Summary
Мы излагаем 9-дневный протокол для трансдукции и расширения ресуса макаки периферических клеток крови моноядерных клеток, которая дает клетки с отличным со-выражениегенов интерес в достаточном количестве для инфузии исследований эффективности клеток.
Abstract
Новые иммунотерапии для лечения инфекционных заболеваний и рака часто включают трансдукцию клеточных популяций с генами, кодирующими белки, нацеленные на болезни. Например, химерный рецептор антигена (CAR)-T-клетки для лечения рака и вирусных инфекций включают трансдукцию Т-клеток с синтетическими генами, кодирующих молекулы CAR. Молекулы CAR делают Т-клетки специально распознать и убить рак или вирусно инфицированных клеток. Клетки также могут быть совместно трансумированы с другими генами, представляющими интерес. Например, клетки могут быть совместно трансумированы с генами, кодирующие белки, которые нацелены на клетки в конкретных местах. Здесь мы представляем протокол для преобразовывания первичных периферических моноядерных клеток крови (ПБМК) с генами, кодирующие вирус-специфический CAR и Молекулу самонаведения Хэмокина типа 5 (CXCR5). Эта процедура занимает девять дней и приводит к транс-прежнему Т-клеток населения, которые поддерживают центральный фенотип памяти. Поддержание центральной памяти или менее дифференцированного фенотипа, как было показано, ассоциируется с сохранением клеток после инфузии. Кроме того, клетки, вырабатываемые с помощью этого метода, показывают высокий уровень жизнеспособности, высокий уровень совместного выражения двух транскорпортированных генов и достаточно большое количество клеток для иммунотерапевтического инфузии. Этот девятидневный протокол может широко использоваться для лечения Т-Т и других подходов к иммунотерапии Т-клеток. Методы, описанные здесь, основаны на исследованиях, представленных в наших предыдущих публикациях.
Introduction
Клеточная иммунотерапия становится новым средством лечения заболеваний, включая рак и инфекционные заболевания. Эти методы иммунотерапии часто включают генетически манипулирующих терапевтических клеток, чтобы выразить конкретные молекулы. Например, химерный рецептор антигена (CAR) Т-клетки разработаны, чтобы выразить молекулу CAR, которая имеет внеклеточный домен, который специально связывает молекулы на больные клетки и сигнальный домен, который вызывает иммунные клетки, чтобы убить больную клетку. CAR Т-клетки успешно используются в иммунотерапии рака, и были особенно эффективны в лечении В клеточныхлейкемии 1,2,3. Кроме того, разрабатываются клетки CAR-T для лечения вирусных инфекций, таких как ВИЧ. ВИЧ-специфические ЦАРы нацелены на оболочку белков на поверхности вирусно инфицированных клеток4. Иммунотерапевтические клетки также могут быть разработаны, чтобы выразить самонаводящихся молекул для целевой терапевтических клеток в конкретных местах ткани. Мы разработали векторы, которые преобразовывают как вирус-специфический CAR, а также лимфоидный фолликул самонаводящейся молекулы CXCR55.
Вирусная репликация некоторых вирусов, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирус иммунодефицита симиана (SIV), концентрируется в всоставных клеточных фолликулов во вторичных лимфоидных тканях6. L клеточные фолликулы несколько иммунных привилегированных сайтов, в которых низкие уровни вируса конкретных CTL позволяют текущих вирусных репликации7,8. По этим причинам, ориентации ВИЧ / SIV-специфических Т-клеток в фолликул через выражение CXCR5 является стратегией для ликвидации фолликулярного резервуара вирусно инфицированных клеток9,10. В частности, мы ориентируемся на SIV-специфические т-клетки CAR На В-клеточные фолликулы с помощью совместного выражения CXCR5.
В этом протоколе мы описываем метод преобразовывания CAR/CXCR5 и расширения ПБМК для производства Т-клеток CAR/CXCR5 в достаточных количествах для терапевтического инфузии. Клетки, трансцированные с помощью этих методов, поддерживают центральный фенотип памяти. Исследования показали, что клетки с менее дифференцированным фенотипом, такие как центральная память Т-клеток и Т стволовых клеток памяти лучше сохраняются, чем более дифференцированных клеток11,12. Кроме того, многие протоколы, предназначенные для производства приемных переданных клеток имеют относительно длительные времена культуры, которые приводят к клеткам, которые имеют более дифференцированный фенотип и снижение настойчивости13. Кроме того, приемные клетки с длительным временем культуры, накопленные в легких вместо целевых лимфоидных тканей в резус макаке14,15. В методах, которые мы описываем и демонстрируем здесь, мы быстро преобразовываем и расширяем rhesus macaque PBMCs для производства трансиндуцированных Т-клеток, которые поддерживают центральный фенотип памяти.
Оба CD4 и CD8 Т-клетки включены в наш подход иммунотерапии. Эта смешанная популяция клеток была выбрана потому, что в клинических испытаниях отсутствие CD4 "Т-клеток в продукте CD8" Т-клеток было коррелировано с неспособностью проникнутых CD8 Т-клеток сохраняться 16. Методы, описанные здесь, начинаются с активации PBMCs с анти-CD3 и анти-CD28 антитела, которые мощно стимулировать рецептор Т-клеток и обеспечить со-стимулирующий сигнал, чтобы избежать клональной анерджи17,18.
После активации клетки трансумции с гаммаретровирусным вектором, кодирующим вирус-специфический CAR и лимфоидную молекулу самонаведения CXCR5. Затем трансиндуцированные клетки расширяются с помощью пластин, предназначенных для распространения неприсоединения клеток, которые имеют газопроницаемую мембрану в основании. Эта мембрана позволяет газообмен в нижней части скважины, что приводит к повышению выживаемости клеток и доступности питательных веществ19. Используя эти методы, достаточнофункциональные клетки могут быть произведены в 9-дневный таймфрейм для in vivo инфузии исследований. В то время как этот протокол предназначен для преобразовывания и расширения резус макаки Т-клеток, с небольшим изменением видов конкретных активации антител, он может быть использован с клетками других видов. Эти методы основаны на наших ранее опубликованных исследованиях9,20.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот резус PBMC протокол трансдукции требует использования гаммаретровирусного вектора. Обратите внимание, что гаммаретровирус может быть произведен в лаборатории или аутсорсинг вирусной компании производства. В лаборатории производство может быть проведено с протоколом, изложенным в шаге 1 и вирус может быть тизер, как указано в шаге 2. Независимо от того, производится ли вирус на месте или производственной компанией, СЛЕДУЕТ определить МВД (отношение инфекционных вирионов к клеткам культуры), как указано в шаге 3, для каждого вновь произведенного вирусного препарата и клеток, представляющих интерес.
ВНИМАНИЕ: Работа с гаммаретровирусными вектором или другими ретровирусными вектором требует надлежащих мер предосторожности, таких как использование лабораторных пальто и двойных слоев перчаток. Вся обработка вируса должна происходить в капюшоне биобезопасности. Все пипеты должны быть обеззаражены в растворе 10% отбеливателя в течение 30 мин. Все жидкие инфекционные отходы должны быть обеззаражены с конечной концентрацией 10% отбеливателя. Вторичное сдерживание, с печатью, которая предотвращает высвобождение микробиологических аэрозолей, требуется для центрифугирования
1. Производство гаммаретровирусных запасов
- Плита 293T клетки для трансфекции. Полный препарат вируса требует 12 T75 колбы на 4,5 х 106 клеток / колба в Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM) - 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) без антибиотиков.
- Разрешить клеткам расти в одночасье при 37 градусов по Цельсию до трансфекции.
- Разбавить 60 л трансфекционного реагента в 1,5 мл уменьшенных сывороточных носителей. Подготовьте одну трубку для каждой колбы. Инкубировать в течение 5 минут на RT.
- Для каждой колбы подготовьте трубку, содержащую 1,5 мл пониженных сывороточных носителей и следующих плазмидов: 9,0 мкг переносной плазмиды, содержащей интерес ген (ы), 3 мкг РД114 и 1,2 мкг VSV-G (конвертные плазмиды) и 3 мкг кляп/поль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конверт и кляп / пол гены необходимы для ретровирусной упаковки. Для нашего ретровирусного производства мы добавляем как конверт RD114, так и, для дополнительной стабильности, небольшое количество конверта VSV-G. - Добавьте разбавленные плазмиды (шаг 1.4) к разбавленным реагенту трансфекционного вещества (шаг 1.3). Смешайте осторожно. Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Кормите клетки 5 мл свежих полных носителей и добавить 3 мл трансфекционного реагента / плазмидной смеси dropwise на колбу и инкубировать для 5-6 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Добавьте еще 5 мл свежей среды в колбы и инкубировать 42-43 ч при 37 градусах Цельсия.
- После общего времени трансфекции 48 ч, собирать средства массовой информации и центрифуги на 1282 х г в течение 3 мин при 4 КК, чтобы удалить мусор клеток.
- Aliquot в соответствующие объемы для использования в будущем, флэш заморозить вирус в этанол / сухая ледяная ванна и хранить при -80 градусов по Цельсию.
2. Титерирование гаммаретровируса
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько разбавления вируса может потребоваться для получения действительного титра.
- Плита 293T клетки на 600000 клеток / хорошо в 6-хорошая пластина и инкубировать пластины для 24 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Удалить среду из клеток и добавить желаемое количество DMEM и 10% FBS к 293T (2 мл общий объем вируса).
- Добавьте вирус к соответствующему колодцу и аккуратно закружайте, чтобы перемешать. Например, добавьте 200 л, 100 л, 50 л и 25 Л соответственно к 4 скважинам. Включите колодец без вируса для цитометрии потока (макет образца).
- Инкубировать 48 ч при 37 градусах Цельсия.
- Попробуйте 293T-клетки, добавив 0,5 мл трипсина-ЭДТА и инкубируя в течение 4 мин при 37 градусах Цельсия. Остановите трипсин, добавив 1,5 мл DMEM и 10% FBS. Подсчитайте клетки и определите жизнеспособность с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоситометра.
- Для использования счетчика ячейки, добавить 10 зл и л клеток до 10 зл и немного трипан синий, перемешать, загрузить камеру слайд, и вставить в счетчик. Нажмите кнопку "захват", чтобы посчитать ячейки.
- Соберите 0,5-1 х 106 ячеек и оцените уровни CAR и CXCR5 по цитометрии потока (см. шаг 9.5). Выражение CD4 или MBL вместе с CXCR5 идентифицирует трансиндуцированные 293T-клетки, совместно выражающие CAR и CXCR5. Смотрите реактивные антитела в шаге 9.5.1.
- Рассчитайте вирусный титр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите образец с уровнем трансдукции 20% или менее для расчета титра.- Используйте следующую формулу для расчета титера:
трансдукционные единицы/мл (количество клеток в культуре) (% трансиндуированных клеток)/объем вируса, добавленного в культуру
- Используйте следующую формулу для расчета титера:
3. Определение оптимального МВД для недавно произведенной вирусной подготовки и заинтересованных ячеек
- Следуйте протоколу трансдукции (разделы 4-9) с первичными ПБМК и двукратными разбавлениями гаммаретровирусного препарата.
- Оцените уровень экспрессии генов, представляющих интерес, по течению цитометрии (шаг 9.5).
- Выберите концентрацию вируса, которая позволяет максимально трансдукцию без потери жизнеспособности клеток.
4. Подготовка пластин для активации Т-клеток путем покрытия Уэллс с анти-CD3 Антитела
- Подготовка анти-макаки CD3 антитела (FN18) путем разбавления запасов до 10 мкг/мл в фосфат-буферных сольник (PBS).
- Распределить 2 мл/хорошо в 6-колодных пластинах. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 2 ч. Кроме того, пластины можно инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Аспирируй PBS и несвязанные антитела. Промыть скважины дважды с 2 мл PBS и использовать сразу же пластины PBMCs.
5. Стимулирование Rhesus PBMCs с плитой связаны Anti-CD3 и растворимые Anti-CD28
- Оттепель первичного rhesus PBMCs в 37 градусов по Цельсию водяной бани, с нежным возбуждением, пока только небольшое количество льда остается.
- В капюшоне, мягко pipette клетки в конической трубки. Промыть флакон с 1 мл основной среды и добавить его медленно в клетки. Затем медленно добавьте дополнительные 9 мл теплой основной среды к клеткам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть масштабирован, но никогда не оттаивать более 4 флаконов за один раз. - Центрифуга при 600 х г в течение 5 мин при 22 градусах По Цельсию, чтобы гранулировать клетки. Аспирируйте супернатант, а затем повторно загорайте гранулы в небольшом количестве среды роста. Выберите объем таким образом, что концентрация клеток превысит 2 х 106 клеток/мл в этот момент, так как конечная концентрация должна быть 2 х 106 клеток/мл.
- Пятно клетки с trypan синий и рассчитывать клетки, чтобы определить количество жизнеспособных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать с помощью стандартного гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Мы используем автоматизированный счетчик ячейки, который отображает жизнеспособность и количество живых ячеек.- Чтобы использовать счетчик, добавьте 10 зл и л ячеек в 10 л трипан синий, перемешать, загрузить камеру слайд и вставить в счетчик. Нажмите кнопку "захват", чтобы посчитать ячейки.
- Рассчитайте общее количество клеток, умножая концентрацию клеток по объему, а затем разбавлять клетки до 2 х 106 клеток/мл в среде роста. Перед покрытием добавьте anti-CD28 к конечной концентрации 5 мкг/мл, чтобы обеспечить необходимый костимулирующий сигнал для активации Т-клеток.
- Клетки пипетки в анти-CD3 покрытием пластин. Добавить 3-6 х 106 ячеек на хорошо (хорошая цель 4 х 106 ячеек в 2 мл средств массовой информации в хорошо) и инкубировать в течение 2 дней при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2.
6. Подготовка плит с покрытием фибронектина
ПРИМЕЧАНИЕ: PBMC и Т-клетки выражают рецепторы интегрина VLA-4 или VLA-5 и являются хорошими мишенями для трансдукции, опосредованного фибронектином.
- Перед покрытием пластин, сначала подготовить фибронектин реагент, разбавляя его 1:100 в стерильных PBS.
- Пипетка 2 мл стерильного фибронектина в каждую скважину из 6-колодца пластины. Аккуратно накачать пластины на 2 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные, клеточная культура культуры культуры культуры плит ы или тарелки культуры культуры клетки должны быть использованы в этом шаге. - Удалите раствор фибронектина путем аспирации, а затем блокировать с 1 мл стерильных 2% бычьего сыворотки альбумина (BSA, Фракция V) в PBS. Раскачивай тарелки при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Заадь раствор BSA и промыть тарелку 2 мл PBS. После аспирации PBS, фибронектин покрытием пластины могут быть запечатаны с печатью обернуть и храниться при 4 кв КС в течение недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно готовим пластины за день до трансдукции.
7. Трансдукция активированных ресус-ПБМК
ВНИМАНИЕ: Работа с вирусными вектором или с резус-макакой PBMCs требует использования надлежащих мер предосторожности, таких как использование лабораторных пальто и двойных слоев перчаток. Все обработки вируса и клетки должны происходить в биобезопасности капот. Все пипеты должны быть обеззаражены в растворе 10% отбеливателя в течение 30 мин. Все жидкие инфекционные отходы должны быть обеззаражены с конечной концентрацией 10% отбеливателя. Вторичное сдерживание с печатью, предотвращая высвобождение микробиологических аэрозолей, необходимо для центрифугации.
- Прикрепите гаммаретровирусный трансдукционный вектор к колодец с покрытием фибронектина.
- Разогрейте центрифугу до 32 градусов по Цельсию, пробегая при 2000 х г около 30 мин.
- Теплый как сыворотки бесплатно и рост средств массовой информации в 37 градусов по Цельсию водяной бани.
- Оттепель вирус на льду или осторожно закрученного флакона в 37 градусов по Цельсию водяной бани до тех пор, пока только небольшое количество льда остается. Чтобы избежать деградации вирусного препарата, не позволяйте содержимому прогреться.
- Разбавить ретровирус до предопределенного оптимального многообразия инфекции (МВД) в среде, свободной от сыворотки.
ПРИМЕЧАНИЕ: С нашим гаммаретровирусом и ресус ОМС, мы обнаружили, что МВД 0,5 является оптимальным.- Пример разбавления: Чтобы покрыть 4 скважины вирусом и добавить 1,5 х 106 клеток, (4) (1,5 х 106)(0,5) 3 х 106 ТУ необходимы. Если вирусный титр составляет 1,1 ТУ/мл, то используйте вирус 2,7 мл в 5,3 мл носителя для общего объема 8 мл.
- Добавьте 2 мл разбавленного ретровируса к каждой скважине пластины с покрытием фибронектина.
- Для отрицательного контроля макет-трансуиндированных клеток, добавить средства массовой информации только фибронектин покрытием скважин.
- Поместите пластины в предварительно разогретую центрифугу 32 градусов по Цельсию в микроплитных носителях с биобезопасными крышками и центрифугами при 2000 х г на 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные пластины могут быть использованы немедленно или храниться, с вирусом, на 4 кв кв ночь. - Для немедленного использования, аспирировать препарат вируса из скважин и добавить 2 мл среды роста. Держите скважины с вирусным покрытием от сушки.
- Плита стимулировали ПБМК.
- Проверьте клетки с помощью перевернутого микроскопа. Клетки должны выглядеть здоровыми, а это означает, что они круглые, яркие и преломлять свет. Они также должны показать слипшийся внешний вид, указывающий стимуляции.
- Соберите целевые ячейки и перенесите их в коническую трубку 50 мл. Промыть колодец один раз с 1 мл роста средств массовой информации и добавить в конической трубки. Подсчитайте количество живых клеток с автоматизированным счетчиком ячейки как в шаге 5.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стимулированные клетки будут слипаться, и это слипание может привести к трудностям в точном подсчете клеток. - Пеллетклетки в трубках центрифуги при 600 х г в течение 5 мин при 32 градусах Цельсия. Аспирируйте носители из клеточных гранул и вновь приостанавливаете клетки в среде роста в концентрации 1,5 х 106 клеток/мл.
- К каждому хорошо покрытому вирусом (подготовленному на шаге 7.1) добавьте 1 мл клеточной подвески в общей сложности 1,5 х 106 клеток/3 мл. Обратите внимание, что каждая скважина уже содержит 2 мл среды роста. Выполните те же шаги для макет-трансудированных клеток, но пластины их на фибронектин покрытием скважин, которые не получили вирус.
- Центрифуга пластин на 1000 х г в течение 10 мин при 32 градусах Цельсия.
- Инкубировать пластины для 48 ч при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
8. Расширение трансиндуцированных клеток
- Нарисуйте содержимое скважин вверх и вниз с помощью трубки 5 мл, чтобы повторно приостановить работу клеток, а затем перенести в коническую трубку 50 мл.
- Добавьте 1 мл медийного носителя роста к каждой скважине и нарисуйте вверх и вниз с стерильной трубой переноса для удаления клеток адептов.
- Подсчитайте ячейки, чтобы определить общее количество ячеек и жизнеспособность с помощью автоматизированного счетчика клеток, как в шаге 5.4.
- При желании удалите 1 х 106 клеток для цитометрии потока для оценки экспрессии генов и фенотипа. См. Шаг 9.5.1 и таблицу материалов для рекомендуемых антител и стратегии gating.
- Центрифуги клетки на 600 х г в течение 10 мин при 25 градусов по Цельсию.
- Аспирировать средства массовой информации и повторного действия клеток в расширении средств массовой информации до концентрации 1 х 106 ячеек / мл. Семя каждого газопроницаемого колодца из 6-колодца пластины с 5 мл клеток. Тщательно слой дополнительных 25 мл расширения средств массовой информации на скважину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы добавляем клетки в небольшом объеме, а затем слой оставшихся носителей, так что клетки остаются на дне колодца. - Инкубировать клетки спокойно при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатора в течение 4 дней.
9. Сбор расширенных ячеек и оценка фенотипа трансиндуцированной популяции клеток
- Сбор ячеек из газопроницаемых скважин путем удаления и удаления 20 мл носителей. Следует соблюдать осторожность, чтобы не беспокоить клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы расширяем клетки только на 4 дня и собираем клетки в этой точке. Однако, если дополнительные дни культуры желательны, удалить 20 мл носителей, не нарушая клетки и заменить его 20 мл свежих носителей расширения. - Пайпет оставшиеся носители вверх и вниз, чтобы выбить клетки. Средства массовой информации должны быть очень облачно, если клетки выросли хорошо.
- Используя стерильный трубку передачи, промыть каждый колодец с 3 мл носителей для сбора любых остаточных ячеек.
- Подсчитайте клетки с автоматизированным счетчиком или гемоситометром, чтобы проверить жизнеспособность и номер ячейки.
- Выполните цитометрию потока для определения трансиндуцированной экспрессии генов и клеточного фенотипа.
- В этом примере определите фенотип резус-макаки PBMC с использованием антител, направленных против CD4 (M-T477), клона, который реактивны как с эндогенными rhCD4, так и rhCD4-MBL CAR; против CD3 (SP34-2) и CD8 (RPA-T8), которые окрашивают всего Т-клеток и CD8 Т-клеток соответственно; против рецептора смерти CD95 (DX2) и совместно стимулирующей молекулы CD28 (CD28.2), которые используются для определения фенотипа памяти клеток; и против CXCR5 (MU5UBEE) и MBL (3E7) для обнаружения CXCR5 и CD4-MBL CAR на трансиндуцированных ячейках.
- Оценка жизнеспособности оценивалась с помощью поправимого красителя жизнеспособности.
- Подготовка клеток для потока цитометрии.
- Составьте мастер-микс антитела для общего количества трубок. Довести до общего объема с помощью PBS.
- Добавьте клетки в трубки потока. Поместите 0,5-1 х 106 ячеек на трубку. Включите отрицательные элементы управления, такие как неокрашенные клетки, а также окрашенные макет трансиндуцированных клеток.
- Добавьте 2 мл PBS в клетки, центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT) и декант.
- Добавьте 100 кл. смеси антител в трубки и инкубинув в течение 30 минут на RT.
- Добавьте 2 мл PBS, центрифугу при 400 х г в течение 5 мин на RT и деканта.
- Добавьте 300 л 1% параформальдегида и инкубировать в течение 15 мин.
- Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин на RT и декант. Добавьте 300 л ПБС и перемешайте.
- На цитометрпотока потока, приобрести 150000 событий для каждого образца.
- Анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа потоков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия gating была ранее опубликована20.- Для идентификации трансиндуцированных клеток, воротных клеток на лимфоцитах, синглетах, живых, CD3 и MBL-CXCR5.
- Для идентификации центральной популяции памяти, ворота клетки на лимфоцитах, синглетов, жить CD3 ", CD8 ", CD28" CD95 ".
- Используйте ячейки по мере необходимости. Клетки могут быть использованы для in vitro анализ функции, такие как трансвелл миграции анализ9 или in vitro ячейки убийстваанализы 5,9. Клетки могут быть использованы для инфузии в животных. Кроме того, заморозить все оставшиеся клетки в 90% FBS с 10% диметил сульфоксид (DMSO) для последующего использования или анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как целевая доза для вливания приемных переданных клеток в резас макаки еще не установлена, опубликованные приемные исследования передачи у нечеловеческих приматов использовали 0,6 до 1,2 х 107 клеток/кг21, от 1 до 5 х 108 клеток/кг22 и 1,4 до 8 х 108 клеток/кг10. С этим диапазоном в качестве ориентира, достаточно клеток для инфузии может быть произведено с этим 9-дневный протокол.
Representative Results
Производство ячеек
Результаты, представленные в этой публикации, аналогичны результатам, приведенным в нашей ранее опубликованной работе9,,20. Используя представленный здесь протокол, мы ожидаем, по крайней мере, 8-кратное расширение ячеек между днями 5 и 9 (средний 11,1 раза, диапазон 8,7-13 раз). Газ проницаемые скважины были посеяны при стартовой плотности 5 х 106 ячеек и после 4 дней роста, мы достигли средней плотности 55,6 х 106 ячеек на скважину (диапазон 43,5-64,8 х 106) (Рисунок 1А). Подсчет клеток с исключением Trypan Blue показывает, что клетки поддерживают высокую жизнеспособность на протяжении всего протокола (день 9 медиана 85,8%, диапазон 83-95%) (Рисунок 1B). Мы находим животное к животному изменчивости в способности клеток расширить; однако, со стартовой популяцией 50-100 х 106 клеток на 1 день, мы использовали этот протокол для производства достаточного количества клеток для вливания макаки ресуса 1-2 х 108 клеток/кг.
Совместное выражение трансиндуцированных генов отслеживалось с помощью цитометрии потока(рисунок 2А). Выражение CAR и CXCR5 на поверхности трансиндуцированных клеток было относительно стабильным между днями 5 и 9 этого протокола расширения. На 5-й день, медиана 42.8% (диапазон 36.5-46.9%) из клеток были трансукторы с CD4-MBL CAR и CXCR5 в то время как на 9-й день, медианное выражение было 47,6% (диапазон 44,5-64,5%) с одним раундом трансдукции(рисунок 2B). Хотя некоторые протоколы требуют второго раунда трансдукции, мы не видели выгоды с точки зрения общего трансдуцированного ячейки в конце протокола (данные не показаны).
Фенотип клеток
Трансиндуцированные клетки были проанализированы цитометрией потока для мониторинга их фенотипа памяти. До трансдукции и расширения, наивные, центральные популяции памяти памяти памяти определяются (данные не показаны), но наивная популяция теряется с культивированием и клетки в первую очередь центральные ячейки памяти на день 5 (Рисунок 3А) и день 9 (Рисунок 3B), как определено CD95и CD28- выражение. Использование этого протокола быстрой трансдукции и расширения привело к выбросу клеток, которые в первую очередь являются центральными клетками памяти и, таким образом, будут более склонны распространяться и сохраняться при вливании в испытательное животное.
Рисунок 1: Протокол трансдукции и расширения производит обильные трансиндуцированные клетки, которые являются весьма жизнеспособными. (A) Расширение трансумированных клеток от 6 различных животных от дней 5 до 9 в газопроницаемых сосудах и (B) жизнеспособность трансиндуцированного PBMC от тех же 6 животных. Трипан синий исключение с помощью автоматизированного счетчика ячейки был использован для мониторинга номера ячейки и жизнеспособности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Протокол трансдукции производит клетки, которые поддерживают совместное выражение двух транс-индуцированных генов. (A) Представитель потока участок резус PBMC на 9 день трансдукции и расширения протокола демонстрации выражения как CD4-MBL CAR и CXCR5. (B) Выражение CD4-MBL CAR и CXCR5 на трансиндуцированных резус PBMC от 6 различных животных в дни 5 и 9 в культуре, как измеряется поток цитометрии. Ворота были установлены в прямом эфире, CD3и клетки. Трансиндуцированные клетки идентифицируются как MBLи CXCR5+. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Большинство клеток, вырабатываемых в 9-дневном протоколе, имеют центральный фенотип памяти. Представитель потока цитометрии участков (A) день 5 и (B) день 9 CAR/CXCR5-трансиндуцированный резус PBMC. Ворота были установлены в прямом эфире, CD3,CD8и клетки. Центральная память была определена как CD28и CD95+. Эффектор памяти был определен как CD28-, CD95. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Этот протокол излагает Стратегию производства иммунотерапии Т-клеток, которая использует гаммаретровирусный вектор, чтобы преобразовать резус макаки PBMC, что приводит к популяции Т-клеток, которая выражает противовирусный CAR, а также фолликулярный рецептор самонаведения, CXCR5. В общей сложности 8 дней ex vivo культуры времени, жизнеспособные, функциональные КЛЕТКи CAR Т производятся в количестве, которое находится в пределах опубликованного диапазона10,21,22 используется для инфузии в нечеловеческих приматов для доклинического тестирования эффективности.
Успех протокола трансдукции зависит как от здоровых, стимулируемых ПБМК, так и от качественного приготовления гаммаретровируса. Для достижения успешной стимуляции и трансдукции, важно, чтобы надлежащий уход принимается в замораживании и транспортировки PBMCs после сбора. В идеале, если клетки собираются с места, они отгружаются в жидком азоте и быстро помещаются в долгосрочное хранение жидкого азота. ПБМК должны быть митотологически активными, чтобы быть успешно трансцированными гаммаретровирусом. Следует визуально контролировать кластеризм клеток после стимуляции с помощью анти-CD3/anti-CD28. Неспособность активировать должным образом приведет к низкой эффективности трансдукции. Важно также контролировать жизнеспособность в стимулированных клетках. Плохая жизнеспособность после стимуляции шаг обычно приводит к менее успешной трансдукции. Независимо от того, производятся ли препараты вируса в лаборатории или передаются на внешний подряд, они должны храниться при -80 градусов по Цельсию в одноразовом использовании аликотов, чтобы избежать циклов замораживания оттепелей, которые могут повредить вирус и ухудшить эффективность трансдукции. Вирус должен быть тизерирован, чтобы постоянное количество вируса может быть использовано в каждом эксперименте. При использовании вируса для трансдукции, разморозить вирус быстро и хранить на льду до тех пор, пока это необходимо. Выбор промотор, усилитель и конверт белков может все влияние трансдукции эффективности и экспрессии трансгена в клетках-мишенях. Таким образом, МВД должно быть эмпирически определено. Кроме того, использование средств массовой информации, предназначенных для поддержки Т-клеток и пластин с газопроницаемыми скважинами для расширения, привело к отличному расширению трансиндуцированных клеток. Тем не менее, есть животное к изменчивости животных в скорости расширения клеток. Мы рекомендуем пробное исследование, чтобы определить способность конкретной подготовки клеток, которые будут транс-индуцированы и расширены. Уровни расширения являются последовательными как в малых, так и в крупномасштабных трансдукций.
С помощью этого протокола мы произвели до 2,5 х 109 клеток для вливания в испытательных животных. Хотя мы сочли ненужным наращивать протокол в настоящее время, использование 6 пластин скважин является ограничением для крупномасштабной подготовки клеток, и протокол потребует модификации для производства большего количества клеток. Примеры потенциальных модификаций включают проведение трансдукции в фибронектин покрытием культуры мешок для увеличения числа клеток транс-прежнему и использовать больше газа проницаемой культуры судна для расширения шаг. Хотя мы еще не внесли эти изменения, они используют коммерчески доступные продукты и являются возможными изменениями в действующем протоколе.
Используя этот метод, мы произвели трансиндуцированные клетки из PBMC, изолированные от неинфицированных животных, SIV-инфицированных животных и от SIV-инфицированных животных, обработанных антиретровирусной терапией (АРТ). Тем не менее, мы отметили снижение эффективности трансдукции в АРТ обработанных клеток20. Это сокращение предположительно из-за ингибирования обратной транскриптазы и / или интегразы с помощью препаратов. Перекуты клеток от обработанных АРТ животных потребуют внесения изменений в этот протокол, таких как снижение внутриклеточного уровня АРТ-препаратов путем остановки АРТ в течение нескольких дней до сбора PBMC или с помощью альтернативного вектора, который не влияет на ПРЕПАРАТы АРТ обычно используются.
Важно, чтобы клетки, вырабатываемые для иммунотерапии, были минимально дифференцированного фенотипа, чтобы они сохранялись после вливания12. Хотя многие протоколы для принятия передачи клеток требуют длительных периодов культуры, сокращение времени культуры ex vivo было коррелировано как с сокращением дифференциации, так и с улучшением функции CAR T-клеток13. Относительно быстрые сроки этого протокола трансдукции и расширения позволяет обслуживание желаемого фенотипа центральной памяти, в то же время производя достаточное количество клеток для тестирования их иммунотерапевтического потенциала20.
Цель производственной стратегии для этого продукта иммунотерапии т-клеток состоит в том, чтобы изготовить Т-клетки, которые распознают SIV-инфицированные клетки, будут трафик на место вирусной репликации в Фолликуле В и будет сохраняться в животном, что приведет к длительному функциональное лечение без необходимости в антиретровирусных препаратах. Для перевода на продукт иммунотерапии человека, этот протокол может быть изменен, чтобы преобразовать человека Т-клеток с помощью человека конкретных антител и цитокинов и реализации стандартов GMP с конечной целью производства функционального лечения Вич.
Disclosures
Д-р Памела Скиннер является соучредителем и главным научным сотрудником MarPam Pharma.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано NIH гранты 5R01AI096966-06S1 (PS, EC, и EB), 1UM1AI26617 (PS, EC и EB), P51OD01106/P51RR000167 (ER), Грант MN REACH 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A143 380-01 (PS и EB), 1UM14126617 (PS и EC), а также средства, предоставленные Отделом интрамуральных исследований НИАИД и целевой противовирусной программой NIH Intramural AIDS. Анти-CD3 и anti-CD28, используемые в этих исследованиях, были предоставлены ресурсом NIH Nonhuman Primate Reagent (R24 OD010976, U24 AI126683). ИЛ-2, используемый в этих исследованиях, был предоставлен доклиническим репозиторием NCI. Мы благодарим наших сотрудников в этом проекте CD4-MBL CAR/CXCR5, д-ра Элизабет Конник в Университете Аризоны, д-ра Эдварда Бергера в NIAID, NIH, д-ра Евы Г. Ракаш в Висконсинском национальном исследовательском центре приматов и д-ра Джеффа Харта и г-жи Притхи Харан в Университете Миннесоты, д-р Лесли Кин в Гарвардской школе. Мы также благодарим д-ра Скотта МакИвора в Университете Миннесоты, д-ра Кристофера Петерсона в онкологическом центре Фреда Хатчинсона, д-ра Мэтью Триветта в NIH, д-ра Агне Тарасевичют в детской больнице Сиэтла и д-ра Конрада Рассела Круза в Детском научно-исследовательском институте за их очень полезную помощь в оптимизации этого протокола. Мы также с благодарностью признательны г-же Чи Фан и г-же Джомари Алегрия-Беррокаль в Университете Миннесоты за гаммаретровирусное производство и г-жу Ким Вайсграу в Университете Висконсин-Мэдисон за изоляцию резус-макаки PBMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
References
- Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Sadelain, M., Rivière, I., Riddell, S. Therapeutic T cell engineering. Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).
- Kuhlmann, A., Peterson, C. W. Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure. Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).
- Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity. Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).
- Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).
- Connick, E., Mattila, T., et al. CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue. The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).
- Connick, E., Folkvord, J. M., et al. Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL. The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).
- Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication. Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).
- Ayala, V. I., Deleage, C., et al. CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering. Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).
- Redeker, A., Arens, R. Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination. Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).
- Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting Through Subsets. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
- Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection. The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).
- Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).
- Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies. Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).
- Chambers, C. A., Allison, J. P. Costimulatory regulation of T cell function. Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).
- Schwartz, R. H. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).
- Bajgain, P., Mucharla, R., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015 (2014).
- Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).
- Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
- Berger, C., Sommermeyer, D., et al. Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells. Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).
