरह से 55.6 x 106 कोशिकाओं (रेंज 43.5-64.8 x 106)(चित्र ा 1ए)का औसत घनत्व हासिल किया। Tripan ब्लू बहिष्कार के साथ सेल गिनती से पता चलता है कि कोशिकाओं प्रोटोकॉल भर में उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने (दिन 9 औसत 85.8%, रेंज 83-95%) (चित्रा 1बी)। हम कोशिकाओं का विस्तार करने की क्षमता में पशु परिवर्तनशीलता के लिए पशु पाते हैं; हालांकि, 1 दिन 50-100 x 106 कोशिकाओं की शुरुआती आबादी के साथ, हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग 1-2 x 108 कोशिकाओं/किलोग्राम के रीसस मकाक अर्क के लिए पर्याप्त कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए किया है।

ट्रांसड्यूड जीन की सह-अभिव्यक्ति प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 2ए)के साथ निगरानी की गई थी। ट्रांसड्यूड कोशिकाओं की सतह पर कार और CXCR5 की अभिव्यक्ति इस विस्तार प्रोटोकॉल के 5 और 9 दिनों के बीच अपेक्षाकृत स्थिर थी। 5 दिन, 42.8% की औसत (सीमा 36.5-46.9%) कोशिकाओं में से सीडी 4-एमबीएल कार और सीएक्ससीआर5 दोनों के साथ ट्रांसड्यू किया गया था, जबकि 9 दिन, औसत अभिव्यक्ति 47.6% थी (रेंज 44.5-64.5%) ट्रांसड्यूक्शन के एक दौर के साथ(चित्रा 2बी)। हालांकि कुछ प्रोटोकॉल ट्रांसड्यूक्शन के दूसरे दौर के लिए कहते हैं, हमने प्रोटोकॉल (डेटा नहीं दिखाया गया) के समापन पर कुल ट्रांसड्यूड कोशिकाओं के संदर्भ में लाभ नहीं देखा है।

सेल फेनोटाइप
ट्रांसड्यूड कोशिकाओं का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनकी मेमोरी फेनोटाइप की निगरानी के लिए किया गया था। ट्रांसड्यूक्शन और विस्तार से पहले, भोली, केंद्रीय स्मृति और प्रभावक स्मृति आबादी की पहचान की जाती है (डेटा नहीं दिखाया गया है) लेकिन भोली आबादी को कुल प्रचार के साथ खो दिया जाता है और कोशिकाएं मुख्य रूप से 5 दिन(चित्रा 3ए)और दिन 9(चित्रा 3बी)द्वारा केंद्रीय स्मृति कोशिकाएं हैं, जैसा कि CD95+ CD28+ अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना जाता है। इस तेजी से ट्रांसड्यूक्शन और विस्तार प्रोटोकॉल के उपयोग ने कोशिकाओं का उत्पादन किया है जो मुख्य रूप से केंद्रीय स्मृति कोशिकाएं हैं और इस प्रकार परीक्षण जानवर में संचार होने पर पैदा होने और बने रहने की अधिक संभावना होगी।

Figure 1
चित्रा 1: ट्रांसड्यूक्शन और विस्तार प्रोटोकॉल प्रचुर मात्रा में ट्रांसड्यूड कोशिकाओं का उत्पादन करता है जो अत्यधिक व्यवहार्य हैं। (क)गैस पारगम्य जहाजों में 5 से 9 दिनों तक 6 विभिन्न जानवरों से ट्रांसड्यूड कोशिकाओं का विस्तार औरएकही 6 जानवरों से ट्रांसड्यूड पीबीएमसी की व्यवहार्यता । एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर Tripan नीले बहिष्कार सेल संख्या और व्यवहार्यता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ट्रांसड्यूक्शन प्रोटोकॉल कोशिकाओं का उत्पादन करता है जो दो ट्रांसड्यूड जीन की सह-अभिव्यक्ति बनाए रखते हैं। (A)सीडी 4-एमबीएल कार और सीएक्ससीआर5 दोनों की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करते हुए ट्रांसड्यूक्शन और विस्तार प्रोटोकॉल के 9 दिन रीसस पीबीएमसी का एक प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड। (ख)फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापा गया संस्कृति में 5 और 9 दिनों में 6 विभिन्न जानवरों से सीडी4-एमबीएल कार और सीएक्ससीआर5 की अभिव्यक्ति। गेट्स लाइव, CD3+ कोशिकाओं पर स्थापित किए गए थे। ट्रांसड्यूड कोशिकाओं की पहचान एमबीएल+ सीएक्ससीआर5+के रूप में की जाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 9 दिन के प्रोटोकॉल में उत्पादित अधिकांश कोशिकाओं में एक केंद्रीय मेमोरी फेनोटाइप होता है। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंड(ए)दिन 5 और(बी)दिन 9 कार/CXCR5-ट्रांसड्यूड रीसस पीबीएमसी । गेट्स लाइव, CD3+,CD8+ कोशिकाओं पर स्थापित किए गए थे। केंद्रीय स्मृति को CD28+ CD95+के रूप में परिभाषित किया गया था । इफेक्टर मेमोरी को सीडी28-CD95+के रूप में परिभाषित किया गया था . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल एक टी सेल इम्यूनोथेरेपी उत्पादन रणनीति की रूपरेखा तैयार करता है जो रीसस मकाक पीबीएमसी को ट्रांसड्यू करने के लिए गैमारेट्रोवायरल वेक्टर का उपयोग करता है जो टी सेल आबादी के लिए अग्रणी है जो एक एंटीवायरल कार के साथ-साथ कूप होमिंग रिसेप्टर, सीएक्ससीआर 5 को व्यक्त करता है। पूर्व वीवो संस्कृति समय के कुल 8 दिनों के साथ, व्यवहार्य, कार्यात्मक कार टी कोशिकाओं को एक मात्रा में उत्पादित किया जाता है जो प्रकाशित सीमा10,,21,,22 के भीतर है जो प्रीक्लिनिकल प्रभावकारिता परीक्षण के लिए गैर-मानव वानरों में जलसेक के लिए उपयोग किया जाता है।

ट्रांसड्यूक्शन प्रोटोकॉल की सफलता स्वस्थ, उत्तेजित पीबीएमसी और गैमारेट्रोवायरस की गुणवत्ता तैयारी दोनों पर निर्भर करती है। सफल उत्तेजना और ट्रांसड्यूक्शन प्राप्त करने के लिए, यह आवश्यक है कि संग्रह के बाद पीबीएमसी की ठंड और परिवहन में उचित देखभाल की जाए। आदर्श रूप से, यदि कोशिकाओं को साइट से एकत्र किया जाता है, तो उन्हें तरल नाइट्रोजन में भेज दिया जाता है और जल्दी से दीर्घकालिक तरल नाइट्रोजन भंडारण में रखा जाता है। गैमारेट्रोवायरस द्वारा सफलतापूर्वक स्थानांतरित करने के लिए पीबीएमसी को माइटोटिically रूप से सक्रिय होना चाहिए। एक विरोधी CD3/विरोधी CD28 के साथ उत्तेजना के बाद कोशिकाओं के क्लस्टरिंग के लिए नेत्रहीन निगरानी करनी चाहिए । ठीक से सक्रिय करने में विफलता ट्रांसड्यूक्शन की कम दक्षता का कारण बनेगी। उत्तेजित कोशिकाओं में व्यवहार्यता की निगरानी करना भी महत्वपूर्ण है। उत्तेजना कदम के बाद खराब व्यवहार्यता आमतौर पर कम सफल ट्रांसड्यूक्शन की ओर ले जाती है। चाहे प्रयोगशाला में वायरस की तैयारी का उत्पादन किया जाता है या आउटसोर्स किया जाता है, उन्हें फ्रीज गल चक्रों से बचने के लिए एकल उपयोग एलिकोट में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए जो वायरस को नुकसान पहुंचा सकता है और ट्रांसड्यूक्शन दक्षता को ख़राब कर सकता है। वायरस को टिटर किया जाना चाहिए ताकि प्रत्येक प्रयोग में लगातार मात्रा में वायरस का उपयोग किया जा सके। ट्रांसड्यूक्शन के लिए वायरस का उपयोग करते समय, वायरस को जल्दी से पिघलाएं और जरूरत होने तक बर्फ पर स्टोर करें। प्रमोटर, एन्हांसर और लिफाफा प्रोटीन का चुनाव सभी लक्ष्य कोशिकाओं में ट्रांस्डुक्शन दक्षता और ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है। इस प्रकार, एक MOI अनुभवजन्य निर्धारित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, विस्तार के लिए गैस पारगम्य कुओं के साथ टी कोशिकाओं और प्लेटों का समर्थन करने के लिए डिज़ाइन किए गए मीडिया के उपयोग से ट्रांसड्यूड कोशिकाओं का उत्कृष्ट विस्तार हुआ है। हालांकि, सेल विस्तार दर में पशु परिवर्तनशीलता है। हम एक परीक्षण अध्ययन की सिफारिश करने के लिए एक विशेष सेल तैयारी की क्षमता का निर्धारण करने के लिए transduced और विस्तारित किया जाएगा । विस्तार का स्तर छोटे और बड़े पैमाने पर दोनों ट्रांसप्रेचन में सुसंगत है ।

इस प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ, हमने परीक्षण जानवरों में जलसेक के लिए 2.5 x 109 कोशिकाओं का उत्पादन किया है। हालांकि हम यह अनावश्यक पैमाने पर इस समय प्रोटोकॉल पाया है, 6 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग बड़े पैमाने पर सेल की तैयारी के लिए एक सीमा है और प्रोटोकॉल संशोधन की आवश्यकता के लिए कोशिकाओं की अधिक से अधिक संख्या का उत्पादन होगा । संभावित संशोधनों के उदाहरणों में एक फाइब्रोनेक्टिन-लेपित संस्कृति बैग में ट्रांसड्यूक्शन करना शामिल है ताकि ट्रांसड्यूड कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की जा सके और विस्तार कदम के लिए एक बड़ी गैस पारगम्य संस्कृति पोत का उपयोग किया जा सके । यद्यपि हमने अभी तक ये परिवर्तन नहीं किए हैं, वे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों का उपयोग करते हैं और वर्तमान प्रोटोकॉल में व्यवहार्य संशोधन हैं।

इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने असंक्रमित जानवरों, SIV-संक्रमित जानवरों और एंटीरेट्रोवायरल थेरेपी (एआरटी) के साथ इलाज किए गए SIV-संक्रमित जानवरों से अलग पीबीएमसी से ट्रांसड्यूड कोशिकाओं का उत्पादन किया है। हालांकि, हमने एआरटी इलाज कोशिकाओं20में ट्रांसड्यूक्शन दक्षता में कमी को नोट किया है। यह कमी संभवतः रिवर्स ट्रांसक्रिटेंडा और/या दवाओं द्वारा पूर्णांक के अवरोध के कारण है । एआरटी-उपचारित जानवरों से कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन को इस प्रोटोकॉल में संशोधनों की आवश्यकता होगी जैसे कि पीबीएमसी एकत्र करने से पहले या एक वैकल्पिक वेक्टर के उपयोग के माध्यम से एआरटी दवाओं के इंट्रासेल्युलर स्तर को कम करना जो आमतौर पर उपयोग में आने वाली एआरटी दवाओं से प्रभावित नहीं होता है।

यह महत्वपूर्ण है कि इम्यूनोथेरेपी के लिए उत्पादित कोशिकाएं न्यूनतम विभेदित फेनोटाइप की हों ताकि वे जलसेक12के बाद बनी रहेंगी। यद्यपि कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के लिए कई प्रोटोकॉल ों को लंबी संस्कृति समय की आवश्यकता होती है, लेकिन भेदभाव में कमी और कार टी सेल फ़ंक्शन13में सुधार दोनों के साथ कम पूर्व वीवो संस्कृति समय को सहसंबद्ध किया गया है। इस ट्रांसड्यूक्शन और विस्तार प्रोटोकॉल की अपेक्षाकृत तीव्र समय सीमा वांछित केंद्रीय स्मृति फेनोटाइप के रखरखाव की अनुमति देती है, जबकि अभी भी उनकी इम्यूनोथेरचिचिचिवाल क्षमता20के परीक्षण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं का उत्पादन करती है ।

इस टी सेल इम्यूनोथेरेपी उत्पाद के लिए उत्पादन रणनीति का लक्ष्य टी कोशिकाओं का निर्माण करना है जो SIV-संक्रमित कोशिकाओं को पहचानेंगे, बी सेल कूप में वायरल प्रतिकृति की साइट पर ट्रैफ़िक करेंगे और जानवर में बने रहेंगे जिसके परिणामस्वरूप लंबी अवधि के एंटी-रेट्रोवायरल दवाओं की आवश्यकता के बिना कार्यात्मक इलाज। एक मानव इम्यूनोथेरेपी उत्पाद के अनुवाद के लिए, इस प्रोटोकॉल मानव विशिष्ट एंटीबॉडी और साइटोकिन्स के उपयोग और एक कार्यात्मक इलाज के उत्पादन के अंतिम लक्ष्य के साथ जीएमपी मानकों के कार्यान्वयन के माध्यम से मानव टी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है एचआईवी.

Disclosures

डॉ पामेला स्किनर मार्पाम फार्मा की सह-संस्थापक और मुख्य वैज्ञानिक अधिकारी हैं ।

Acknowledgments

इस अध्ययन NIH अनुदान 5R01AI096966-06S1 (पीएस, ईसी, और ईबी), 1UM1AI26617 (पीएस, द्वारा समर्थित था, चुनाव आयोग और ईबी), P51OD01106/P51RR000167 (ईआर), एमएन रीच ग्रांट 5U01HL127479-03 (पीएस), 1R01A143 380-01 (पीएस और ईबी), 1UM14126617 (पीएस और ईसी) के साथ-साथ NIAID डिवीजन ऑफ इंट्राम्यूरल रिसर्च और एनआईएच इंट्राम्यूरल एड्स द्वारा प्रदान की गई धनराशि ने एंटीवायरल कार्यक्रम को लक्षित किया । इन अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले एंटी-सीडी 3 और एंटी-सीडी28 को एनआईएच नॉनह्यूमन प्राइमेट रिएजेंट रिसोर्स (R24 OD010976, U24 AI126683) द्वारा प्रदान किया गया था। इन अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले आईएल-2 एनसीआई प्रीक्लीनिकल रिपॉजिटरी द्वारा प्रदान किया गया था। हम इस CD4-MBL CAR/CXCR5 परियोजना में अपने सहयोगियों, एरिजोना विश्वविद्यालय में डॉ एलिजाबेथ Connick, NIAID, NIH में डॉ एडवर्ड ए बर्जर, विस्कॉंसिन नेशनल प्राइमेट रिसर्च सेंटर में डॉ ईवा जी Rakasz और डॉ ज्योफ हार्ट और मिनेसोटा विश्वविद्यालय में सुश्री प्रीति Haran, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में डॉ लेस्ली Kean और डॉ कैथरीन Bollard हम मिनेसोटा विश्वविद्यालय में डॉ स्कॉट मैकइवर, फ्रेड हचिनसन कैंसर सेंटर में डॉ क्रिस्टोफर पीटरसन, एनआईएच में डॉ मैथ्यू ट्रिवेट, सिएटल चिल्ड्रन अस्पताल में डॉ एग्ने Taraseviciute, और इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में उनकी बहुत उपयोगी सहायता के लिए बच्चों के अनुसंधान संस्थान में डॉ कॉनराड रसेल क्रूज़ का भी शुक्रिया अदा करते हैं । हम गैमारेट्रोवाइरल उत्पादन के लिए मिनेसोटा विश्वविद्यालय में सुश्री ची फान और सुश्री जहोमैरी एलेग्रिया-बेरोकल और रीसस मकाक पीबीएमसी के अलगाव के लिए विस्कॉंसिन-मैडिसन विश्वविद्यालय में सुश्री किम Weisgrau को भी कृतज्ञता से स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gammaretrovirus preparation
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA Gibco R-001-100
293T cells ATCC CRL-3216
6 well plates, treated CytoOne CC7682-7506
DMEM Gibco 10569-010
Heat-inactivated FBS Hyclone Sh30088.03
Lipofectamine Invitrogen 11668019 transfection reagent
Opti-Mem Invitrogen 31985070 reduced serum media
pBS-CMV-gagpol Addgene 35614 A gift from Dr. Patrick Salmon
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 custom order from GenScript
RD114 A gift from Dr. Ed Berger
T75 flasks CytoOne CC7682-4875
VSV-G pMD.G A gift from Dr. Scott McIvor
T cell stimulation
6 well plates, untreated CytoOne CC7672-7506
Anti-CD28 NHP Reagent Resource Clone: CD28.2
Anti-macaque CD3 NHP Reagent Resource Clone: FN18
Phosphate buffered saline Gibco 14190-144
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells WNPRC Primary cells
For Fibronectin coating
6 well plates, untreated CytoOne CC7672-7506
BSA (Fraction V) HyClone SH 30574.02
RetroNectin (1 mg/ml) TaKaRa T100A
For T cell Expansion
G-Rex 6 Well Plate Wilson Wolf P/N 80240M Plates with gas permeable wells
Media Components
b mercaptoethanol Gibco 21985-023
Heat-inactivated FBS Hyclone Sh30088.03
IL-2 NCI Preclinical Repository
Penicillin/Streptomycin/Glutamine Gibco 10378-016
X-Vivo-15 medium Lonza 04-418Q
Variations of Media used
Basic medium: X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine
Expansion medium: Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol
Growth medium: Basic medium + 50 IU/ml IL-2 Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use.
Cell counting
Countess cell counting chambers Invitrogen AMQAF1000
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen T10282
Trypan blue, 0.4% solution Invitrogen T10282
Flow Cytometry
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit Invitrogen A20186 for conjugation of MBL antibody
anti-CD28-BV605 BD Biosciences 562976
anti-CD3-AF700 BD Biosciences 557917
anti-CD4-FITC BD Biosciences 556615
anti-CD8-BV788 BD Biosciences 563824
anti-CD95-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 561655
anti-CXCR5-PE eBioscience 12-1985-42
anti-MBL Invitrogen MA1-40145-S6
Flow Analysis software FlowJo, LLC FlowJo v10
Flow Cytometer Beckman CytoFlex
Live/Dead Near IR Invitrogen L10119
Other equipment
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage Beckman SX4750 Safety equipment
Beckman Allegra Centrifuge Beckman Sterilgard e3
Cell culture incubator Thermo Fisher Everlast 247
Class II Laminar flow hood Baker Heracell Vios 160i
Extra-Safe Disposable lab coat Fisher Scientific 359232 Personal protective equipment
Microplate carriers with biocertified covers Beckman SX4750A Safety equipment
Rocking platform Benchmark C10228
Swinging bucket rotor Beckman X13-R
X-Gen Nitrile gloves Genesee Personal protective equipment

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 157 कार-टी कोशिकाएं ट्रांसड्यूक्शन विस्तार रेट्रोवायरस पीबीएमसी केंद्रीय स्मृति
सेंट्रल मेमोरी फेनोटाइप के रखरखाव के साथ नौ दिनों में प्राथमिक टी कोशिकाओं का ट्रांसडक्शन और विस्तार
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Pampusch, M. S., Skinner, P. J.… More

Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype. J. Vis. Exp. (157), e60400, doi:10.3791/60400 (2020).

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