Summary
Delineamos un protocolo de 9 días para la transducción y expansión de células mononucleares de sangre periférica de rhesus macaque que produce células con excelente coexpresión de los genes de interés en número suficiente para estudios de infusión de eficacia celular.
Abstract
Las inmunoterapias emergentes para tratar enfermedades infecciosas y cánceres a menudo implican la transducción de poblaciones celulares con genes que codifican proteínas dirigidas a enfermedades. Por ejemplo, las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR)-T para tratar los cánceres y las infecciones virales implican la transducción de las células T con genes sintéticos que codifican moléculas CAR. Las moléculas CAR hacen que las células T reconozcan y maten específicamente el cáncer o las células infectadas viralmente. Las células también pueden ser co-transducidas con otros genes de interés. Por ejemplo, las células pueden ser co-transducidas con genes que codifican proteínas que dirigen las células a ubicaciones específicas. Aquí, presentamos un protocolo para transducir células mononucleares de sangre periférica primaria (PPBCM) con genes que codifican un CAR específico del virus y la molécula de folículo de células B que homing tipo 5 (CXCR5). Este procedimiento toma nueve días y da como resultado poblaciones transducidas de células T que mantienen un fenotipo de memoria central. Se ha demostrado que el mantenimiento de una memoria central o un fenotipo menos diferenciado se asocia con la persistencia de las células después de la infusión. Además, las células producidas con este método muestran altos niveles de viabilidad, altos niveles de co-expresión de los dos genes transducidos, y cantidades lo suficientemente grandes de células para la infusión inmunoterapéutica. Este protocolo de nueve días se puede utilizar ampliamente para los enfoques de inmunoterapia de células CAR-T y otros sellos. Los métodos descritos aquí se basan en estudios presentados en nuestras publicaciones anteriores.
Introduction
Las inmunoterapias celulares están emergiendo como un nuevo medio para tratar enfermedades como cánceres y enfermedades infecciosas. Estos métodos de inmunoterapia a menudo implican manipular genéticamente las células terapéuticas para expresar moléculas específicas. Por ejemplo, las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) están diseñadas para expresar una molécula CAR que tiene un dominio extracelular que une específicamente moléculas en células enfermas y un dominio de señalización que activa las células inmunitarias para matar a la célula enferma. Las células T CAR se utilizan con éxito en inmunoterapias contra el cáncer, y han sido particularmente eficaces en el tratamiento de las leucemias de células B1,2,3. Las células CAR-T también se están desarrollando para tratar infecciones virales como el VIH. Los CAR específicos del VIH se dirigen a las proteínas de envoltura en la superficie de las células infectadas viralmente4. Las células inmunoterapéuticas también se pueden diseñar para expresar moléculas de localización para dirigir las células terapéuticas a lugares de tejido específicos. Hemos desarrollado vectores que transducen tanto un CAR específico del virus como la molécula de afectación del folículo linfoide CXCR55.
La replicación viral de algunos virus, incluido el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus de inmunodeficiencia simio (SIV), se concentra dentro de los folículos de células B en los tejidos linfoides secundarios6. Los folículos de células B son sitios algo privilegiados inmunes en los que niveles bajos de CTL específicos del virus permiten la replicación viral en curso7,8. Por estas razones, apuntar a células T específicas del VIH/SIV en el folículo a través de la expresión de CXCR5 es una estrategia para la eliminación del reservorio folicular de células infectadas viralmente9,10. Específicamente, estamos apuntando a células T CAR específicas de SIV a los folículos celulares B a través de la coexpresión CXCR5.
En este protocolo describimos un método para transducir CAR/CXCR5 y ampliar los PPM para producir células T CAR/CXCR5 de cantidades suficientes para la infusión terapéutica. Las células transducidas con estos métodos mantienen un fenotipo de memoria central. Los estudios han demostrado que las células con un fenotipo menos diferenciado, como las células T de memoria central y las células madre de memoria T, persisten mejor que las células más diferenciadas11,12. Además, muchos protocolos diseñados para producir células transferidas de forma adoptiva tienen tiempos de cultivo relativamente largos que dan como resultado células que tienen un fenotipo más diferenciado y una persistencia reducida13. Además, las células transferidas de forma adoptiva con largos tiempos de cultivo se acumulan dentro de los pulmones en lugar de tejidos linfoides diana en el macaco14,,15. En los métodos que describimos y demostramos aquí, transducimos y expandimos rápidamente los PMAC de macaco rhesus para producir células T transducidas que mantienen un fenotipo de memoria central.
Los glóbulos T CD4 y CD8 están incluidos en nuestro enfoque de inmunoterapia. Esta población de células mixtas se eligió porque, en los ensayos clínicos, la ausencia de células T CD4+ en el producto de células T CD8+ se correlacionó con un fallo de células T CD8 infundidas para persistir 16. Los métodos descritos aquí comienzan activando los PPM con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 que estimulan poderosamente el receptor de células T y proporcionan una señal coestimulante para evitar la anergy aclono17,18.
Después de la activación, las células son transducidas con un vector gammarretroviral que codifica un CAR específico del virus y la molécula de afectación linfoide CXCR5. Las células transducidas se expanden utilizando placas diseñadas para la propagación celular no adherente que tienen una membrana permeable al gas en la base. Esta membrana permite el intercambio de gas en la parte inferior del pozo que conduce a una mayor supervivencia celular y la disponibilidad de nutrientes19. Usando estos métodos, se pueden producir suficientes células funcionales en un período de tiempo de 9 días para estudios de infusión in vivo. Si bien este protocolo está diseñado para transducir y expandir las células T de rhesus macaco, con ligera modificación de los anticuerpos de activación específicos de la especie, se puede utilizar con células de otras especies. Estos métodos se basan en nuestros estudios publicados anteriormente9,20.
Protocol
NOTA: Este protocolo de transducción PBMC rhesus requiere el uso de un vector gammaretroviral. Tenga en cuenta que el gammaretrovirus puede ser producido en el laboratorio o subcontratado a una empresa de producción viral. En la producción de laboratorio se puede llevar a cabo con el protocolo descrito en el paso 1 y el virus puede ser titered como se describe en el paso 2. Si el virus se produce in situ o por una empresa de producción, se debe determinar un MOI (relación de viriones infecciosos con células en cultivo), como se describe en el paso 3, para cada preparación viral recién producida y las células de interés.
ADVERTENCIA: Trabajar con vectores gammaretrovirales u otros vectores retrovirales requiere las precauciones de seguridad adecuadas, como el uso de capas de laboratorio y dobles capas de guantes. Toda manipulación del virus debe ocurrir en la campana de bioseguridad. Todos los pipetas deben descontaminarse en una solución de 10% de lejía durante 30 min. Todos los residuos infecciosos líquidos deben descontaminarse con una concentración final de 10% de lejía. La contención secundaria, con un sello que impide la liberación de aerosoles microbiológicos, es necesaria para la centrifugación
1. Producción del stock gammaretroviral
- Células de placa 293T para transfección. Una preparación completa del virus requiere 12 matraces T75 a 4,5 x 106 células/matraz en el medio eagle modificado (DMEM) de Dulbecco + 10% suero bovino fetal (FBS) sin antibióticos.
- Permita que las células crezcan durante la noche a 37 oC antes de la transfección.
- Diluir 60 ml de reactivo de transfección en medios séricos reducidos de 1,5 ml. Prepare un tubo para cada matraz. Incubar durante 5 minutos a RT.
- Para cada matraz, prepare un tubo que contenga 1,5 ml de medios séricos reducidos y los siguientes plásmidos: 9,0 g de plásmido de transferencia que contenga el gen o genes de interés, 3 g de RD114 y 1,2 g de VSV-G (plásmidos de sobre) y 3 g de mordaque/pol.
NOTA: Los genes envolvente y gag/pol son necesarios para el empaquetado retroviral. Para nuestra producción retroviral, añadimos tanto el sobre RD114 como, para mayor estabilidad, una pequeña cantidad de sobre VSV-G. - Añadir plásmidos diluidos (paso 1.4) al reactivo de transfección diluido (paso 1.3). Mezclar suavemente. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
- Células de alimentación de 5 ml de medios frescos y añadir 3 ml de mezcla de reactivo/plásmido por matraz e incubar durante 5-6 h a 37oC.
- Añadir 5 ml adicionales de medio fresco a los matraces e incubar durante 42-43 h a 37oC.
- Después de un tiempo total de transfección de 48 h, recoger los medios y centrifugar a 1282 x g durante 3 minutos a 4 oC para eliminar los restos celulares.
- Alícuota en volúmenes apropiados para uso futuro, flash congelar el virus en un baño de etanol / hielo seco y almacenar a -80 oC.
2. Titering the Gammaretrovirus
NOTA: Es posible que se necesiten varias diluciones de virus para obtener un valor válido.
- Placa 293T células a 600.000 células/pozo en una placa de 6 pocillos e incubar las placas durante 24 h a 37oC.
- Retire el medio de las células y agregue la cantidad deseada de DMEM + 10% FBS al 293T (2 ml de volumen total del virus).
- Añadir el virus al pozo correspondiente y girar suavemente para mezclar. Por ejemplo, agregue 200 sL, 100 s, 50 s y 25 l respectivamente a 4 pozos. Incluya un pozo sin virus para la citometría de flujo (muestra simulada).
- Incubar durante 48 h a 37oC.
- Pruebe las células 293T agregando 0,5 ml de trippsina-EDTA e incubando durante 4 min a 37 oC. Detenga la trippsina añadiendo 1,5 mL de DMEM + 10% FBS. Cuente las células y determine la viabilidad con un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
- Para utilizar el contador de celdas, agregue 10 s de celdas a 10 s l de trippan azul, mezcle, cargue la diapositiva de la cámara e insértela en el contador. Pulse el botón "capturar" para contar las celdas.
- Recoja 0.5–1 x 106 células y evalúe los niveles de CAR y CXCR5 por citometría de flujo (véase el paso 9.5). La expresión de CD4 o MBL junto con CXCR5 identificará las células 293T transducidas que co-expresan el CAR y el CXCR5. Consulte anticuerpos reactivos en el paso 9.5.1.
- Calcular el titer viral.
NOTA: Elija la muestra con un nivel de transducción del 20% o menos para el cálculo del valorador.- Utilice la siguiente fórmula para calcular el valorador:
unidades de transducción/ml (número de células en cultivo)(% de las células transducidas)/volumen de virus añadidos al cultivo
- Utilice la siguiente fórmula para calcular el valorador:
3. Determinar el MOI óptimo para una preparación viral recién producida y las células de interés
- Siga el protocolo de transducción (secciones 4-9) con PBL primarios y dos diluciones de la preparación gammaretroviral.
- Evaluar el nivel de expresión de los genes de interés por citometría de flujo (paso 9.5).
- Elija una concentración de virus que permita la máxima transducción sin pérdida de viabilidad celular.
4. Preparación de placas para la activación de células T por revestimiento de pozos con anticuerpos anti-CD3
- Preparar el anticuerpo cd3 antimacaco (FN18) diluyendo la culata a 10 g/ml en solución salina con fosfato tampón (PBS).
- Dispensar 2 ml/bien en placas de 6 pocillos. Incubar a 37oC durante 2 h. Alternativamente, las placas se pueden incubar durante la noche a 4oC.
- Aspirar el PBS y los anticuerpos no unidos. Enjuague los pozos dos veces con 2 ml de PBS y utilícelo inmediatamente para placar PBMCs.
5. Estimular los PPC Rhesus con Placa enlazada Anti-CD3 y Soluble Anti-CD28
- Descongelar los PPC de resus primarios en un baño de agua de 37 oC, con agitación suave, hasta que sólo quede una pequeña cantidad de hielo.
- En la capucha, pipetee suavemente las células en un tubo cónico. Enjuague el vial con 1 ml de medio básico y agréguelo lentamente a las células. A continuación, agregue lentamente 9 ml adicionales de medio básico caliente a las células.
NOTA: Este paso se puede escalar verticalmente, pero nunca descongelar más de 4 viales a la vez. - Centrífuga a 600 x g durante 5 min a 22oC para peletizar las células. Aspirar el sobrenadante y luego resuspender el pellet en una pequeña cantidad de medio de crecimiento. Elija un volumen tal que la concentración de células supere 2 x 106 células/ml en este punto ya que la concentración final debe ser 2 x 106 células/ml.
- Mancha las células con trippan azul y cuenta las células para determinar el número de células viables.
NOTA: Esto se puede hacer con un hemocitómetro estándar o un contador de celdas automatizado. Utilizamos un contador de celdas automatizado que muestra la viabilidad y el número de celdas vivas.- Para utilizar el contador, agregue 10 s de celdas a 10 ol de color azul trypan, mezcle, cargue la diapositiva de la cámara e insértela en el contador. Pulse el botón "capturar" para contar las celdas.
- Calcular el número total de células multiplicando la concentración celular por volumen y luego diluir las células a 2 x 106 células / ml en el medio de crecimiento. Antes del enchapado, añada anti-CD28 a una concentración final de 5 g/ml para proporcionar una señal coestimulante necesaria para la activación de la célula T.
- Pipetear las células en placas recubiertas anti-CD3. Añadir 3–6 x 106 células por pozo (un buen objetivo es 4 x 106 celdas en medios de 2 ml por pozo) e incubar durante 2 días a 37 oC en 5% CO2.
6. Preparación de placas recubiertas de fibronectina
NOTA: Las células PBMC y T expresan los receptores de integrina VLA-4 o VLA-5 y son buenos objetivos para la transducción mediada por fibronectina.
- Antes de recubrir las placas, primero prepare el reactivo de fibronectina diluyéndolo 1:100 en PBS estéril.
- Pipetear 2 ml de la solución estéril de fibronectina en cada pocal de una placa de 6 pocillos. Placas de roca suavemente durante 2 h a temperatura ambiente.
NOTA: En este paso se deben utilizar platos o platos de cultivo de tejidos no tratados de grado celular. - Retire la solución de fibronectina por aspiración y luego bloquee con 1 ml de albúmina sérica estéril 2% bovina (BSA, Fracción V) en PBS. Mece las placas a temperatura ambiente durante 30 min.
- Aspirar la solución BSA y lavar la placa con 2 ml de PBS. Después de la aspiración del PBS, las placas recubiertas de fibronectina se pueden sellar con envoltura de sello y almacenarse a 4 oC durante un máximo de una semana.
NOTA: Normalmente preparamos las placas un día antes de la transducción.
7. Transducción de PPC de rhesus activados
ADVERTENCIA: Trabajar con vectores virales o con PMAC de macaco rhesus requiere la utilización de las precauciones de seguridad adecuadas, como el uso de capas de laboratorio y dobles capas de guantes. Toda la manipulación del virus y las células debe ocurrir en la campana de bioseguridad. Todos los pipetas deben descontaminarse en una solución de 10% de lejía durante 30 min. Todos los residuos infecciosos líquidos deben descontaminarse con una concentración final de 10% de lejía. Se requiere una contención secundaria con un sello que impide la liberación de aerosoles microbiológicos para la centrifugación.
- Fije el vector transducedor gammarretroviral al pozo recubierto de fibronectina.
- Calentar una centrífuga a 32 oC corriendo a 2000 x g durante unos 30 min.
- Caliente tanto los medios libres de suero como los medios de crecimiento en un baño de agua de 37 oC.
- Descongelar el virus sobre hielo o arremolinando suavemente el vial en un baño de agua de 37 oC hasta que solo quede una pequeña cantidad de hielo. Para evitar la degradación de la preparación viral, no permita que el contenido se caliente.
- Diluir el retrovirus a una multiplicidad óptima predeterminada de infección (MOI) en un medio libre de suero.
NOTA: Con nuestro gammaretrovirus y rhesus PBMC, hemos encontrado que un MOI de 0.5 es óptimo.- Ejemplo de dilución: Para recubrir 4 poqueros con virus y añadir 1,5 x 106 células, (4)(1,5 x 106)(0,5) a 3 x 106 TU son necesarios. Si el titor viral es de 1,1 TU/ml, utilice el virus de 2,7 ml en medios de 5,3 ml para un volumen total de 8 ml.
- Añadir 2 ml de retrovirus diluido a cada pocal de la placa recubierta de fibronectina.
- Para el control negativo de las células transducidas por simulacros, agregue solo medios a los pozos recubiertos con fibronectina.
- Coloque las placas en la centrífuga precalentada de 32oC en soportes de microplacas con cubiertas bioseguras y centrífuga a 2000 x g durante 2 h.
NOTA: Las placas recubiertas de virus se pueden utilizar inmediatamente o almacenar, con virus, a 4 oC durante la noche. - Para su uso inmediato, aspirar la preparación del virus de los pozos y añadir 2 mL de medio de crecimiento. Evitar que los pozos recubiertos de virus se sequen.
- Placa los PPM estimulados.
- Compruebe las células con un microscopio invertido. Las células deben verse sanas, lo que significa que son redondas, brillantes y refractadas. También deben mostrar una apariencia agrupada que indica estimulación.
- Recoger las células diana y transferirlas a un tubo cónico de 50 ml. Enjuague el pozo una vez con medios de crecimiento de 1 ml y agréguelo al tubo cónico. Cuente el número de celdas vivas con el contador de celdas automatizado como en el paso 5.4.
NOTA: Las células estimuladas se agruparán y este aglutinado puede conducir a dificultades para contar con precisión las células. - Repelar las células en los tubos centrifugando a 600 x g durante 5 min a 32oC. Aspirar el medio del pellet celular y resuspender las células en el medio de crecimiento a una concentración de 1,5 x 106 células/ml.
- A cada pozo recubierto de virus (preparado en el paso 7.1) añadir 1 ml de suspensión celular para un total de 1,5 x 106 células/3 ml. Tenga en cuenta que cada pocto ya contiene un medio de crecimiento de 2 ml. Realice los mismos pasos para las células transducidas por simulacros, pero colóquelas en pozos recubiertos de fibronectina que no recibieron virus.
- Centrifugar las placas a 1000 x g durante 10 min a 32oC.
- Incubar las placas durante 48 h a 37oC por debajo del 5% de CO2.
8. Expansión de las células transducidas
- Dibuje el contenido de los pozos hacia arriba y hacia abajo con una tubería de 5 ml para resuspender las células y luego transferir a un tubo cónico de 50 ml.
- Añadir 1 ml de medios de crecimiento a cada poca y elaborar hacia arriba y hacia abajo con un pipeta de transferencia estéril para eliminar las células adherentes.
- Cuente las celdas para determinar el número total de celdas y la viabilidad utilizando un contador de celdas automatizado como en el paso 5.4.
- Si lo desea, retire 1 x 106 células para la citometría de flujo para evaluar la expresión génica y el fenotipo. Consulte el paso 9.5.1 y la Tabla de materiales para conocer los anticuerpos recomendados y la estrategia de gating.
- Centrifugar las células a 600 x g durante 10 min a 25oC.
- Aspirar el medio y resuspender las células en los medios de expansión a una concentración de 1 x 106 células/ml. Sembrar cada pozo permeable al gas de una placa de 6 pocillos con 5 ml de células. Capa cuidadosamente 25 mL de medios de expansión por pozo.
NOTA: Agregamos las celdas en un pequeño volumen y luego capa de medios restantes para que las celdas permanezcan en la parte inferior del pozo. - Incubar las células sin perturbaciones a 37oC en incubadora de CO2 al 5% durante 4 días.
9. Recolección de células expandidas y evaluación del fenotipo de la población celular transducida
- Recoja las células de los pozos permeables al gas retirando y desechando medios de 20 ml. Se debe tener precaución para evitar perturbar las células.
NOTA: Expandimos las celdas por solo 4 días y recogemos las celdas en este punto. Sin embargo, si se desean días adicionales de cultivo, retire 20 ml de medios sin perturbar las células y reemplácelas por 20 ml de medios de expansión frescos. - Pipeta los medios restantes hacia arriba y hacia abajo para desalojar las células. Los medios deben estar muy turbios si las células han crecido bien.
- Usando una tubería de transferencia estéril, enjuague cada pozo con medios de 3 ml para recoger las células residuales.
- Cuente las celdas con el contador automatizado o un hemocitómetro para comprobar la viabilidad y el número de celda.
- Realizar citometría de flujo para determinar la expresión génica transducida y el fenotipo celular.
- En este ejemplo, determine el fenotipo PBMC de rhesus macaco utilizando anticuerpos dirigidos contra CD4 (M-T477), un clon que es reactivo con rhCD4 endógeno y el RHCD4-MBL CAR; contra CD3 (SP34-2) y CD8 (RPA-T8) que manchan las células T totales y las células T CD8 respectivamente; contra el receptor de la muerte CD95 (DX2) y la molécula coestimulante CD28 (CD28.2) que se utilizan para determinar el fenotipo de memoria de las células; y contra CXCR5 (MU5UBEE) y MBL (3E7) para detectar el CXCR5 y CD4-MBL CAR en las células transducidas.
- La viabilidad de la evaluación se evaluó con un tinte de viabilidad fijable.
- Prepare las células para la citometría de flujo.
- Componer una mezcla maestra de anticuerpos para el número total de tubos. Sube al volumen total con PBS.
- Agregue las células a los tubos de flujo. Coloque 0.5–1 x 106 células por tubo. Incluya controles negativos como celdas no manchadas, así como celdas transducidas simuladas manchadas.
- Añadir 2 ml de PBS a las células, centrifugar a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y decantar.
- Añadir 100 l de mezcla de anticuerpos a los tubos e incubar durante 30 min a RT.
- Añadir 2 mL de PBS, centrífuga a 400 x g durante 5 min en RT y decantar.
- Añadir 300 s de 1% de paraformaldehído e incubar durante 15 min.
- Centrífuga a 400 x g durante 5 min en RT y decantar. Añadir 300 sL de PBS y mezclar.
- En un catómetro de flujo, adquiera 150.000 eventos para cada muestra.
- Analice los datos con el software de análisis de flujo.
NOTA: La estrategia de gating se publicó previamente20.- Para la identificación de células transducidas, células de compuerta en linfocitos, singlets, vivo, CD3+ y MBL+CXCR5+.
- Para la identificación de la población de memoria central, células de compuerta en linfocitos, singlets, CD3+ vivo, CD8+, CD28+ CD95+.
- Utilice las celdas según sea necesario. Las células se pueden utilizar para ensayos in vitro de la función, como un ensayo de migración transwell9 o ensayos de matanza de células in vitro5,9. Las células se pueden utilizar para la infusión en animales. Alternativamente, congele las células restantes en 90% FBS con 10% de sulfóxido de dimetil (DMSO) para su uso o análisis posteriores
NOTA: Si bien aún no se ha establecido una dosis objetivo para la perfusión de células transferidas de forma adoptiva en un macaco rhesus, los estudios de transferencia adoptiva publicados en primates no humanos han utilizado de 0,6 a 1,2 x 107 células/kg21, de 1 a 108 células/kg22 y 1,4 a 8 x 108 células/kg10. Con este rango como pauta, se pueden producir suficientes células para perfusión con este protocolo de 9 días.
Representative Results
Producción celular
Los resultados presentados en esta publicación son similares a los de nuestro trabajo publicado anteriormente9,20. Utilizando el protocolo presentado aquí, esperamos al menos una expansión de 8 veces de las células entre los días 5 y 9 (mediana 11.1 veces, rango 8.7–13 veces). Los pozos permeables al gas se sembraron a una densidad inicial de 5 x 106 células y después de 4 días de crecimiento, logramos una densidad media de 55,6 x 106 células por pozo (rango 43,5–64,8 x 106)(Figura 1A). El conteo de celdas con la exclusión Trypan Blue muestra que las células mantienen una alta viabilidad en todo el protocolo (día 9 mediana 85.8%, rango 83–95%) (Figura 1B). Encontramos variabilidad de animal a animal en la capacidad de las células para expandirse; sin embargo, con una población inicial de 50–100 x 106 células en el día 1, hemos utilizado este protocolo para producir suficientes células para la infusión de rhesus macaque de 1-2 x 108 células/kg.
La co-expresión de los genes transducidos se monitorizó con citometría de flujo(Figura 2A). La expresión de la CAR y CXCR5 en la superficie de las células transducidas fue relativamente estable entre los días 5 y 9 de este protocolo de expansión. En el día 5, una mediana del 42,8% (rango 36,5–46,9%) de las células fueron transducidas con CD4-MBL CAR y CXCR5, mientras que en el día 9, la expresión mediana fue del 47,6% (rango 44.5–64.5%) con una sola ronda de transducción(Figura 2B). Aunque algunos protocolos requieren una segunda ronda de transducción, no hemos visto un beneficio en términos de células transducidas totales al final del protocolo (datos no mostrados).
Fenotipo celular
Las células transducidas fueron analizadas por citometría de flujo para monitorear su fenotipo de memoria. Antes de la transducción y la expansión, se identifican las poblaciones ingenuas de memoria central y memoria del efector (datos no mostrados), pero la población ingenua se pierde con el cultivo y las células son principalmente células de memoria central para el día 5(Figura 3A)y el día 9 (Figura 3B) como se identifica mediante CD95+ CD28+ expresión. El uso de este protocolo de transducción y expansión rápida ha producido células que son principalmente células de memoria central y por lo tanto serán más propensas a proliferar y persistir cuando se infundan en un animal de prueba.
Figura 1: El protocolo de transducción y expansión produce abundantes células transducidas que son altamente viables. (A) Ampliación de las células transducidas de 6 animales diferentes de los días 5 a 9 en los vasos permeables al gas y (B) viabilidad del PBMC transducido de los mismos 6 animales. La exclusión azul de Trypan mediante un contador de celdas automatizado se utilizó para supervisar el número de celda y la viabilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El protocolo de transducción produce células que mantienen la coexpresión de los dos genes transducidos. (A) Una gráfica de flujo representativa de rhesus PBMC el día 9 del protocolo de transducción y expansión que demuestre la expresión tanto del CD4-MBL CAR como del CXCR5. (B) Expresión del CD4-MBL CAR y CXCR5 en PBMC de rhesus transducido de 6 animales diferentes en los días 5 y 9 en cultivo medido por citometría de flujo. Las puertas estaban puestas en vivo, CD3+ células. Las células transducidas se identifican como MBL+ CXCR5+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La mayoría de las células producidas en el protocolo de 9 días tienen un fenotipo de memoria central. Parcelas representativas de citometría de flujo de (A) día 5 y (B) día 9 CAR/CXCR5 transducido rhesus PBMC. Las puertas se pusieron en vivo, CD3+, CD8+ células. La memoria central se definió como CD28+ CD95+. La memoria del efector se definió como CD28-, CD95+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo describe una estrategia de producción de inmunoterapia de células T que utiliza un vector gammarretroviral para transducir pBMC macaco rhesus que conduce a la población de células T que expresa una CAR antiviral, así como el receptor de localización folicular, CXCR5. Con un total de 8 días de tiempo de cultivo ex vivo, las células T CAR viables y funcionales se producen en una cantidad que se encuentra dentro del rango publicado10,21,22 utilizado para la perfusión en primates no humanos para pruebas de eficacia preclínica.
El éxito del protocolo de transducción se basa tanto en pMCO sano y estimulado como en preparaciones de calidad del gammaretrovirus. Con el fin de lograr una estimulación y transducción exitosas, es esencial que se tenga el cuidado adecuado en la congelación y el transporte de los PMNC después de la recolección. Idealmente, si las células se recogen fuera del sitio, se envían en nitrógeno líquido y se colocan rápidamente en el almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo. Los PbMC deben ser mitotéticamente activos para poder ser transducidos con éxito por un gammaretrovirus. Uno debe monitorear visualmente para la agrupación de las células después de la estimulación con anti-CD3/anti-CD28. Si no se activa correctamente, se producirá una baja eficiencia de transducción. También es importante controlar la viabilidad en las células estimuladas. La mala viabilidad después del paso de estimulación generalmente conduce a una transducción menos exitosa. Ya sea que las preparaciones de virus se produzcan en el laboratorio o se externalicen, deben almacenarse a -80 oC en alícuotas de un solo uso para evitar ciclos de congelación del deshielo que pueden dañar el virus y afectar la eficiencia de la transducción. El virus debe ser titered para que cantidades consistentes de virus se pueden utilizar en cada experimento. Cuando utilice el virus para la transducción, descongelar el virus rápidamente y almacenar en hielo hasta que sea necesario. La elección de las proteínas promotoras, potenciadoras y envolventes puede afectar la eficiencia de transducción y la expresión del transgén en las células diana. Por lo tanto, un MOI debe ser empíricamente determinado. Además, el uso de un medio diseñado para soportar células T y placas con pozos permeables a gas para la expansión han llevado a una excelente expansión de las células transducidas. Sin embargo, hay variabilidad de animal a animal en la tasa de expansión celular. Recomendamos un estudio de ensayo para determinar la capacidad de una preparación celular en particular para ser transducido y ampliado. Los niveles de expansión son consistentes en transducciones a pequeña y gran escala.
Con el uso de este protocolo, hemos producido hasta 2,5 x 109 células para perfusión en animales de prueba. Aunque hemos encontrado innecesario escalar el protocolo en este momento, el uso de 6 placas de pozo es una limitación a la preparación de células a gran escala y el protocolo requeriría la modificación para producir un mayor número de células. Algunos ejemplos de posibles modificaciones son la realización de la transducción en una bolsa de cultivo recubierta de fibronectina para aumentar el número de células transducidas y utilizar un recipiente de cultivo permeable a gas más grande para el paso de expansión. Aunque todavía no hemos realizado estas alteraciones, utilizan productos disponibles comercialmente y son modificaciones factibles al protocolo actual.
Utilizando este método, hemos producido células transducidas a partir de PBMC aisladas de animales no infectados, animales infectados por el SIV y de animales infectados por el SIV tratados con terapia antirretroviral (TAR). Sin embargo, hemos observado una reducción en la eficiencia de la transducción en las células tratadas con TAR20. Esta reducción se debe presumiblemente a la inhibición de la transcriptasa inversa y/o la integración por parte de los fármacos. Las transducciones de células de animales tratados con TAR requerirán modificaciones a este protocolo, tales como la reducción de los niveles intracelulares de los fármacos ART mediante la interrupción del TAR durante varios días antes de recoger el PBMC o mediante el uso de un vector alternativo que no se ve afectado por los fármacos ART comúnmente en uso.
Es importante que las células producidas para la inmunoterapia sean de un fenotipo mínimamente diferenciado para que persistan después de la perfusión12. Aunque muchos protocolos para la transferencia adoptiva de células requieren largos tiempos de cultivo, un tiempo de cultivo ex vivo reducido se ha correlacionado con una reducción en la diferenciación y una mejora en la función de células T CAR13. El plazo relativamente rápido de este protocolo de transducción y expansión permite el mantenimiento del fenotipo de memoria central deseado mientras sigue produciendo células suficientes para probar su potencial inmunoterapéutico20.
El objetivo de la estrategia de producción de este producto de inmunoterapia de células T es fabricar células T que reconozcan las células infectadas por el SIV, se trafiquen al sitio de replicación viral en el folículo celular B y persistirán en el animal dando como resultado un cura funcional sin necesidad de medicamentos antirretrovirales. Para la traducción a un producto de inmunoterapia humana, este protocolo puede modificarse para transducir las células T humanas mediante el uso de anticuerpos y citoquinas específicos para el ser humano y la implementación de normas GMP con el objetivo final de producir una cura funcional para Vih.
Disclosures
La Dra. Pamela Skinner es la cofundadora y directora científica de MarPam Pharma.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por las subvenciones DE NIH 5R01AI0969666-06S1 (PS, EC y EB), 1UM1AI26617 (PS, CE y EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH grant 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A143380-01 (PS y EB), 1UM14126617 (PS y EC), así como fondos proporcionados por la División de Investigación Intramuros NIAID y el Programa Antiviral Dirigido al SIDA Intramuroso ni NIH. El NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683) proporcionó anti-CD3 y anti-CD28 utilizados en estos estudios. IL-2 utilizado en estos estudios fue proporcionado por el repositorio preclínico NCI. Agradecemos a nuestros colaboradores en este proyecto CD4-MBL CAR/CXCR5, la Dra. Elizabeth Connick en la Universidad de Arizona, el Dr. Edward A Berger en NIAID, NIH, la Dra. Eva G Rakasz en el Wisconsin National Primate Research Center y la Dra. Geoff Hart y la Sra. Preethi Haran en la Universidad de Minnesota, la Dra. Leslie Kean en la Escuela de Medicina de Harvard y la Dra. Catherine Bollard en el Instituto de Investigación Infantil. También agradecemos al Dr. Scott McIvor en la Universidad de Minnesota, al Dr. Christopher Peterson en el Centro de Cáncer Fred Hutchinson, al Dr. Matthew Trivett en el NIH, a la Dra. Agne Taraseviciute en el Hospital Infantil de Seattle y al Dr. Conrad Russell Cruz en el Instituto de Investigación Infantil por su ayuda muy útil para optimizar este protocolo. También reconocemos a la Sra. Chi Phan y a la Sra. Jhomary Alegria-Berrocal de la Universidad de Minnesota por la producción gammarretroviral, y a la Sra. Kim Weisgrau de la Universidad de Wisconsin-Madison por el aislamiento del pBMC de rhesus macaco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
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