Summary
我们概述了一个为期9天的协议，用于转导和扩大流黄猴外周外血单核细胞，该细胞产生具有良好共同表达的细胞，其感兴趣的基因数量足以用于细胞有效性的输液研究。
Abstract
治疗传染病和癌症的新兴免疫疗法通常涉及细胞群的转导，其基因编码为疾病靶向蛋白。例如，用于治疗癌症和病毒感染的嵌合抗原受体（CAR）-T细胞涉及T细胞的转导，合成基因编码CAR分子。CAR分子使T细胞专门识别和杀死癌症或病毒感染的细胞。细胞也可以与其他感兴趣的基因共同转化。例如，细胞可以与编码蛋白质的基因共同转化，这些蛋白质将细胞目标对准特定位置。在这里，我们提出了一个协议，以转换原发性外周血单核细胞（PBMC），基因编码病毒特异性CAR和B细胞卵泡培养分子化学酶受体5型（CXCR5）。此过程需要 9 天，并产生具有中央记忆表型的转导 T 细胞群。中央记忆或不太分化的表型的维护已被证明与输液后细胞的持久性相关联。此外，用这种方法产生的细胞表现出高水平的生存能力，两个转导基因的表达水平高，以及足够数量的细胞用于免疫治疗输液。这九天的协议可广泛用于CAR-T细胞和其他T细胞免疫治疗方法。此处描述的方法基于我们以前出版物中介绍的研究。
Introduction
细胞免疫疗法正在成为治疗癌症和传染病等疾病的新手段。这些免疫疗法通常涉及基因操作治疗细胞以表达特定分子。例如，嵌合抗原受体（CAR）T细胞被设计成表达一个CAR分子，该分子具有细胞外域，专门结合病变细胞上的分子和触发免疫细胞杀死病变细胞的信号域。CAR T细胞在癌症免疫疗法中被成功应用，在治疗B细胞白血病11、2、32,3方面特别有效。CAR-T细胞也正在开发，以治疗病毒感染，如艾滋病毒。HIV特异性CAR针对病毒感染细胞表面的包络蛋白4。免疫治疗细胞也可以被设计成表达宿主分子，将治疗细胞定向到特定的组织位置。我们已经开发出一种载体，可以同时传播病毒特定的CAR以及淋巴卵泡的培养分子CXCR55。
病毒复制某些病毒，包括人体免疫机能丧失病毒（HIV）和西米亚免疫机能丧失病毒（SIV），集中在B细胞卵泡中，处于继发淋巴组织6。B细胞卵泡是一些免疫特权网站，其中病毒特异性CTL水平低允许持续病毒复制77，8。8由于这些原因，通过表达CXCR5将HIV/SIV特异性T细胞定向到卵泡中是消灭病毒感染细胞99、1010卵泡库的策略。具体来说，我们通过CXCR5共同表达将SIV特定的CAR T细胞定位到B细胞卵泡。
在此协议中，我们描述了一种转导CAR/CXCR5和扩大PBMC的方法，以生产足够数量的CAR/CXCR5 T细胞用于治疗输液。用这些方法换来的细胞保持一个中央记忆表型。研究表明，具有较少分化表型的细胞，如中央记忆T细胞和T记忆干细胞比分化性更高的细胞11，12,12更好地持久。此外，许多旨在产生采用转移细胞的协议具有相对较短的培养时间，导致具有更分化表型和减少持久性13的细胞。此外，在肺内积累的培养时间长的细胞，而不是在黄斑狼猴14、15,15中的目标淋巴组织。在我们在这里描述和演示的方法中，我们快速转导和扩展黄斑猴PBMC，以产生保持中央记忆表型的转导T细胞。
CD4和CD8 T细胞都包含在我们的免疫治疗方法中。之所以选择这种混合细胞群，是因为在临床试验中，CD8+T细胞产物中缺乏CD4+T细胞与注入CD8 T细胞失败而持续16。这里描述的方法开始激活具有抗CD3和抗CD28抗体的PBMC，这些抗体能有效刺激T细胞受体并提供共同刺激信号，以避免克隆过敏17，18。17,
激活后，细胞通过伽马病毒载体进行转导，编码病毒特异性CAR和淋巴霍姆分子CXCR5。然后，使用专为非粘附细胞繁殖设计的板进行转导细胞扩展，该板在基底有一个透气膜。这种膜允许在井底进行气体交换，从而增强细胞生存和营养可用性19。使用这些方法，可以在9天的时间内产生足够的功能细胞，用于体内输液研究。虽然该协议是为转导和扩大河套猴T细胞而设计的，对物种特异性激活抗体进行轻微修饰，可与其他物种的细胞一起使用。这些方法是基于我们先前发表的研究9,9，20。
Protocol
注：此流湿性 PBMC 转导协议需要使用伽马病毒载体。请注意，伽马病毒可以在实验室中生产，也可以外包给病毒生产公司。在实验室生产中，可以使用步骤 1 中概述的协议进行，并且病毒可以像步骤 2 中所述进行点分处理。无论病毒是在现场还是由生产公司产生，应确定MOI（传染性病毒与培养中细胞的比率），如步骤3所述，为每个新产生的病毒制剂和感兴趣的细胞确定。
注意：使用抗伽马病毒载体或其他抗逆转录病毒载体需要适当的安全预防措施，例如使用实验室外套和双层手套。所有处理病毒必须发生在生物安全罩。所有移液器应在 10% 漂白液中脱污染 30 分钟。所有液体传染性废物应以最终浓度为10%的漂白剂进行净化。二次密封，带有防止微生物气溶胶释放的密封，是离心所必需的
1. 生产伽马病毒库存
- 板 293T 细胞，用于转染。完全病毒制备需要12 T75烧瓶在4.5 x 106细胞/烧瓶在Dulbecco的改良鹰中（DMEM）+ 10%胎儿牛血清（FBS）没有抗生素。
- 在转染前，允许细胞在37°C下过夜生长。
- 在1.5 mL减少血清介质中稀释60μL的转染试剂。为每个烧瓶准备一根管子。在RT孵育5分钟。
- 对于每个烧瓶，制备一个含有1.5 mL减少血清介质和以下质粒的管子：9.0 μg的转移质粒含有感兴趣的基因，3 μg RD114和1.2微克VSV-G（包络质质），3微克gag/pol。
注：抗逆转录病毒包装需要信封和gag/pol基因。对于我们的抗逆转录病毒生产，我们同时添加RD114信封，并增加稳定性，少量的VSV-G信封。 - 将稀释的质粒（步骤1.4）添加到稀释后的转染试剂（步骤1.3）。轻轻混合。在室温下孵育20分钟。
- 饲料细胞 5 mL 的新鲜完整介质，并添加 3 mL 转染试剂/质粒混合物滴每个烧瓶和孵育 5~6 小时在 37 °C。
- 在烧瓶中再加入5 mL的新鲜介质，在37°C下孵育42~43小时。
- 总转染时间为 48 小时后，在 4°C 下以 1282 x g收集介质和离心机 3 分钟，以清除细胞碎片。
- 将阿利quot放入适当的体积供将来使用，在乙醇/干冰浴中闪光冷冻病毒，并储存在-80°C。
2. 对伽马病毒进行回溯
注：可能需要几种稀释病毒才能获得有效的定分。
- 板 293T 细胞在 6 孔板中的 600，000 个细胞/孔处，在 37 °C 下孵育 24 小时板。
- 从细胞中取出介质，将所需的 DMEM 量 = 10% 的 FBS 添加到 293T（2 mL 病毒总容量）。
- 将病毒添加到相应的井中，并轻轻旋转混合。例如，在4口井中分别添加200μL、100μL、50μL和25μL。包括一个没有病毒的井，用于流式细胞学（模拟样品）。
- 在37°C下孵育48小时。
- 通过加入0.5 mL的Trypsin-EDTA，在37°C下孵育4分钟，对293T细胞进行试脂。通过添加 1.5 mL DMEM = 10% FBS 来阻止胰蛋白酶。使用自动细胞计数器或血细胞计对细胞进行计数并确定可行性。
- 要使用细胞计数器，请将 10 μL 的细胞添加到 10 μL 的锥色蓝色中，混合、加载腔室滑块并插入计数器。按下"捕获"按钮以计数单元格。
- 收集 0.5×1 x 106个单元，并通过流细胞测定评估 CAR 和 CXCR5 的水平（参见步骤 9.5）。CD4 或 MBL 的表达以及 CXCR5 将识别传感器 293T 电池共同表达 CAR 和 CXCR5。请参阅步骤 9.5.1 中的反应抗体。
- 计算病毒性手。
注： 选择转导水平为 20% 或更低样本的样本，以计算手数。- 使用以下公式计算奶分：
转导单位/mL = （培养中的细胞数）（细胞转导的百分比）/添加到培养的病毒体积
- 使用以下公式计算奶分：
3. 为新生产的病毒制剂和兴趣细胞确定最佳MOI
- 遵循转导协议（第 4-9 节），使用主要的 PBMC 和伽马病毒制备的两倍稀释。
- 通过流动细胞测定评估感兴趣的基因的表达水平（步骤9.5）。
- 选择允许最大转导且不丧失细胞生存能力的病毒浓度。
4. 准备板通过涂布孔与抗CD3抗体的T细胞激活
- 通过在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释库存至 10 μg/mL，制备抗猴 CD3 抗体 （FN18）。
- 在 6 孔板中分配 2 mL/孔。在37°C孵育2小时。或者，板材可以在4°C下孵育过夜。
- 吸气PBS和未绑定抗体。用 2 mL PBS 冲洗孔两次，并立即用于盘式 PBMC。
5. 用板式抗CD3和可溶性抗CD28刺激风湿性PBMC
- 在37°C的水浴中解冻原质风湿质PBPC，轻轻搅拌，直到仅残留少量冰。
- 在引擎盖中，轻轻地将细胞移液成圆锥形管。用1 mL的基本介质冲洗小瓶，然后慢慢将其添加到细胞中。接下来，缓慢地向细胞中添加额外的 9 mL 暖基本介质。
注：此步骤可以放大，但一次不会解冻超过 4 个小瓶。 - 在 600 x g下离心 5 分钟，在 22 °C 下颗粒细胞。吸气上清液，然后在少量生长介质中重新悬浮颗粒。选择体积，使细胞浓度超过2 x 106细胞/mL在这一点上，因为最终浓度应为2 x 106细胞/mL。
- 用锥色蓝色染色细胞并计数细胞以确定存活细胞的数量。
注：这可以通过标准血细胞计或自动细胞计数器来完成。我们使用自动单元格计数器，显示活细胞的可行性和数量。- 要使用计数器，请将 10 μL 的细胞添加到 10 μL 锥色蓝色中，混合、加载腔室滑动并插入计数器。按下"捕获"按钮以计数单元格。
- 计算细胞总数，通过体积乘以细胞浓度，然后将细胞稀释成生长介质中的2 x 106细胞/mL。在电镀之前，将抗CD28添加到最终浓度为5μg/mL，以便为T细胞活化提供必要的联合刺激信号。
- 移液细胞进入抗CD3涂层板。每口加入3×6×106个细胞（好靶点为每口2 mL介质中的4 x 106个细胞），在37°C的5%CO2中孵育2天。
6. 准备纤维化涂层板
注：PBMC和T细胞表达集成受体VLA-4或VLA-5，是纤维素介导转导的良好靶点。
- 在涂覆板之前，首先通过在无菌PBS中稀释1：100来制备纤维化剂试剂。
- 移液2 mL的无菌纤维化溶液进入6孔板的每个孔。在室温下轻轻摇动 2 小时。
注：此步骤中应使用未经处理的细胞培养级组织培养板或菜肴。 - 通过吸入去除纤维素溶液，然后在PBS中用1 mL的无菌2%牛血清白蛋白（BSA，分数V）阻断。在室温下摇动板 30 分钟。
- 吸气BSA溶液，用2 mL PBS清洗板。在PBS的吸入后，纤维素涂层板可以密封密封包装，并储存在4°C长达一周。
注：我们通常在转染前一天准备板。
7. 转导活性流湿性PBPC
注意：使用病毒载体或流湿猴PBMC需要利用适当的安全预防措施，如使用实验室外套和双层手套。所有处理病毒和细胞必须发生在生物安全罩。所有移液器应在 10% 漂白液中脱污染 30 分钟。所有液体传染性废物应以最终浓度为10%的漂白剂进行净化。防止微生物气溶胶释放的密封的二次密封是离心所必需的。
- 将伽马逆转录病毒转导载体连接到纤维化涂层井上。
- 将离心机加热到 32°C，在 2000 x g下运行约 30 分钟。
- 在37°C的水浴中加热无血清和生长介质。
- 在冰上解冻病毒，或在37°C的水浴中轻轻旋转小瓶，直到只剩下少量的冰。为了避免病毒制剂的降解，不要让内容物预热。
- 在无血清介质中，将逆转录病毒稀释为预定的最佳感染倍数 （MOI）。
注：使用我们的伽马病毒和河套PBMC，我们发现0.5的MOI是最佳的。- 示例稀释：要涂上 4 口病毒并添加 1.5 x 106个细胞，需要 （4）（1.5 x 106）（0.5） = 3 x 106 TU。如果病毒风性风口数为 1.1 TU/mL，则在 5.3 mL 介质中使用 2.7 mL 病毒，总容量为 8 mL。
- 将2 mL稀释的逆转录病毒添加到纤维化膜涂层板的每个孔中。
- 对于负控制模拟转导细胞，单独向纤维化膜涂层井添加介质。
- 将板置于预热的 32°C 离心机中，放在带有生物安全盖的微板载体中，并在 2000 x g下将离心机放置 2 小时。
注：病毒涂层板可立即使用或储存与病毒，在4°C过夜。 - 为立即使用，从井中吸出病毒制剂，并添加2 mL的生长介质。防止病毒覆盖的井干燥。
- 盘镀刺激的PBMC。
- 使用倒置显微镜检查细胞。细胞应该看起来健康，这意味着它们是圆的，明亮的和折射的光。它们还应显示一个块状的外观，表示刺激。
- 收集目标细胞并将其转移到50mL锥形管。用 1 mL 生长介质冲洗井一次，并添加到锥形管中。计算具有自动细胞计数器的活细胞数，如步骤 5.4 中那样。
注：刺激细胞将挤结，这种结块可能导致难以准确计数细胞。 - 在32°C下，在600 x g处离心5分钟，将管中的细胞切碎。从细胞颗粒中吸出介质，以1.5 x 106细胞/mL的浓度重新悬浮生长介质中的细胞。
- 到每个病毒涂层良好（在步骤7.1中准备）添加1 mL细胞悬浮液共1.5 x 106细胞/3 mL。请注意，每口井已包含 2 mL 生长介质。对模拟转导细胞执行相同的步骤，但将它们盘到纤维化涂层的孔上，而纤维化涂层的孔没有病毒。
- 在 32 °C 下，将板在 1000 x g下离心 10 分钟。
- 在37°C下孵育板48小时，低于5%CO2。
8. 转导细胞的膨胀
- 用5 mL移液器向上和向下绘制井内的物品，以便重新悬浮细胞，然后转移到50mL锥形管。
- 在每个井中加入 1 mL 的生长介质，然后用无菌转移移液器上下绘制，以去除粘附细胞。
- 使用自动单元格计数器计算单元格总数和可行性，如步骤 5.4 中那样。
- 如果需要，取出1 x 106细胞进行流细胞测定，以评估基因表达和表型。有关推荐的抗体和浇注策略，请参阅步骤 9.5.1 和材料表。
- 在 600 x g下离心 10 分钟，在 25 °C 下。
- 吸气介质，将膨胀介质中的细胞重新悬浮到1 x 106细胞/mL的浓度。用5mL的细胞，将6孔板的每个透气孔播种。小心地将每口井额外层 25 mL 的膨胀介质。
注：我们以小体积添加单元格，然后将剩余的介质分层，以便细胞保持在井的底部。 - 在5%CO2培养箱中，在37°C下毫无干扰地孵育细胞4天。
9. 收集扩大细胞并评估转导细胞群的表型
- 通过去除和丢弃 20 mL 介质从透气井中收集细胞。应小心避免干扰细胞。
注：我们只展开4天的单元格，此时收集单元格。但是，如果需要额外的培养天数，请移除 20 mL 的介质，而不会干扰细胞，代之以 20 mL 的新鲜膨胀介质。 - 上下移出剩余的介质以取出细胞。如果细胞生长良好，介质应该是非常多云的。
- 使用无菌转移移液器，用3 mL介质冲洗每个井，以收集任何残留细胞。
- 使用自动计数器或血细胞计对细胞进行计数，以检查其可行性和细胞数。
- 执行流细胞测定以确定转导基因表达和细胞表型。
- 在此示例中，使用针对 CD4 （M-T477） 的抗体确定黄斑猴 PBMC 表型，该抗体是具有内源性 rhCD4 和 rhCD4-MBL CAR 反应的克隆;对CD3（SP34-2）和CD8（RPA-T8）分别染色总T细胞和CD8 T细胞;对抗死亡受体CD95（DX2）和共同刺激分子CD28（CD28.2），用于确定细胞的记忆表型;并针对 CXCR5 （MU5UBEE） 和 MBL （3E7） 检测传感器上的 CXCR5 和 CD4-MBL CAR。
- 使用可修复的生存能力染料评估可行性。
- 准备细胞进行流细胞测定。
- 为管的总数组成抗体母体混合物。使用 PBS 使总音量达到总容量。
- 将细胞添加到流管中。每管放置 0.5×1 x 106个单元。包括负对照，如未染色的细胞以及染色的模拟传感器。
- 将 2 mL PBS 添加到电池中，在室温 （RT） 和减量下以 400 x g的离心机 5 分钟。
- 在管中加入100 μL的抗体混合物，在RT孵育30分钟。
- 加入 2 mL PBS，在 400 x g 下在 RT 和零度时在 400 x g处进行 5 分钟离心机。
- 加入300μL的1%甲醛，孵育15分钟。
- 在 RT 和零度时在 400 x g下离心 5 分钟。加入300 μL的PBS并混合。
- 在流量细胞仪上，为每个样本获取 150，000 个事件。
- 使用流分析软件分析数据。
注：门控策略先前于20日公布。- 用于识别转导细胞、淋巴细胞、单细胞、活细胞、CD3+和MBL_CXCR5+上的门细胞。
- 用于识别中央记忆群，淋巴细胞、单细胞、活CD3+、CD8+、CD28+CD95+上的门细胞。
- 根据需要使用单元格。细胞可用于体外功能检测，如转体迁移测定9或体外细胞杀灭测定5、9。95细胞可用于输液到动物体内。或者，将剩余的任何细胞冷冻在 90% FBS 中，使用 10% 二甲基硫氧化物 （DMSO） 进行以后使用或分析
注：虽然将采用转移的细胞注入流马猴的目标剂量尚未确定，但发表在非人类灵长类动物中的收养转移研究使用了0.6至1.2×107细胞/kg21、1至5×108细胞/kg22和1.4至8×10 8细胞/千克10。以这个范围作为指南，有足够的细胞输液与这个9天协议。
Representative Results
细胞生产
本刊上介绍的结果与我们先前出版的作品9、2020相似。利用此处介绍的协议，我们预计在第 5 天和第 9 天之间至少膨胀 8 倍的细胞（中位数 11.1 倍，范围为 8.7-13 倍）。气体渗透井的起始密度为5 x 106细胞，经过4天的生长，我们达到了每口井55.6 x 106个细胞的中位密度（范围为43.5×64.8 x106）（图1A）。使用 Trypan Blue 排除的细胞计数表明，在整个协议中，细胞保持高可行性（第 9 天中位数 85.8%，范围 83-95%）（图1B）。我们发现动物对动物的变异性在细胞的膨胀能力;然而，在第 1 天，起始量为 50×10 x 106细胞，我们使用这种协议可以产生足够的细胞，用于注入 1⁄2 x 108细胞/kg 的流苏猴。
通过流细胞测定监测转导基因的共同表达（图2A）。在此扩展协议的第 5 天和第 9 天之间，在传感器表面表达 CAR 和 CXCR5 相对稳定。第5天，中位数为42.8%（范围为36.5~46.9%）其中的细胞均通过CD4-MBL CAR和CXCR5进行转导，而第9天，中位表达率为47.6%（范围为44.5~64.5%）具有单轮转导（图2B）。尽管有些协议要求进行第二轮转导，但我们在协议结束时没有看到总转导细胞的好处（未显示数据）。
细胞表型
通过流细胞测定分析转导细胞，以监测其记忆表型。在转导和扩展之前，识别天真的中央记忆和效应器记忆群（未显示数据），但幼体群因培养而丢失，并且细胞主要是第5天（图3A）和第9天（图3 B）（CD95Figure 3B+ CD28+表达式所识别的中央记忆细胞）。使用这种快速转导和扩展协议已经产生了主要为中央记忆细胞的细胞，因此在注入测试动物时更有可能增殖和持续。
图1：转导和膨胀协议产生丰富的转导细胞，这些细胞非常可行。（A） 从气体渗透容器中从6种不同动物的转导细胞从第5天扩大到9天，从同6只动物中（B）的转导PBMC的可行性。使用自动单元格计数器的 Trypan 蓝色排除用于监视手机号码和可行性。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：转导协议产生细胞，维持两个转导基因的共同表达。（A） 转导和扩展协议第 9 天流流图，演示 CD4-MBL CAR 和 CXCR5 的表达。（B） CD4-MBL CAR 和 CXCR5 在培养中 6 个不同动物的转导流变 PBMC 上表达，以流细胞测定量测定。盖茨被设置在活，CD3+细胞。转导细胞被确定为MBL+ CXCR5+。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：9 天协议中产生的大多数单元具有中央内存表型。代表性流细胞测量图 （A） 第 5 天和 （B） 第 9 天 CAR/CXCR5- 转导的流变性 PBMC。盖茨被设置在活，CD3+，CD8+细胞。中央存储器定义为 CD28+ CD95+。效应器内存定义为 CD28-， CD95+。请点击此处查看此图形的较大版本。
Discussion
该协议概述了T细胞免疫治疗生产策略，它利用伽马病毒载体来转导流苏猴PBMC，导致T细胞群，表示抗病毒CAR以及卵泡宿主受体CXCR5。在总共8天的外活体培养时间，可行的，功能性的CAR T细胞产生的数量是在公布的范围10，21，2210,21,22用于输液到非人类灵长类动物进行临床前疗效测试。
转染协议的成功依赖于健康、刺激的PBPC和伽马病毒的质量制剂。为了成功地实现刺激和转导，在收集后对PBMC的冷冻和运输必须适当小心。理想情况下，如果细胞被收集到场外，它们被运到液氮中，并迅速放入长期液氮储存中。PBMC 必须具有线性活性，才能通过伽马病毒成功转导。在用抗CD3/抗CD28刺激后，应目视地监测细胞的聚类。未能正确激活将导致转染效率低。监测受刺激细胞的生存能力也很重要。刺激步骤后生存能力差通常会导致转导效果较差。无论是在实验室中生产病毒制剂还是外包病毒制剂，它们都应以-80°C储存在一次性的等分值中，以避免冻融周期，从而损害病毒并损害转染效率。病毒必须进行定分，以便每个实验都使用数量一致的病毒。当使用病毒进行转导时，迅速解冻病毒并储存在冰上，直到需要为止。促进剂、增强剂和包络蛋白的选择都可能影响靶细胞中转导效率和转基因表达。因此，必须根据经验确定谅解备忘录。此外，使用一种介质，旨在支持T细胞和板与气体渗透孔膨胀已导致传感器的出色膨胀。然而，在细胞扩张率中存在着动物对动物的变异性。我们建议进行试验性研究，以确定特定细胞制剂的转导和扩展能力。在小型和大型转变中，膨胀水平是一致的。
使用这种协议，我们生产了多达2.5 x 109细胞输液到试验动物体内。尽管我们发现此时没有必要扩大协议规模，但使用6个孔板是大规模细胞制备的限制，该协议需要修改才能产生更多的细胞。潜在修饰的示例包括在纤维化涂层培养袋中进行转导，以增加转导细胞的数量，并利用更大的气体渗透培养容器进行膨胀步骤。虽然我们还没有进行这些修改，但它们利用了商业上可用的产品，并且对目前的协议进行了可行的修改。
利用这种方法，我们从从未感染的动物、感染SIV的动物和经抗逆转录病毒疗法（ART）治疗的SIV感染动物中分离出的PBMC细胞。然而，我们注意到抗逆转录病毒治疗细胞20的转导效率降低。这种减少大概是由于药物抑制逆转录酶和/或整数。从抗逆转录病毒疗法处理的动物细胞的转导将需要修改该协议，例如通过在收集PBMC之前停止抗逆转录病毒疗法几天或使用不受常用抗逆转录病毒药物影响的替代载体来降低抗逆转录病毒药物细胞内水平。
重要的是，为免疫治疗而产生的细胞具有最小的分化表型，这样它们就会在输注后持续12。虽然许多采用细胞转移的协议需要很长的培养时间，但减少的体外培养时间与减少分化和改善CAR T细胞功能13有关。这种转导和扩展协议相对快速的时间范围允许维持所需的中央记忆表型，同时仍然产生足够的细胞来测试其免疫治疗潜力20。
这种T细胞免疫治疗产品生产策略的目标是制造T细胞，识别SIV感染细胞，将流量到B细胞卵泡中的病毒复制部位，并将长期留在动物中功能治疗，无需抗逆转录病毒药物。对于人类免疫治疗产品的翻译，该协议可以通过使用人类特异性抗体和细胞因子以及实施GMP标准来改变，以改变人类T细胞的转化方式，最终目标是为Hiv。
Disclosures
帕梅拉·斯金纳博士是马帕姆制药公司的联合创始人兼首席科学官。
Acknowledgments
这项研究得到了NIH资助5R01AI096966-06S1（PS、EC和EB），1UM1AI26617（PS， EC 和 EB、P51OD011106/P51RR0000167 （ER）、MN REACH 授予 5U01HL127479-03 （PS）、1R01A143380-01 （PS 和 EB）、1UM14126617（PS 和 EC）以及 NIAID 内膜研究部和国家卫生研究院针对的抗病毒性抗病毒计划提供的资金。这些研究中使用的抗CD3和反CD28由NIH非人类灵长类试剂资源（R24 OD010976，U24 AI126683）提供。这些研究中使用的IL-2由NCI临床前储存库提供。我们感谢我们在这个CD4-MBL CAR/CXCR5项目中的合作者，亚利桑那大学的伊丽莎白·康尼克博士，NIH的爱德华·阿·伯杰博士，威斯康星州国家灵长类研究中心的伊娃·戈·拉卡兹博士，明尼苏达大学的杰夫·哈特博士和普雷蒂·哈兰博士，哈佛医学院的莱斯利·基恩博士，儿童研究所的凯瑟琳·波拉德博士。我们还感谢明尼苏达大学的斯科特·麦基弗博士、弗雷德·哈钦森癌症中心的克里斯托弗·彼得森博士、NIH的马修·特里维特博士、西雅图儿童医院的阿涅·塔拉塞维丘特博士和儿童研究所的康拉德·罗素·克鲁兹博士在优化这一方案方面提供了非常有益的帮助。我们还感谢明尼苏达大学的奇·潘女士和Jhomary Alegria-Berrocal女士生产伽马病毒，感谢威斯康星大学麦迪逊分校的Kim Weisgrau女士隔离河套猴PBMC。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
References
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