Summary
We schetsen een 9-daags protocol voor de transductie en uitbreiding van rhesus macaque perifere bloedmononucleaire cellen die cellen oplevert met een uitstekende co-expressie van de genen van belang in voldoende aantal voor infusie studies van celwerkzaamheid.
Abstract
Opkomende immunotherapieën voor de behandeling van infectieziekten en kankers omvatten vaak transductie van cellulaire populaties met genen die ziektegerichte eiwitten coderen. Chimeric antigen receptor (CAR)-T cellen voor de behandeling van kanker en virale infecties omvatten bijvoorbeeld de transductie van T-cellen met synthetische genen die CAR-moleculen coderen. De CAR moleculen maken de T-cellen specifiek herkennen en doden kanker of viraal geïnfecteerde cellen. Cellen kunnen ook worden gecoötranseerd met andere genen van belang. Cellen kunnen bijvoorbeeld worden geco-transduced met genen die eiwitten coderen die cellen richten op specifieke locaties. Hier presenteren we een protocol om primaire perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) te transduceren met genen die een virusspecifieke CAR coderen en de B-celfollikel homing molecule chemokine receptor type 5 (CXCR5). Deze procedure duurt negen dagen en resulteert in transduced T-celpopulaties die een centraal geheugenfenotype behouden. Onderhoud van een centraal geheugen of minder gedifferentieerd fenotype is aangetoond dat associëren met persistentie van cellen na de infusie. Bovendien vertonen cellen die met deze methode worden geproduceerd een hoge mate van levensvatbaarheid, hoge mate van co-expressie van de twee transgeïnduceerde genen en grote hoeveelheden cellen voor immunotherapeutische infusie. Dit negendaagse protocol kan breed worden gebruikt voor CAR-T cel en andere T-cel immunotherapie benaderingen. De hier beschreven methoden zijn gebaseerd op studies die in onze vorige publicaties zijn gepresenteerd.
Introduction
Cellulaire immunotherapieën ontstaan als een nieuw middel om ziekten zoals kanker en infectieziekten te behandelen. Deze immunotherapie methoden vaak betrekken genetisch manipuleren van therapeutische cellen om specifieke moleculen uit te drukken. Chimeric antigen receptor (CAR) T-cellen zijn bijvoorbeeld ontworpen om een CAR-molecuul uit te drukken dat een extracellulair domein heeft dat specifiek moleculen bindt aan zieke cellen en een signaleringsdomein dat de immuuncellen activeert om de zieke cel te doden. CAR T-cellen worden met succes gebruikt bij immunotherapieën tegen kanker en zijn bijzonder effectief geweest bij de behandeling van B-celleukemie1,2,3. CAR-T cellen worden ook ontwikkeld voor de behandeling van virale infecties zoals HIV. HIV-specifieke CARs richten zich op de envelopeiwitten op het oppervlak van viraal geïnfecteerde cellen4. Immunotherapeutische cellen kunnen ook worden ontworpen om homing moleculen uit te drukken om therapeutische cellen te richten op specifieke weefsellocaties. We hebben vectoren ontwikkeld die zowel een virusspecifieke CAR als het lymfefollikelmolecuul CXCR55transduceren.
Virale replicatie van sommige virussen, waaronder het humane immunodeficiëntievirus (HIV) en het simian immunodeficiëntievirus (SIV), is geconcentreerd in B-celfollikels in secundaire lymfoïde weefsels6. B-celfollikels zijn enigszins immuun bevoorrechte sites waar lage niveaus van virus-specifieke CTL toestaan lopende virale replicatie7,8. Om deze redenen is het richten van HIV/SIV-specifieke T-cellen in de follikel door expressie van CXCR5 een strategie voor de eliminatie van het folliculaire reservoir van viraal geïnfecteerde cellen9,10. Concreet richten we ons op SIV-specifieke CAR T-cellen op B-celfollikels via CXCR5 co-expressie.
In dit protocol beschrijven we een methode om CAR/CXCR5 te transduceren en PBMC's uit te breiden om CAR/CXCR5 T-cellen van voldoende hoeveelheden te produceren voor therapeutische infusie. Cellen die met deze methoden worden getransduced, behouden een centraal geheugenfenotype. Studies hebben aangetoond dat cellen met een minder gedifferentieerd fenotype, zoals t-cellen met centraal geheugen en T-geheugenstamcellen beter blijven bestaan dan meer gedifferentieerde cellen11,12. Bovendien hebben veel protocollen die zijn ontworpen om adoptief overgedragen cellen te produceren relatief lange kweektijden die resulteren in cellen die een meer gedifferentieerd fenotype en verminderde persistentie hebben13. Bovendien, adoptief overgedragen cellen met lange kweektijden verzameld in de longen in plaats van doel lymfeweefsel in rhesus macaque14,15. In de methoden die we hier beschrijven en demonstreren, transduceren en uitbreiden we snel rhesus macaque PBMC's om transduced T-cellen te produceren die een centraal geheugenfenotype behouden.
Zowel CD4- als CD8 T-cellen zijn opgenomen in onze immunotherapie-aanpak. Deze gemengde celpopulatie werd gekozen omdat in klinische studies de afwezigheid van CD4+ T-cellen in het CD8+ T-celproduct werd gecorreleerd met een falen van geïnfundeerde CD8 T-cellen om 16aan te houden. De hier beschreven methoden beginnen met het activeren van PBMC's met anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen die de T-celreceptor krachtig stimuleren en een co-stimulerend signaal geven om klonale anergy17,18te voorkomen .
Na activering worden cellen getransduced met een gammaretrovirale vector die een virusspecifieke CAR en het lymfoïde homing molecuul CXCR5 codeert. Transduced cellen worden vervolgens uitgebreid met behulp van platen ontworpen voor niet-aanhangende cel voortplanting die een gas permeabel membraan aan de basis hebben. Dit membraan maakt gasuitwisseling aan de onderkant van de put leidt tot verbeterde cel overleving en beschikbaarheid van voedingsstoffen19. Met behulp van deze methoden kunnen voldoende functionele cellen worden geproduceerd in een tijdsbestek van 9 dagen voor in vivo infusiestudies. Hoewel dit protocol is ontworpen voor het transduceren en uitbreiden van rhesus macaque T-cellen, met lichte wijziging van de soortspecifieke activerende antilichamen, kan het worden gebruikt met cellen van andere soorten. Deze methoden zijn gebaseerd op onze eerder gepubliceerde studies9,20.
Protocol
OPMERKING: Dit rhesus PBMC transductieprotocol vereist het gebruik van een gammaretrovirale vector. Merk op dat gammaretrovirus kan worden geproduceerd in het lab of uitbesteed aan een virale productie bedrijf. In het lab kan de productie worden uitgevoerd met het protocol geschetst in stap 1 en het virus kan worden getitered zoals beschreven in stap 2. Of het virus nu ter plaatse of door een productiebedrijf wordt geproduceerd, een MOI (verhouding van infectieuze virions tot cellen in cultuur) moet worden bepaald, zoals beschreven in stap 3, voor elke nieuw geproduceerde virale bereiding en de cellen van belang.
LET OP: Werken met gammaretrovirale vectoren of andere retrovirale vectoren vereist de juiste veiligheidsmaatregelen, zoals het gebruik van laboratoriumjassen en dubbele lagen handschoenen. Alle behandeling van het virus moet plaatsvinden in de bioveiligheidskap. Alle pipten moeten worden ontsmet in een oplossing van 10% bleekmiddel gedurende 30 min. Al het vloeibare infectieuze afval moet worden ontsmet met een uiteindelijke concentratie van 10% bleekmiddel. Secundaire insluiting, met een afdichting die het vrijkomen van microbiologische aerosolen voorkomt, is vereist voor centrifugering
1. Productie van de Gammaretrovirale voorraad
- Plaat 293T cellen voor transfection. Een volledig viruspreparaat vereist 12 T75-kolven bij 4,5 x 106 cellen/kolf in dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) zonder antibiotica.
- Laat de cellen 's nachts groeien bij 37 °C voor transfection.
- Verdun 60 μL transfection reagens in 1,5 mL verminderde serummedia. Bereid één buis voor elke kolf. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
- Bereid voor elke kolf een buis voor die 1,5 mL van verminderde serummedia en de volgende plasmiden bevat: 9,0 μg van een overdrachtsplasmide die het gen(en) van belang bevat, 3 μg RD114 en 1,2 μg VSV-G (envelopplasmiden) en 3 μg gag/pol.
LET OP: De envelop en gag / pol genen zijn nodig voor retrovirale verpakking. Voor onze retrovirale productie voegen we zowel de RD114-envelop als, voor extra stabiliteit, een kleine hoeveelheid VSV-G-envelop toe. - Voeg verdunde plasmiden (stap 1.4) toe aan verdund transfection reagens (stap 1.3). Meng voorzichtig. Incubeer gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Voercellen 5 mL verse volledige media en voeg 3 mL transfection reagens/plasmitiemengsel druppelindeper kolf toe en incubeer gedurende 5-6 uur bij 37 °C.
- Voeg nog eens 5 ml vers medium toe aan de kolven en incubeer gedurende 42-43 uur bij 37 °C.
- Verzamel na een totale transfetietijd van 48 uur media en centrifugeer op 1282 x g gedurende 3 min bij 4 °C om celafval te verwijderen.
- Aliquot in de juiste volumes voor toekomstig gebruik, flash bevriezen het virus in een ethanol / droog ijs bad en op te slaan op -80 °C.
2. Titering van het Gammaretrovirus
OPMERKING: Er kunnen verschillende verdunningen van het virus nodig zijn om een geldige titer te verkrijgen.
- Plaat 293T cellen bij 600.000 cellen/put in een 6-well plaat en incubeer de platen voor 24 uur bij 37 °C.
- Verwijder het medium uit de cellen en voeg de gewenste hoeveelheid DMEM + 10% FBS toe aan de 293T (2 mL totaal volume virus).
- Voeg het virus toe aan de overeenkomstige put en draai zachtjes om te mengen. Voeg bijvoorbeeld 200 μL, 100 μL, 50 μL en 25 μL toe aan respectievelijk 4 putten. Neem een put zonder virus voor flow cytometrie (mock sample).
- Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C.
- Trypsinize de 293T cellen door het toevoegen van 0,5 mL trypsin-EDTA en incubatie voor 4 min bij 37 °C. Stop de trypsine door het toevoegen van 1,5 mL Van DMEM + 10% FBS. Tel de cellen en bepaal de levensvatbaarheid met een geautomatiseerd e-celteller of een hemocytometer.
- Als u het celtellerwilt gebruiken, voegt u 10 μL cellen toe aan 10 μL trypanblauw, mengt, laadt u de kamerdia en voegt u het in de toonbank in. Druk op de knop 'vastleggen' om de cellen te tellen.
- Verzamel 0,5-1 x 106 cellen en evalueer de niveaus van CAR en CXCR5 op flowcytometrie (zie stap 9.5). Expressie van CD4 of MBL samen met CXCR5 zal identificeren transduced 293T cellen co-expressing van de CAR en CXCR5. Zie reactieve antilichamen in stap 9.5.1.
- Bereken virale titer.
LET OP: Kies het monster met een transductieniveau van 20% of minder voor de berekening van de titer.- Gebruik de volgende formule om titer te berekenen:
transductieeenheden/mL = (aantal cellen in kweek)(% van de getransducedcellen)/volume van het virus toegevoegd aan de cultuur
- Gebruik de volgende formule om titer te berekenen:
3. Het bepalen van de optimale MOI voor een nieuw geproduceerdviraal preparaat en de cellen van belang
- Volg het transductieprotocol (secties 4–9) met primaire PBMC's en tweevoudige verdunningen van het gammaretrovirale preparaat.
- Beoordeel het expressieniveau van de genen van belang door stromingscytometrie (stap 9.5).
- Kies een concentratie van het virus dat maximale transductie mogelijk maakt zonder verlies van cel levensvatbaarheid.
4. Het voorbereiden van platen voor T Cell Activation door Coating Wells met Anti-CD3 Antilichamen
- Bereid anti-macaque CD3 antilichaam (FN18) voor door de voorraad te verdunnen tot 10 μg/mL in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Doser 2 mL/well in 6-well platen. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Als alternatief kunnen de platen 's nachts worden geïncubeerd bij 4 °C.
- Aanzuigen de PBS en ongebonden antilichamen. Spoel putten twee maal met 2 mL PBS en gebruik onmiddellijk om PBMC's te borden.
5. Stimulerende Rhesus PBMC's met plaatgebonden anti-CD3 en oplosbare anti-CD28
- Ontdooi primaire rhesus PBMC's in een waterbad van 37 °C, met zachte agitatie, totdat er slechts een kleine hoeveelheid ijs overblijft.
- In de kap, voorzichtig pipetteercellen in een kegelvormige buis. Spoel de flacon met 1 mL basismedium en voeg het langzaam toe aan de cellen. Voeg vervolgens langzaam een extra 9 mL warm basismedium toe aan de cellen.
OPMERKING: Deze stap kan worden opgeschaald, maar ontdooinooit meer dan 4 flesjes tegelijk. - Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min bij 22 °C om de cellen te pelleteren. Aanzuigen de supernatant en vervolgens opnieuw schorsen van de pellet in een kleine hoeveelheid groei medium. Kies een volume zodanig dat de concentratie van cellen op dit punt meer dan 2 x 106 cellen/mL zal bedragen, aangezien de uiteindelijke concentratie 2 x 106 cellen/mL moet zijn.
- Vlekcellen met trypan blauw en tellen de cellen om het aantal levensvatbare cellen te bepalen.
LET OP: Dit kan met een standaard hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. We gebruiken een geautomatiseerde celteller die de levensvatbaarheid en het aantal levende cellen weergeeft.- Om de teller te gebruiken, voegt u 10 μL cellen toe aan 10 μL trypan blauw, meng, laad de kamerdia en steek in de toonbank in. Druk op de knop 'vastleggen' om de cellen te tellen.
- Bereken het totale aantal cellen door de celconcentratie te vermenigvuldigen met volume en verdun de cellen vervolgens tot 2 x 106 cellen/mL in groeimedium. Voeg voorafgaand aan de beplating anti-CD28 toe aan een eindconcentratie van 5 μg/mL om een noodzakelijk co-stimulerend signaal te geven voor T-celactivering.
- Pipetteercellen in met anti-CD3 gecoate platen. Voeg 3-6 x 106 cellen per put toe (een goed doel is 4 x 106 cellen in 2 mL media per put) en incubeer gedurende 2 dagen bij 37 °C in 5% CO2.
6. Het voorbereiden van met Fibronectine gecoate platen
OPMERKING: PBMC en T cellen express integrin receptoren VLA-4 of VLA-5 en zijn goede doelen voor fibronectine-gemedieerde transductie.
- Voorafgaand aan het coaten van de platen, eerst fibronectine reagens door verdunnen 1:100 in steriele PBS.
- Pipetteer 2 mL van de steriele fibronectineoplossing in elke put van een 6-well plaat. Voorzichtig rock platen voor 2 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Niet-behandelde, celcultuur-grade weefsel cultuur borden of gerechten moeten worden gebruikt in deze stap. - Verwijder de fibronectineoplossing door aspiratie en blokkeer vervolgens met 1 mL steriel 2% runderserumalbumine (BSA, Fractie V) in PBS. Rock de platen op kamertemperatuur voor 30 min.
- Vergde de BSA-oplossing en was de plaat met 2 mL PBS. Na aspiratie van de PBS kunnen de met fibronectine gecoate platen worden verzegeld met sealwrap en maximaal een week bij 4 °C worden bewaard.
LET OP: We meestal bereiden de platen een dag voor transductie.
7. Transductie van geactiveerde rhesus PBMC's
LET OP: Werken met virale vectoren of met rhesus macaque PBMC's vereist gebruik van de juiste veiligheidsmaatregelen, zoals het gebruik van laboratoriumjassen en dubbele lagen handschoenen. Alle behandeling van het virus en de cellen moet plaatsvinden in de bioveiligheidskap. Alle pipten moeten worden ontsmet in een oplossing van 10% bleekmiddel gedurende 30 min. Al het vloeibare infectieuze afval moet worden ontsmet met een uiteindelijke concentratie van 10% bleekmiddel. Secundaire insluiting met een afdichting die het vrijkomen van microbiologische aerosolen voorkomt, is vereist voor centrifugering.
- Bevestig de gammaretrovirale transducerende vector aan de met fibronectine bedekte put.
- Verwarm een centrifuge tot 32 °C door ongeveer 30 min op 2000 x g te lopen.
- Verwarm zowel serumvrij als groeimedia in een waterbad van 37 °C.
- Ontdooi het virus op ijs of door het flesje zachtjes te wervelen in een waterbad van 37 °C totdat er slechts een kleine hoeveelheid ijs overblijft. Om afbraak van de virale bereiding te voorkomen, laat u de inhoud niet opwarmen.
- Verdun het retrovirus tot een vooraf bepaalde optimale veelheid van infectie (MOI) in serumvrij medium.
OPMERKING: Met ons gammaretrovirus en rhesus PBMC hebben we vastgesteld dat een MOI van 0,5 optimaal is.- Voorbeeldverdunning: Om 4 putten met virus te coaten en 1,5 x 106 cellen toe te voegen, (4)(1,5 x 106)(0,5) = 3 x 106 TU zijn nodig. Als de virale titer 1.1 TU/mL is, gebruik dan 2.7 mL virus in 5.3 mL media voor een totaal volume van 8 mL.
- Voeg 2 mL verdund retrovirus toe aan elke put van de met fibronectine bedekte plaat.
- Voor negatieve controle mock-transduced cellen, voeg media alleen aan de fibronectine-gecoate putten.
- Plaats de platen in de voorverwarmde centrifuge van 32 °C in microplaatdragers met bioveilige afdekkingen en centrifugeer op 2000 x g gedurende 2 uur.
LET OP: Met virussen bedekte platen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of bij het virus 's nachts bij 4 °C worden opgeslagen. - Voor onmiddellijk gebruik, aanzuigen het virus voorbereiding uit de putten en voeg 2 mL van groei medium. Voorkomt dat de met virussen bedekte putten niet drogen.
- Verguld de gestimuleerde PBMC's.
- Controleer de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop. De cellen moeten er gezond uitzien, wat betekent dat ze rond, helder en vuurvast licht zijn. Ze moeten ook een samengeklonterd uiterlijk vertonen dat stimulatie aangeeft.
- Verzamel de doelcellen en breng ze over naar een conische buis van 50 mL. Spoel de put eenmaal met 1 mL groeimedia en voeg toe aan de conische buis. Tel het aantal levende cellen met het geautomatiseerde celteller als in stap 5.4.
OPMERKING: Gestimuleerde cellen worden samengeklonterd en dit samenklonteren kan leiden tot problemen bij het nauwkeurig tellen van de cellen. - Pellet de cellen in de buizen door centrifugeren op 600 x g gedurende 5 min bij 32 °C. Aanzuigen van de media uit de cel pellet en resuspend de cellen in groei medium op een concentratie van 1,5 x 106 cellen/mL.
- Voeg aan elk goed met virussen bedekt (bereid in stap 7.1) 1 mL celsuspensie toe voor een totaal van 1,5 x 106 cellen/3 mL. Merk op dat elke put al 2 mL groeimedium bevat. Voer dezelfde stappen voor mock-transduced cellen, maar plaat ze op fibronectine-gecoate putten die geen virus ontvangen.
- Centrifugeer de platen op 1000 x g gedurende 10 min bij 32 °C.
- De platen voor 48 uur uitbroeden bij 37 °C onder 5% CO2.
8. Uitbreiding van de transgeïnduceerde cellen
- Trek de inhoud van de putten op en neer met een 5 mL pipet om de cellen opnieuw op te schorten en vervolgens over te dragen aan een kegelbuis van 50 mL.
- Voeg 1 mL groeimedia toe aan elke put en stel en neer met een steriele overdrachtpipet om aanhangende cellen te verwijderen.
- Cellen tellen om het totale celaantal en de levensvatbaarheid te bepalen met behulp van een geautomatiseerd celteller zoals in stap 5.4.
- Verwijder indien gewenst 1 x 106 cellen voor stroomcytometrie om genexpressie en fenotype te beoordelen. Zie stap 9.5.1 en de Materiaaltafel voor aanbevolen antilichamen en gatingstrategie.
- Centrifugeer de cellen op 600 x g gedurende 10 min bij 25 °C.
- De media aanzuigen en de cellen in expansiemedia opnieuw opschorten tot een concentratie van 1 x 106 cellen/mL. Zaad elke gasdoorlatende put van een 6-well plaat met 5 mL cellen. Leg voorzichtig een extra 25 mL expansiemedia per put.
OPMERKING: We voegen de cellen toe in een klein volume en laag resterende media, zodat de cellen op de bodem van de put blijven. - Incubeer de cellen 4 dagen ongestoord bij2 37 °C in 5% CO 2-incubator.
9. Verzameling van geëxpandeerde cellen en evaluatie van het fenotype van de transduced celpopulatie
- Verzamel cellen uit gasdoorlatende putten door het verwijderen en weggooien van 20 mL media. Voorzichtigheid is geboden om te voorkomen dat de cellen worden verstoord.
OPMERKING: We breiden de cellen slechts 4 dagen uit en verzamelen de cellen op dit punt. Echter, als extra dagen van cultuur gewenst zijn, verwijder 20 mL van de media zonder verstoring van de cellen en vervang het door 20 mL van verse expansie media. - Pipet de resterende media op en neer om de cellen los te maken. De media moeten zeer bewolkt zijn als de cellen goed zijn gegroeid.
- Met behulp van een steriele overdracht pipet, spoel elke put met 3 mL media om eventuele resterende cellen te verzamelen.
- Tel de cellen met de geautomatiseerde teller of een hemocytometer om te controleren op levensvatbaarheid en celnummer.
- Voercytometrie uit om transduced genexpressie en celfenotype te bepalen.
- In dit voorbeeld, bepalen rhesus macaque PBMC fenotype met behulp van antilichamen gericht tegen CD4 (M-T477), een kloon die reactief is met zowel endogene rhCD4 en de rhCD4-MBL CAR; tegen CD3 (SP34-2) en CD8 (RPA-T8) die respectievelijk de totale T-cellen en CD8 T-cellen bevlekken; tegen de doodreceptor CD95 (DX2) en het co-stimulerende molecuul CD28 (CD28.2) die worden gebruikt om het geheugenfenotype van de cellen te bepalen; en tegen CXCR5 (MU5UBEE) en MBL (3E7) om de CXCR5 en CD4-MBL CAR op de getransduced cells te detecteren.
- De beoordeling van de levensvatbaarheid werd beoordeeld met een vaste levensvatbaarheidskleurstof.
- Bereid cellen voor op stroomcytometrie.
- Make-up een antilichaam master mix voor het totale aantal buizen. Breng tot het totale volume met BEHULP van PBS.
- Voeg de cellen toe aan de buizen. Plaats 0,5-1 x 106 cellen per buis. Neem negatieve controles op, zoals niet-bevlekte cellen en bevlekte mock transduced cellen.
- Voeg 2 mL PBS toe aan de cellen, centrifugeer op 400 x g voor 5 min bij kamertemperatuur (RT) en decant.
- Voeg 100 μL antilichaammengsel toe aan de buizen en incubeer gedurende 30 min bij RT.
- Voeg 2 mL PBS toe, centrifugeer op 400 x g voor 5 min bij RT en decant.
- Voeg 300 μL van 1% paraformaldehyde toe en incubeer gedurende 15 min.
- Centrifugeer op 400 x g voor 5 min bij RT en decant. Voeg 300 μL PBS toe en meng.
- Op een flow cytometer, verwerven 150.000 gebeurtenissen voor elke steekproef.
- Analyseer de gegevens met flow analysis software.
OPMERKING: De gating strategie werd eerder gepubliceerd20.- Voor de identificatie van transgeïnduceerde cellen, poortcellen op lymfocyten, singlets, live, CD3+, en MBL + CXCR5+.
- Voor de identificatie van de centrale geheugenpopulatie, poortcellen op lymfocyten, singlets, live CD3+, CD8+, CD28+ CD95+.
- Gebruik cellen als dat nodig is. Cellen kunnen worden gebruikt voor in vitro testen van de functie, zoals een transwell migratie test9 of in vitro cel doden assays5,9. Cellen kunnen worden gebruikt voor infusie in dieren. Als alternatief u de resterende cellen in 90% FBS invriezen met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) voor later gebruik of analyse
OPMERKING: Hoewel een streefdosis voor infusie van adoptiecellen in een rhesus-macaque nog niet is vastgesteld, hebben gepubliceerde adoptiestudies bij niet-menselijke primaten 0,6 tot 1,2 x 107 cellen/kg21,1 tot 5 x 108 cellen/kg22 en 1,4 tot 8 x 108 cellen/kg10gebruikt. Met dit bereik als richtlijn kunnen met dit 9-daagse protocol voldoende cellen voor infusie worden geproduceerd.
Representative Results
Celproductie
De resultaten in deze publicatie zijn vergelijkbaar met die in ons eerder gepubliceerde werk9,20. Met behulp van het protocol dat hier wordt gepresenteerd, verwachten we ten minste een 8-voudige uitbreiding van cellen tussen dag 5 en 9 (mediaan 11,1 keer, bereik 8,7-13 keer). Gasdoorlatende putten werden gezaaid met een startdichtheid van 5 x 106 cellen en na 4 dagen van groei bereikten we een mediane dichtheid van 55,6 x 106 cellen per put (bereik 43,5–64,8 x 106) (figuur 1A). Celtelling met Trypan Blue-uitsluiting toont aan dat de cellen gedurende het hele protocol een hoge levensvatbaarheid behouden (dag 9 mediaan 85,8%, bereik 83-95%) (figuur 1B). We vinden dier-tot dier variabiliteit in het vermogen van de cellen uit te breiden; Echter, met een beginnende populatie van 50-100 x 106 cellen op dag 1, hebben we dit protocol gebruikt om voldoende cellen te produceren voor rhesus macaque infusie van 1-2 x 108 cellen/kg.
Co-expressie van de transgeïnduceerde genen werd gecontroleerd met flow cytometrie (Figuur 2A). De expressie van de CAR en CXCR5 op het oppervlak van de transduced cellen was relatief stabiel tussen dag 5 en 9 van dit uitbreidingsprotocol. Op dag 5 is een mediaan van 42,8% (bereik 36,5–46,9%) van de cellen werden getransduced met zowel CD4-MBL CAR en CXCR5, terwijl op dag 9 de mediane expressie 47,6% was (bereik 44,5–64,5%) met een enkele transductie(figuur 2B). Hoewel sommige protocollen vragen om een tweede transductieronde, hebben we aan het einde van het protocol geen voordeel gezien in termen van totale transgeïnduceerde cellen (gegevens die niet worden weergegeven).
Celfenotype
Transduced cellen werden geanalyseerd door flow cytometrie om hun geheugen fenotype te controleren. Voorafgaand aan transductie en expansie, naïef, centraal geheugen en effector geheugen populaties worden geïdentificeerd (gegevens niet getoond), maar de naïeve bevolking gaat verloren met het kweken en de cellen zijn voornamelijk centrale geheugencellen door dag 5 (Figuur 3A) en dag 9 (Figuur 3B) zoals geïdentificeerd door CD95+ CD28+ expressie. Het gebruik van dit snelle transductie- en uitbreidingsprotocol heeft cellen geproduceerd die voornamelijk centrale geheugencellen zijn en dus meer kans hebben om zich te vermenigvuldigen en aan te houden wanneer het wordt toegediend in een testdier.
Figuur 1: Het transductie- en expansieprotocol produceert overvloedige transgeïnduceerde cellen die zeer levensvatbaar zijn. aA) Uitbreiding van de transduced cellen van 6 verschillende dieren van dag 5 tot en met 9 in de gaspermeabele vaten enb)de levensvatbaarheid van het getransduced PBMC van dezelfde 6 dieren. Trypan blauwe uitsluiting met behulp van een geautomatiseerde cel teller werd gebruikt om celnummer en levensvatbaarheid te controleren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Het transductieprotocol produceert cellen die co-expressie van de twee transduced genen behouden. (A) Een representatief stroomperceel van rhesus PBMC op dag 9 van het transductie- en uitbreidingsprotocol dat de uitdrukking van zowel de CD4-MBL CAR als de CXCR5 aantoont. bB) Uitdrukking van de CD4-MBL CAR en CXCR5 op transduced rhesus PBMC van 6 verschillende dieren op dag 5 en 9 in cultuur, gemeten aan de beurt aan stromingscytometrie. Gates werden ingesteld op live, CD3+ cellen. Transduced cells are identified as MBL+ CXCR5+. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: De meerderheid van de cellen geproduceerd in het 9-daagse protocol hebben een centraal geheugen fenotype. Representatieve stroomcytometriepercelen van (A) dag 5 en (B) dag 9 CAR/CXCR5-transduced rhesus PBMC. Gates werden ingesteld op live, CD3+, CD8+ cellen. Centraal geheugen werd gedefinieerd als CD28+ CD95+. Effector geheugen werd gedefinieerd als CD28-, CD95+. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Dit protocol schetst een T-cel immunotherapie productiestrategie die gebruik maakt van een gammaretrovirale vector om rhesus macaque PBMC leidt tot T-cel populatie die een antivirale CAR en de folliculaire homing receptor, CXCR5 uitdrukt. Met een totaal van 8 dagen ex vivo cultuurtijd worden levensvatbare, functionele CAR T-cellen geproduceerd in een hoeveelheid die binnen het gepubliceerde bereikligt 10,21,22 gebruikt voor infusie in niet-menselijke primaten voor preklinische werkzaamheidstests.
Het succes van het transductieprotocol is afhankelijk van zowel gezonde, gestimuleerde PBMC's als op kwaliteitspreparaten van het gammaretrovirus. Om een succesvolle stimulatie en transductie te bereiken, is het van essentieel belang dat de juiste zorg wordt genomen bij het invriezen en transporteren van de PBMC's na inzameling. Idealiter, als de cellen worden verzameld off site, ze worden verzonden in vloeibare stikstof en snel geplaatst in de lange termijn vloeibare stikstof opslag. PBMC's moeten mitotisch actief zijn om met succes door een gammaretrovirus te kunnen worden getranserd. Men moet visueel controleren op clustering van de cellen na stimulatie met anti-CD3/anti-CD28. Een storing om goed te activeren zal leiden tot een lage efficiëntie van transductie. Het is ook belangrijk om de levensvatbaarheid in de gestimuleerde cellen te controleren. Slechte levensvatbaarheid na de stimulatiestap leidt meestal tot een minder succesvolle transductie. Of viruspreparaten nu in het lab worden geproduceerd of worden uitbesteed, ze moeten bij -80 °C worden opgeslagen bij aliquots voor eenmalig gebruik om vriesdooicycli te voorkomen die het virus kunnen beschadigen en de transductieefficiëntie kunnen schaden. Het virus moet worden getitered, zodat consistente hoeveelheden virus kan worden gebruikt in elk experiment. Bij het gebruik van het virus voor transductie, ontdooi het virus snel en bewaar op ijs tot dat nodig is. De keuze van promotor-, versterker- en envelopeiwitten kan allemaal van invloed zijn op de transductieefficiëntie en expressie van transgene in doelcellen. Zo moet een MOI empirisch worden bepaald. Bovendien heeft het gebruik van een media die zijn ontworpen om T-cellen en platen met gasdoorlatende putten voor expansie te ondersteunen, geleid tot een uitstekende uitbreiding van de transduced cellen. Er is echter dierlijke tot dierlijke variabiliteit in de celexpansiesnelheid. We raden een studie aan om te bepalen of een bepaald celpreparaat kan worden getransduced en uitgebreid. Expansieniveaus zijn consistent in zowel kleine als grootschalige transductie.
Met behulp van dit protocol hebben we tot 2,5 x 109 cellen geproduceerd voor infusie in proefdieren. Hoewel we het op dit moment overbodig vonden om het protocol op te schalen, is het gebruik van 6 putplaten een beperking tot grootschalige celvoorbereiding en het protocol zou moeten worden aangepast om grotere aantallen cellen te produceren. Voorbeelden van mogelijke wijzigingen zijn het uitvoeren van de transductie in een fibronectin-gecoate kweekzak om het aantal getransduced cellen te verhogen en een groter gasdoorlatende kweekvat te gebruiken voor de expansiestap. Hoewel we deze wijzigingen nog niet hebben aangebracht, maken ze gebruik van commercieel beschikbare producten en zijn ze haalbare wijzigingen in het huidige protocol.
Met deze methode hebben we transgeïnduceerde cellen geproduceerd van PBMC geïsoleerd van niet-geïnfecteerde dieren, met SIV besmette dieren en van met SIV besmette dieren die met antiretrovirale therapie zijn behandeld (ART). We hebben echter een vermindering van de transductieefficiëntie in de met ART behandelde cellen20opgemerkt. Deze vermindering is vermoedelijk te wijten aan de remming van omgekeerde transcriptase en / of integrase door de drugs. Transductions van cellen van met ART behandelde dieren vereisen wijzigingen in dit protocol, zoals het verminderen van de intracellulaire niveaus van de ART-geneesmiddelen door ART enkele dagen te stoppen voordat het PBMC wordt verzameld of door het gebruik van een alternatieve vector die niet wordt beïnvloed door de ART-geneesmiddelen die vaak in gebruik zijn.
Het is belangrijk dat cellen die voor immunotherapie worden geproduceerd, een minimaal gedifferentieerd fenotype hebben, zodat ze na de infusie blijven bestaan12. Hoewel veel protocollen voor adoptieve overdracht van cellen lange kweektijden vereisen, is een verminderde ex vivo-kweektijd gecorreleerd met zowel een vermindering van differentiatie als een verbetering van de CAR T-celfunctie13. Het relatief snelle tijdsbestek van dit transductie- en uitbreidingsprotocol maakt het mogelijk om het gewenste centrale geheugenfenotype te behouden en tegelijkertijd voldoende cellen te produceren voor het testen van hun immunotherapeutische potentieel20.
Het doel van de productiestrategie voor dit T-cel immunotherapie product is om T-cellen te produceren die SIV-geïnfecteerde cellen zullen herkennen, zal verkeer naar de site van virale replicatie in de B-celfollikel en zal blijven bestaan in het dier wat resulteert in een lange termijn functionele genezing zonder noodzaak van anti-retrovirale geneesmiddelen. Voor vertaling naar een menselijk immunotherapieproduct kan dit protocol worden aangepast om menselijke T-cellen om te leiden door het gebruik van mensspecifieke antilichamen en cytokinen en de implementatie van GMP-normen met als uiteindelijk doel een functionele Hiv.
Disclosures
Dr Pamela Skinner is de mede-oprichter en chief scientific officer van MarPam Pharma.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidies 5R01AI09696666 (PS, EC en EB), 1UM1AI26617 (PS, EC en EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH-subsidie 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A143380-01 (PS en EB), 1UM14126617 (PS en EC) en fondsen die worden verstrekt door de NIAID-afdeling van Intramuraal Onderzoek en het NIH Intramurale AIDS-programma. Anti-CD3 en anti-CD28 gebruikt in deze studies werd geleverd door de NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 gebruikt in deze studies werd geleverd door de NCI Preclinical Repository. Wij danken onze medewerkers in dit CD4-MBL CAR/CXCR5 project, Dr. Elizabeth Connick aan de Universiteit van Arizona, Dr. Edward A Berger bij NIAID, NIH, Dr. Eva G Rakasz van het Wisconsin National Primate Research Center en Dr. Geoff Hart en Mevrouw Preethi Haran aan de Universiteit van Minnesota, Dr. Leslie Kean aan de Harvard Medical School en Dr. Catherine Bollard van het Children's Research Institute. We danken ook Dr Scott McIvor aan de Universiteit van Minnesota, Dr Christopher Peterson op het Fred Hutchinson Cancer Center, Dr Matthew Trivett op de NIH, Dr Agne Taraseviciute in Seattle Children's Hospital, en Dr Conrad Russell Cruz op The Children's Research Institute voor hun zeer nuttige hulp bij het optimaliseren van dit protocol. We erkennen ook dankbaar mevrouw Chi Phan en mevrouw Jhomary Alegria-Berrocal aan de Universiteit van Minnesota voor gammaretrovirale productie, en mevrouw Kim Weisgrau aan de Universiteit van Wisconsin-Madison voor isolatie van rhesus macaque PBMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
References
- Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Sadelain, M., Rivière, I., Riddell, S. Therapeutic T cell engineering. Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).
- Kuhlmann, A., Peterson, C. W. Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure. Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).
- Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity. Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).
- Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).
- Connick, E., Mattila, T., et al. CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue. The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).
- Connick, E., Folkvord, J. M., et al. Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL. The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).
- Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication. Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).
- Ayala, V. I., Deleage, C., et al. CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering. Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).
- Redeker, A., Arens, R. Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination. Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).
- Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting Through Subsets. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
- Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection. The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).
- Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).
- Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies. Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).
- Chambers, C. A., Allison, J. P. Costimulatory regulation of T cell function. Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).
- Schwartz, R. H. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).
- Bajgain, P., Mucharla, R., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015 (2014).
- Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).
- Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
- Berger, C., Sommermeyer, D., et al. Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells. Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).
