Summary
Hücre etkinliğinin infüzyon çalışmaları için yeterli sayıda ilgi genlerinin mükemmel bir şekilde ifade edilen hücreleri veren rhesus makak periferik kan mononükleer hücrelerinin transdüksiyonu ve genişlemesi için 9 günlük bir protokol özetliyoruz.
Abstract
Bulaşıcı hastalıkları ve kanserleri tedavi etmek için ortaya çıkan immünoterapiler genellikle hastalık hedefleyen proteinleri kodlayan genler ile hücresel popülasyonların transdüksiyon içerir. Örneğin, kanserleri ve viral enfeksiyonları tedavi etmek için şimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücreleri CAR moleküllerini kodlayan sentetik genler ile T hücrelerinin transdüksiyon içerir. CAR molekülleri T hücreleri özellikle tanımak ve kanser veya viral enfekte hücreleri öldürmek olun. Hücreler de ilgi diğer genler ile birlikte transduced olabilir. Örneğin, hücreler, hücreleri belirli konumlara hedefleyen proteinleri kodlayan genlerle birlikte trans-transdüktör olabilir. Burada, virüse özgü CAR'ı ve B hücre folikülü homing molekülü kemokin reseptör tipi 5 'i (CXCR5) kodlayan genlerle birincil periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMCs) iletme protokolü salıyoruz. Bu işlem dokuz gün sürer ve merkezi bir bellek fenotip korumak transduced T hücre popülasyonları sonuçları. Merkezi bir bellek veya daha az farklılaştırılmış fenotip bakımı hücrelerin infüzyon sonrası kalıcılığı ile ilişkilendirmek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu yöntemle üretilen hücreler yüksek düzeyde canlılık, iki transduced genin yüksek düzeyde birlikte ekspresyonu ve immünterapötik infüzyon için yeterli miktarda hücre göstermektedir. Bu dokuz günlük protokol car-t hücre ve diğer T hücre immünoterapisi yaklaşımları için geniş olarak kullanılabilir. Burada açıklanan yöntemler önceki yayınlarımızda sunulan çalışmalara dayanmaktadır.
Introduction
Hücresel immünoterapiler kanser ve bulaşıcı hastalıklar da dahil olmak üzere hastalıkların tedavisinde yeni bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bu immünoterapi yöntemleri genellikle belirli molekülleri ifade etmek için terapötik hücreleri genetik manipüle içerir. Örneğin, şimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri özellikle hastalıklı hücreler ve hastalıklı hücre öldürmek için bağışıklık hücreleri tetikleyen bir sinyal etki alanı molekülleri bağlayan bir ekstrasellüler etki alanı olan bir CAR molekülü ifade etmek için tasarlanmıştır. CAR T hücreleri kanser immünoterapilerde başarıyla kullanılmaktadır, ve B hücreli lösemi tedavisinde özellikle etkili olmuştur1,2,3. CAR-T hücreleri de HIV gibi viral enfeksiyonları tedavi etmek için geliştirilmiştir. HIV'e özgü CAR'lar, viral enfekte hücrelerin yüzeyindeki zarf proteinlerini hedeflez4. İmmünoterapötik hücreler de belirli doku konumlarına terapötik hücreleri hedef homing molekülleri ifade etmek için tasarlanmış olabilir. Hem virüse özgü CAR hem de lenfoid folikül homing molekülü CXCR55'inakleden vektörler geliştirdik.
İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ve simian immün yetmezlik virüsü (SIV) dahil olmak üzere bazı virüslerin viral replikasyonu, ikincil lenfoid dokularda B hücre folikülleri içinde yoğunlaşmıştır6. B hücre folikülleri virüse özgü CTL düşük seviyelerde devam eden viral çoğaltmaizinbiraz bağışıklık ayrıcalıklı sitelerdir 7 ,8. Bu nedenlerden dolayı, CXCR5 ekspresyonu ile folikül içine HIV / SIV özgü T hücreleri hedefleme viral enfekte hücrelerin foliküler rezervuar ortadan kaldırılması için bir stratejidir9,10. Özellikle, CXCR5 co-ekspresyonu ile SIV'e özgü CAR T hücrelerini B hücre foliküllerine hedefliyoruz.
Bu protokolde, CAR/CXCR5'i aktarma ve pbmc'leri genişleterek terapötik infüzyon için yeterli miktarda CAR/CXCR5 T hücreleri üretmek için bir yöntem tanımlıyoruz. Bu yöntemlerle aktarılan hücreler merkezi bir bellek fenotipini korurlar. Çalışmalar göstermiştir ki daha az farklılaşmış fenotip olan hücreler, merkezi bellek T hücreleri ve T bellek kök hücreleri gibi daha iyi daha fazla farklılaşmış hücrelere göre devam11,12. Buna ek olarak, benimseyen transfer hücreleri üretmek için tasarlanmış birçok protokoller daha farklılaştırılmış fenotip ve azaltılmış kalıcılık13hücreleri neden nispeten uzun kültür süreleri var. Ayrıca, rhesus makak14,,15hedef lenfoid dokular yerine akciğerler içinde birikmiş uzun kültür süreleri ile benimsenen transfer hücreleri . Burada açıkladığımız ve gösterdiğimiz yöntemlerde, merkezi bir bellek fenotipini koruyan transdükse T hücreleri üretmek için rhesus makak PBMC'leri hızla aktarıyor ve genişletiyoruz.
Hem CD4 hem de CD8 T hücreleri immünoterapi yaklaşımımıza dahildir. Bu karma hücre popülasyonu seçilmiştir, çünkü klinik çalışmalarda CD8+ T hücre ürünündeki CD4+ T hücrelerinin yokluğu, 16'dainfüzyon cd8 T hücrelerinin yetersizliği ile ilişkilendirilmiştir. Burada açıklanan yöntemler anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile PBMCs aktive ederek başlar hangi güçlü T hücre reseptörü uyarmak ve klonal anerji önlemek için bir co-uyarıcı sinyal sağlamak17,18.
Aktivasyondan sonra hücreler virüse özgü CAR'ı ve lenfoid homing molekülü CXCR5'i kodlayan bir gammaretroviral vektör ile transene bağlanır. Transduced hücreler daha sonra tabanında gaz geçirgen membran var non-yapışık hücre yayılımı için tasarlanmış plakalar kullanılarak genişletilir. Bu membran gelişmiş hücre sağkalım ve besin durumu19yol açan kuyunun dibinde gaz değişimi izin verir. Bu yöntemler kullanılarak in vivo infüzyon çalışmaları için 9 günlük bir zaman diliminde yeterli fonksiyonel hücre üretilebilir. Bu protokol rhesus makak T hücrelerinin transducing ve genişletilmesi için tasarlanmış olsa da, türe özgü aktive antikorlar hafif değişiklik ile, diğer türler hücreleri ile kullanılabilir. Bu yöntemler daha önce yayınlanmış çalışmalarımız9,20dayanmaktadır.
Protocol
NOT: Bu rhesus PBMC transdüksiyon protokolü bir gammaretroviral vektör kullanımını gerektirir. Gammaretrovirus ya laboratuvarda üretilebilir ya da bir viral üretim şirketi için dış kaynaklı unutmayın. Laboratuvar üretiminde adım 1'de belirtilen protokol ile yapılabilir ve virüs 2. Virüsün yerinde mi yoksa bir üretim şirketi tarafından mı üretildiği, her yeni üretilen viral hazırlık ve ilgi hücreleri için 3.
DİkKAT: Gammaretroviral vektörler veya diğer retroviral vektörlerle çalışmak, laboratuvar önlükleri ve çift katmanlı eldiven kullanımı gibi uygun güvenlik önlemleri gerektirir. Virüsün tüm kullanımı biyogüvenlik başlığında meydana gelmelidir. Tüm pipetler 30 dakika boyunca %10 çamaşır suyu çözeltisi içinde dekontamine edilmelidir. Tüm sıvı enfeksiyöz atıklar %10 son konsantrasyonla dekontamine edilmelidir. Mikrobiyolojik aerosollerin salınımını engelleyen bir mühürle ikincil çevreleme, santrifüj için gereklidir
1. Gammaretroviral Stok Üretimi
- Transfeksiyon için plaka 293T hücreleri. Tam bir virüs hazırlığı için Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamında (DMEM) + %10 fetal sığır serumunda (FBS) antibiyotiksiz olarak 4.5 x 106 hücre/şişede 12 T75 şişesi gerekir.
- Hücrelerin transfeksiyondan önce bir gecede 37 °C'de büyümesine izin verin.
- 1,5 mL azaltılmış serum media transfeksiyon reaktifi 60 μL seyreltin. Her şişe için bir tüp hazırlayın. RT'de 5 dakika kuluçkaya yat.
- Her şişe için, 1,5 mL azaltılmış serum media ve aşağıdaki plazmidiçeren bir tüp hazırlayın: 9.0 g bir transfer plazmidi geni(ler) içeren ilgi, 3 μg RD114 ve 1.2 g VSV-G (zarf plazmidleri) ve 3 μg gag/pol.
NOT: Retroviral ambalaj için zarf ve gag/pol genleri gereklidir. Retroviral üretimiçin hem RD114 zarfını hem de daha fazla stabilite için az miktarda VSV-G zarfını ekliyoruz. - Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifine seyreltilmiş plazmidler (adım 1.4) ekleyin (adım 1.3). Yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka.
- Yem hücreleri 5 mL taze tam ortam ve 3mL transfeksiyon reaktifi / plazmid karışımı şişe başına damla ve 37 °C'de 5-6 saat kuluçka ekleyin.
- Şişelere 5 mL daha taze ortam ekleyin ve 37 °C'de 42-43 saat kuluçkaya yatırın.
- Toplam 48 h'lik transfeksiyon süresinden sonra, hücre enkazını temizlemek için 1282 x g'de 3 dk 4 °C'de ortam ve santrifüj toplayın.
- Aliquot ileride kullanım için uygun hacimlerde, flaş bir etanol / kuru buz banyosunda virüs dondurma ve -80 °C'de saklamak.
2. Gammaretrovirus titering
NOT: Geçerli bir titre elde etmek için birkaç virüs seyreltme gerekli olabilir.
- Plaka 293T hücreleri 600.000 hücre/iyi 6-iyi bir plaka ve 37 °C'de 24 saat için plaka kuluçka.
- 293T'ye (2 mL toplam virüs hacmi) istediğiniz miktarda DMEM + %10 FBS ekleyin.
- Ilgili kuyuya virüs ekleyin ve yavaşça karıştırmak için girdap. Örneğin, 4 kuyuya sırasıyla 200°L, 100°L, 50 μL ve 25°L ekleyin. Akış sitometrisi (sahte örnek) için virüssüz bir kuyu ekleyin.
- 37 °C'de 48 saat kuluçka.
- 293T hücreleri 0,5 mL Trypsin-EDTA ekleyerek ve 37 °C'de 4 dakika kuluçkaya yatırarak deneyin. 1,5 mL DMEM + %10 FBS ekleyerek tripsini durdurun. Hücreleri sayın ve otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre ile canlılığı belirleyin.
- Hücre sayacını kullanmak için 10 μL'lik hücreleri trypan mavisine 10 μL ekleyin, karıştırın, hazne slaytını yükleyin ve tezgaha takın. Hücreleri saymak için "yakala" düğmesine basın.
- 0.5-1 x 106 hücreleri toplayın ve akış sitometrisine göre CAR ve CXCR5 düzeylerini değerlendirin (bkz. adım 9.5). CD4 veya MBL'nin CXCR5 ile birlikte ekspresyonu, CAR ve CXCR5'i birlikte ifade eden transduced 293T hücrelerini tanımlar. 9.5.1.'deki reaktif antikorları görün.
- Viral titreyi hesapla.
NOT: Titre hesaplamak için %20 veya daha az transdüksiyon düzeyine sahip numuneyi seçin.- Titreyi hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
transdüksiyon birimleri/mL = (kültürdeki hücre sayısı)transen hücrelerin inkişa mı)/virüs hacmi kültüre eklendi
- Titreyi hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
3. Yeni Üretilen Viral Hazırlık ve İlgi Hücreleri için Optimal MOI belirlenmesi
- Birincil PBMC'ler ve gammaretroviral preparatın iki kat seyreltmeleri ile transdüksiyon protokolünü (bölüm 4-9) uygulayın.
- Akış sitometrisi ile ilgi genlerinin ifade düzeyini değerlendirin (adım 9.5).
- Hücre canlılığı kaybı olmadan maksimal transdüksiyon sağlayan virüs konsantrasyonu seçin.
4. Anti-CD3 Antikorları ile Kaplayarak T Hücre Aktivasyonu için Plakahazırlama Kuyular
- Fosfat tamponlu salinde (PBS) stoku 10 μg/mL'ye seyrelterek antimakak CD3 antikor (FN18) hazırlayın.
- 6 kuyulu tabaklarda 2 mL/kuyu dağıtın. 37 °C'de 2 saat boyunca kuluçkaya yatan plakalar bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yayılabilir.
- PBS ve bağlanmamış antikorları aspire edin. 2 mL PBS ile iki kez durulayın ve hemen plaka PBMC'leri kullanın.
5. Uyarıcı Rhesus PBMCs Plaka bağlı Anti-CD3 ve Çözünür Anti-CD28 ile
- 37 °C'lik bir su banyosunda, hafif bir ajitasyonla, sadece küçük bir miktar buz kalana kadar birincil rhesus PBMC'leri eritin.
- Kaputun içinde, konik bir tüp içine yavaşça pipet hücreleri. Temel orta 1 mL ile şişe durulayın ve hücrelere yavaş yavaş ekleyin. Daha sonra, yavaş yavaş hücrelere sıcak temel orta ek bir 9 mL ekleyin.
NOT: Bu adım büyütülebilir, ancak aynı anda 4 şişeden fazla şişeyi eritemez. - Hücreleri peletlemek için 22 °C'de 5 dk için 600 x g'de santrifüj. Supernatant aspire ve daha sonra büyüme orta küçük bir miktar pelet resuspend. Son konsantrasyon 2 x 106 hücre/mL olması gerektiğinden, bu noktada hücre konsantrasyonunun 2 x 106 hücre/mL'yi aşacağı bir hacim seçin.
- Trypan mavi ile hücreleri leke ve canlı hücrelerin sayısını belirlemek için hücreleri saymak.
NOT: Bu standart bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı ile yapılabilir. Canlı hücrelerin canlılığını ve sayısını gösteren otomatik bir hücre sayacı kullanıyoruz.- Sayacı kullanmak için 10 μL'lik hücreleri 10 μL'lik trypan mavisine ekleyin, karıştırın, hazne kaydırasını yükleyin ve tezgaha takın. Hücreleri saymak için "yakala" düğmesine basın.
- Hücre konsantrasyonu hacmi ile çarparak hücre toplam sayısını hesaplayın ve daha sonra büyüme orta 2 x 106 hücreleri / mL hücreleri seyreltmek. Kaplamadan önce, T hücre aktivasyonu için gerekli bir uyarıcı sinyali sağlamak için 5 g/mL'lik son konsantrasyona anti-CD28 ekleyin.
- Pipette hücreleri anti-CD3 kaplı plakalar içine. Kuyu başına 3-6 x 106 hücre ekleyin (iyi bir hedef kuyu başına 2 mL ortamda 4 x 106 hücredir) ve %5CO2'de 37 °C'de 2 gün kuluçkaya yatırın.
6. Fibronektin Kaplı Plakaların Hazırlanması
NOT: PBMC ve T hücreleri integrin reseptörlerini VLA-4 veya VLA-5 olarak ifade eder ve fibronektin aracılı transdüksiyon için iyi hedeflerdir.
- Plakaları kaplamadan önce, 1:100'ü steril PBS'de seyrelterek fibronektin reaktifini hazırlayın.
- Pipet 2 mL steril fibronektin çözeltisi 6 kuyulu bir plakanın her kuyuiçine. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca hafifçe kaya plakaları.
NOT: Bu adımda tedavi edilmeyen, hücre kültürü sınıf doku kültür plakaları veya yemekleri kullanılmalıdır. - Aspirasyon ile fibronektin çözeltisini çıkarın ve PBS'de 1 mL steril %2 büyükbaş serum albumini (BSA, Fraksiyon V) ile bloke edin. 30 dakika oda sıcaklığında plakaları sallayın.
- BSA çözeltisini aspire edin ve plakayı 2 mL PBS ile yıkayın. PBS aspirasyonundan sonra, fibronektin kaplı plakalar mühür sargı ile kapatılabilir ve 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
NOT: Plakaları genellikle transdüksiyondan bir gün önce hazırlıyoruz.
7. Aktif rhesus PBMCs transdüksiyon
DİkKAT: Viral vektörlerle veya rhesus makak PBMC'lerle çalışmak, laboratuvar önlükleri ve çift kat eldiven kullanımı gibi uygun güvenlik önlemlerinin kullanılmasını gerektirir. Virüsün ve hücrelerin tüm kullanımı biyogüvenlik başlığında meydana gelmelidir. Tüm pipetler 30 dakika boyunca %10 çamaşır suyu çözeltisi içinde dekontamine edilmelidir. Tüm sıvı enfeksiyöz atıklar %10 son konsantrasyonla dekontamine edilmelidir. Mikrobiyolojik aerosollerin salınımını engelleyen bir mühür ile ikincil çevreleme, santrifüj için gereklidir.
- Gammaretroviral transducing vektörü fibronektin kaplı kuyuya takın.
- Yaklaşık 30 dakika boyunca 2000 x g'de koşarak 32 °C'ye kadar bir santrifüj ısıtın.
- 37 °C'lik bir su banyosunda hem serumsuz hem de büyüme ortamını ısıtın.
- Virüsü buzüzerinde eritin veya şişeyi 37 °C'lik bir su banyosunda hafifçe döndürerek sadece küçük miktarda buz kalana kadar eritin. Viral hazırlık bozulmasını önlemek için, içeriğini ısınmak için izin vermez.
- Retrovirüsü serumsuz ortamda önceden belirlenmiş optimal enfeksiyon çokluğu (MOI) ile seyreltin.
NOT: Gammaretrovirus ve rhesus PBMC ile 0.5 moi'nin en uygun olduğunu bulduk.- Örnek seyreltme: 4 kuyuyu virüsle kaplamak ve 1.5 x 106 hücre eklemek için (4)(1.5 x 106)(0.5) = 3 x 106 TU gereklidir. Viral titre 1.1 TU/mL ise, toplam 8 mL hacim için 5.3 mL ortamda 2.7 mL virüs kullanın.
- Fibronektin kaplı plakanın her kuyuya 2 mL seyreltilmiş retrovirüs ekleyin.
- Negatif kontrol mock-transduced hücreleri için, fibronektin kaplı kuyulara tek başına medya ekleyin.
- Plakaları önceden ısıtılmış 32 °C santrifüje biyogüvenli kapaklı mikroplaka taşıyıcılarına yerleştirin ve 2 000 x g'de 2 saat santrifüj edin.
NOT: Virüs kaplı plakalar bir gecede 4 °C'de virüsle birlikte hemen kullanılabilir veya saklanabilir. - Hemen kullanım için, kuyulardan virüs hazırlığı aspire ve büyüme orta 2 mL ekleyin. Virüs kaplı kuyuların kuruması için saklayın.
- Uyarılan PBMC'leri plakalayın.
- Ters mikroskop kullanarak hücreleri kontrol edin. Hücreler sağlıklı görünmelidir, yani yuvarlak, parlak ve ışığı kırmalıdırlar. Onlar da stimülasyon gösteren bir kümeli görünüm göstermelidir.
- Hedef hücreleri toplamak ve 50 mL konik tüp aktarın. 1 mL büyüme ortamı ile kuyuyu bir kez durulayın ve konik tüpe ekleyin. 5.4 adımda olduğu gibi otomatik hücre sayacı ile canlı hücrelerin sayısını sayın.
NOT: Uyarılmış hücreler kümelenir ve bu kümelenme hücreleri doğru saymada zorluklara yol açabilir. - 32 °C'de 5 dk için 600 x g'de santrifüj ederek tüplerdeki hücreleri peletleyin. Hücre peletinden ortam aspirasyon ve 1.5 x 106 hücre/mL konsantrasyonda büyüme ortamı hücreleri resuspend.
- Her virüs kaplı iyi (adım 7.1 hazırlanan) toplam 1.5 x 106 hücre / 3 mL için hücre süspansiyon 1 mL ekleyin. Her kuyunun zaten 2 mL büyüme ortamı içerdiğini unutmayın. Sahte transeksed hücreler için aynı adımları gerçekleştirin ama hiçbir virüs aldı fibronektin kaplı kuyular üzerine plaka.
- 32 °C'de 10 dk için 1000 x g plakaları santrifüj.
- Plakaları %5 CO2'ninaltında 37 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
8. Transeksyon hücrelerinin genişlemesi
- Hücreleri yeniden askıya almak ve daha sonra 50 mL konik bir boruya aktarmak için kuyuların içindekileri 5 mL pipet ile yukarı ve aşağı çekin.
- Her kuyuya 1 mL büyüme ortamı ekleyin ve yapışık hücreleri temizlemek için steril bir aktarım pipeti ile yukarı ve aşağı çizin.
- 5.4 adımda olduğu gibi otomatik bir hücre sayacı kullanarak toplam hücre sayısını ve canlılığı belirlemek için hücreleri sayın.
- İstenirse, gen ekspresyonu ve fenotip değerlendirmek için akış sitometrisi için 1 x 106 hücreyi çıkarın. Önerilen antikorlar ve gating stratejisi için adım 9.5.1 ve Malzeme Tablosu'na bakın.
- Hücreleri 600 x g'de 10 dk 25 °C'de santrifüj edin.
- Ortamı aspire edin ve genişleme medyasındaki hücreleri 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna yeniden askıya alın. 5 mL hücreli 6 kuyulu bir tablanın her gaz geçirgen kuyusu tohumlayın. Kuyu başına ek 25 mL'lik bir genişletme ortamını dikkatlice katmanlayın.
NOT: Hücreleri küçük bir hacim halinde ekliyoruz ve kalan ortamları katmanlıyoruz, böylece hücreler kuyunun dibinde kalıyor. - Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 kuluçka makinesinde 4 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
9. Genişletilmiş hücrelerin toplanması ve transdükse hücre popülasyonunun fenotipinin değerlendirilmesi
- 20 mL ortam çıkararak ve atarak gaz geçirgen kuyularından hücreleri toplayın. Hücreleri rahatsız etmemek için dikkatli olunmalıdır.
NOT: Hücreleri sadece 4 gün genişletiyoruz ve bu noktada hücreleri topluyoruz. Ancak, ek kültür günleri isteniyorsa, hücreleri rahatsız etmeden 20 mL'lik ortamı çıkarın ve 20 mL taze genişleme ortamıyla değiştirin. - Hücreleri yerinden çıkarmak için kalan ortamı yukarı ve aşağı boruyla titretin. Hücreler iyi büyümüşse medya çok bulutlu olmalıdır.
- Steril bir aktarım pipeti kullanarak, artık hücreleri toplamak için her kuyuyu 3 mL ortamla durulayın.
- Canlılık ve hücre numarasını kontrol etmek için otomatik sayaç veya hemositometre ile hücreleri sayın.
- Transduced gen ekspresyonu ve hücre fenotipini belirlemek için akış sitometrisi yapın.
- Bu örnekte, hem endojen rhCD4 hem de rhCD4-MBL CAR ile reaktif olan CD4 (M-T477) karşı antikorlar kullanarak rhesus makak PBMC fenotipini belirleyin; cd3 (SP34-2) ve CD8 (RPA-T8) sırasıyla toplam T hücreleri ve CD8 T hücreleri leke karşı; hücrelerin hafıza fenotipini belirlemek için kullanılan cd95 (DX2) ve ortak uyarıcı molekül CD28 'e (CD28.2) karşı; ve CXCR5 (MU5UBEE) ve MBL (3E7) karşı transduced hücrelerde CXCR5 ve CD4-MBL CAR tespit etmek.
- Canlılığı değerlendirin, düzeltilebilir bir canlılık boyası ile değerlendirildi.
- Akış sitometrisi için hücreleri hazırlayın.
- Tüplerin toplam sayısı için bir antikor ana karışımı makyaj. PBS kullanarak toplam hacmi kadar getirin.
- Akış tüpleri hücreleri ekleyin. Tüp başına 0,5-1 x 106 hücre yerleştirin. Lekelenmemiş hücreler gibi negatif kontroller ve lekeli sahte transdükse hücreleri ekleyin.
- Hücrelere 2 mL PBS, oda sıcaklığında 5 dk (RT) ve decant için 400 x g santrifüj ekleyin.
- Tüplere 100 μL antikor karışımı ekleyin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- 2 mL PBS, 400 x g'de 5 dk RT ve decant santrifüj ekleyin.
- 15 dakika boyunca % 1 paraformaldehit ve kuluçka 300 μL ekleyin.
- 400 x g'de sentrifuge 5 dk RT ve decant. 300 μL PBS ekleyin ve karıştırın.
- Akış sitometresi üzerinde, her örnek için 150.000 olay edinin.
- Akış analizi yazılımı ile verileri analiz edin.
NOT: Gating stratejisi daha önce20yayınlanmıştır .- Transekte hücrelerin belirlenmesi için, lenfositler, singlets, canlı, CD3 + ve MBL + CXCR5 + kapı hücreleri.
- Merkezi bellek popülasyonunun belirlenmesi için, lenfositler, singletlar, canlı CD3+, CD8+, CD28+ CD95+ üzerindeki kapı hücreleri.
- Hücreleri gerektiği gibi kullanın. Hücreler fonksiyonun in vitro tahliller için kullanılabilir, transwell göç tahlil gibi9 veya in vitro hücre öldürme tahlilleri5,9. Hücreler hayvanlara infüzyon için kullanılabilir. Alternatif olarak, kalan hücreleri %90 FBS'de %10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile dondurarak daha sonra kullanmak veya analiz etmek için
NOT: Evlat edinilen hücrelerin rhesus makak içine infüzyonu için hedef doz henüz belirlenmemekle birlikte, insan olmayan primatlarda yayınlanan evlat edinme transfer çalışmaları 0.6 ila 1.2 x 107 hücre/kg21,1 ila 5 x 108 hücre/kg22 ve 1.4-8 x 108 hücre/kg10. Bir kılavuz olarak bu aralık ile, infüzyon için yeterli hücre bu 9 günlük protokol ile üretilebilir.
Representative Results
Hücre üretimi
Bu yayında sunulan sonuçlar, daha önce yayınlanmışçalışmamız9,20'dekilerebenzer. Burada sunulan protokolü kullanarak, 5 ve 9 gün arasında hücrelerin en az 8 kat genişlemesini bekliyoruz (ortanca 11.1 kat, dağılım 8.7-13 kat). Gaz geçirgen kuyular 5 x 106 hücrenin başlangıç yoğunluğunda tohumlandı ve 4 günlük büyümeden sonra kuyu başına 55,6 x 106 hücre (dağılım 43,5-64,8 x 106) ortanca yoğunluk elde ettik(Şekil 1A). Trypan Blue dışlama ile hücre sayımı, hücrelerin protokol boyunca yüksek canlılık larını koruduğunu gösterir (9.gün ortanca %85.8, dağılım %83-95) (Şekil 1B). Biz hücrelerin genişletmek için yeteneği hayvan değişkenlik bulmak; ancak, ilk gün 50-100 x 106 hücreden oluşan başlangıç popülasyonuyla, bu protokolü 1-2 x 108 hücre/kg rhesus makak infüzyonu için yeterli hücre üretmek için kullandık.
Transejen genlerin ortak ekspresyonu akış sitometrisi ile izlendi (Şekil 2A). Transeked hücrelerin yüzeyinde CAR ve CXCR5 ifadesi bu genişleme protokolünün 5 ve 9 gün arasında nispeten kararlı idi. 5. günde ortanca %42.8 (dağılım %36.5-46.9) hücrelerin hem CD4-MBL CAR hem de CXCR5 ile transet edildi, 9. tek bir transdüksiyon turu ile (Şekil 2B). Bazı protokoller ikinci bir transdüksiyon turu gerektirse de, protokolün sonunda toplam transdükse hücreler açısından bir fayda görmedik (veriler gösterilmedi).
Hücre fenotip
Transduced hücreler, hafıza fenotiplerini izlemek için akış sitometrisi ile analiz edildi. Transdüksiyon ve genişlemeden önce, saf, merkezi bellek ve efektör bellek popülasyonları tanımlanır (veriler gösterilmez) ancak mesleğe sahip olarak saf popülasyon kaybolur ve hücreler cd95+ CD28+ ifade ile tanımlı olarak gün 5(Şekil 3A) ve gün 9(Şekil 3B)tarafından merkezi bellek hücreleridir. Bu hızlı transdüksiyon ve genişleme protokolünün kullanımı, öncelikle merkezi bellek hücreleri olan hücreler üretmiştir ve böylece bir test hayvanına aşılandığında çoğalması ve devam etmesi daha olasıdır.
Şekil 1: Transdüksiyon ve genleşme protokolü son derece uygulanabilir bol transduced hücreleri üretir. (A) Gaz geçirgen kaplarda 5 günden 9 güne kadar 6 farklı hayvandan transeed hücrelerin genişlemesi ve(B) aynı 6 hayvandan transduced PBMC canlılığı. Hücre numarasını ve canlılığını izlemek için otomatik bir hücre sayacı kullanarak trypan mavi dışlama kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Transdüksiyon protokolü, iki transekten genin birlikte ekspresyonunu koruyan hücreler üretir. (A) CD4-MBL CAR ve CXCR5'in ifadesini gösteren transdüksiyon ve genleşme protokolünün 9. (B) Cd4-MBL CAR ve CXCR5'in akış sitometrisi ile ölçülen kültürde 6 farklı hayvandan transduced rhesus PBMC'nin ifadesi. Gates canlı, CD3+ hücreleri ayarlandı. Transekin hücreler MBL+ CXCR5+olarak tanımlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 9 günlük protokolde üretilen hücrelerin çoğu merkezi bellek fenotip vardır. (A) gün 5 ve (B) gün 9 CAR/CXCR5-transduced rhesus PBMC temsili akış sitometri arsalar. Kapılar canlı, CD3+, CD8+ hücreleri ayarlandı. Merkezi bellek CD28+ CD95+olarak tanımlanmıştır. Efektör bellek CD28 olarak tanımlandı-, CD95+. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, bir antiviral CAR yanı sıra foliküler homing reseptörü ifade T hücre popülasyonuna yol açan rhesus makak PBMC transduce rhesus makak PBMC bir gamaretroviral vektör kullanan bir T hücre immünoterapi üretim stratejisi özetliyor, CXCR5. Ex vivo kültür süresi toplam 8 gün ile, canlı, fonksiyonel CAR T hücreleri yayınlanan aralığı10içinde bir miktar üretilmektedir10 ,21,22 preklinik etkinlik testi için insan dışı primatlar içine infüzyon için kullanılır.
Transdüksiyon protokolünün başarısı hem sağlıklı, uyarılmış PBMC'lere hem de gammaretrovirus'un kalite hazırlıklarına dayanır. Başarılı stimülasyon ve transdüksiyon elde etmek için, toplama sonrasında PBMC'lerin dondurulması ve taşınmasında uygun özenin sağlanması esastır. İdeal olarak, hücreler saha dışında toplanırsa, sıvı nitrojen içinde sevk edilir ve hızlı bir şekilde uzun süreli sıvı azot depolama yerleştirilir. Bir gammaretrovirüs tarafından başarılı bir şekilde geçirilebilmesi için PBMC'lerin mitotik olarak aktif olması gerekir. Bir anti-CD3/anti-CD28 ile stimülasyon sonra hücrelerin kümelenmesi için görsel olarak izlemek gerekir. Düzgün etkinleştirilmemesi transdüksiyonun düşük verimini sağlayacaktır. Ayrıca uyarılmış hücrelerde canlılığını izlemek için önemlidir. Stimülasyon adımından sonra yetersiz canlılık genellikle daha az başarılı bir transdüksiyona yol açar. Virüs preparatları laboratuvarda üretilse de, dış kaynaklı olsun, virüse zarar verip transdüksiyon verimliliğini bozabilecek donma erime döngülerini önlemek için -80 °C'de tek kullanımlık aliquotlarda saklanmalıdır. Virüs, her deneyde tutarlı miktarda virüs kullanılabilmesi için titreşmelidir. Transdüksiyon için virüs kullanırken, hızlı bir şekilde virüs çözülme ve gerekli kadar buz üzerinde saklayın. Promotör, arttırıcı ve zarf proteinlerin seçimi, hedef hücrelerdeki transdüksiyon verimliliğini ve transgeni etkileyebilir. Bu nedenle, bir MOI ampirik olarak belirlenmelidir. Buna ek olarak, genişleme için gaz geçirgen kuyuları ile T hücreleri ve plakaları desteklemek için tasarlanmış bir ortam kullanımı transduced hücrelerin mükemmel genişlemesine yol açmıştır. Ancak, hücre genişleme hızında hayvandan hayvana değişkenlik vardır. Belirli bir hücre hazırlığının transeve genişletilme yeteneğini belirlemek için bir deneme çalışması öneriyoruz. Genleşme düzeyleri hem küçük hem de büyük ölçekli transdüksiyonlarda tutarlıdır.
Bu protokolün kullanımı ile test hayvanlarına infüzyon için 2,5 x 109 hücre ürettik. Şu anda protokolü ölçeklendirmeyi gereksiz bulsak da, 6 kuyu plakasının kullanımı büyük ölçekli hücre hazırlığıiçin bir sınırlamadır ve protokol daha fazla sayıda hücre üretmek için modifikasyon gerektirir. Potansiyel değişikliklere örnek olarak, transektin kaplı bir kültür çantasında transdüksiyonun transdüktör sayısını artırmak ve genişleme adımı için daha büyük bir gaz geçirgen kültür kabını kullanmak sayılabilir. Henüz bu değişiklikleri yapılmamış olsa da, ticari olarak mevcut ürünleri kullanırlar ve mevcut protokolde uygulanabilir değişikliklerdir.
Bu yöntemi kullanarak, pbmc enfekte olmayan hayvanlardan izole transdüktülür hücreler ürettik, SIV-enfekte hayvanlar ve antiretroviral tedavi ile tedavi SIV enfekte hayvanlardan (ART). Ancak, ART tedavi hücrelerinde transdüksiyon verimliliğinde bir azalmakaydettik 20. Bu azalma muhtemelen ilaçlar tarafından ters transkriptaz ve / veya integrase inhibisyonu kaynaklanmaktadır. ART ile tedavi edilen hayvanlardan hücrelerin transdüksiyonları, PBMC'yi toplamadan önce art'ı birkaç gün durdurarak veya yaygın olarak kullanılan ART ilaçlarından etkilenmeyen alternatif bir vektör kullanarak ART ilaçlarının hücre içi düzeylerini azaltmak gibi bu protokolde değişiklik yapılmasını gerektirecektir.
İmmünoterapi için üretilen hücrelerin minimal diferansiye fenotip olması önemlidir, böylece infüzyon sonrası devam edecektir12. Hücrelerin benimseyen transferi için birçok protokoluzun kültür süreleri gerektirmese de, azaltılmış ex vivo kültür süresi hem farklılaşmada azalma hem de CAR T hücre fonksiyonunda bir iyileşme ile ilişkilendirilmiştir13. Bu transdüksiyon ve genleşme protokolünün nispeten hızlı zaman dilimi hala immünoterapötik potansiyelini test etmek için yeterli hücreleri üretirken istenen merkezi bellek fenotip bakım sağlar20.
Bu T hücre immünoterapi ürün için üretim stratejisinin amacı SIV-enfekte hücreleri tanıyacak T hücreleri üretmektir, B hücre folikülviral çoğaltma sitesine trafik ve uzun vadeli sonuçlanan hayvan devam edecektir anti-retroviral ilaçlara gerek kalmadan fonksiyonel tedavi. Bir insan immünoterapi ürününe çeviri için, bu protokol insana özgü antikorlar ve sitokinler kullanımı ve gmp standartlarının uygulanması yoluyla insan T hücreleri transduce için değiştirilebilir bir fonksiyonel tedavi üreten nihai amacı ile Hıv.
Disclosures
Dr. Pamela Skinner, MarPam Pharma'nın kurucu ortağı ve baş bilimsel görevlisidir.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe 5R01AI0969666-06S1 (PS, EC ve EB), 1UM1AI26617 (PS, EC ve EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH hibe 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A14 3380-01 (PS ve EB), 1UM14126617 (PS ve EC) yanı sıra INtramural Araştırma NIAID Bölümü ve NIH Intramural AIDS Hedefli Antiviral Programı tarafından sağlanan fonlar. Bu çalışmalarda kullanılan anti-CD3 ve anti-CD28 NIH İnsan Dışı Primat Reaktif Ilüder Kaynağı (R24 OD010976, U24 AI126683) tarafından sağlanmıştır. Bu çalışmalarda kullanılan IL-2 NCI Preklinik Deposu tarafından sağlanmıştır. Bu CD4-MBL CAR/CXCR5 projesinde çalışan larımıza, Arizona Üniversitesi'nden Dr. Elizabeth Connick'e, NIAID, NIH'den Dr. Edward A Berger'e, Wisconsin Ulusal Primat Araştırma Merkezi'nden Dr. Eva G Rakasz'a ve Minnesota Üniversitesi'nden Dr. Geoff Hart ve Bayan Preethi Haran'a, Harvard Tıp Fakültesi'nden Dr. Leslie Kean'a ve Çocuk Araştırma Enstitüsü'nden Dr. Catherine Bollard'a teşekkür ediyoruz. Ayrıca Minnesota Üniversitesi'nden Dr. Scott McIvor'a, Fred Hutchinson Kanser Merkezi'nden Dr. Christopher Peterson'a, NIH'den Dr. Matthew Trivett'e, Seattle Çocuk Hastanesi'nden Dr. Agne Taraseviciute'ye ve Bu protokolü optimize etmede çok yardımcı olan Çocuk Araştırma Enstitüsü'nden Dr. Conrad Russell Cruz'a teşekkür ediyoruz. Biz de minnetle Bayan Chi Phan ve Bayan Jhomary Alegria-Berrocal Minnesota Üniversitesi'nde gammaretroviral üretim için, ve Bayan Kim Weisgrau Wisconsin-Madison Üniversitesi'nde rhesus makak PBMC izolasyon için kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
References
- Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Sadelain, M., Rivière, I., Riddell, S. Therapeutic T cell engineering. Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).
- Kuhlmann, A., Peterson, C. W. Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure. Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).
- Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity. Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).
- Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).
- Connick, E., Mattila, T., et al. CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue. The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).
- Connick, E., Folkvord, J. M., et al. Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL. The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).
- Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication. Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).
- Ayala, V. I., Deleage, C., et al. CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering. Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).
- Redeker, A., Arens, R. Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination. Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).
- Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting Through Subsets. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
- Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection. The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).
- Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).
- Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies. Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).
- Chambers, C. A., Allison, J. P. Costimulatory regulation of T cell function. Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).
- Schwartz, R. H. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).
- Bajgain, P., Mucharla, R., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015 (2014).
- Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).
- Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
- Berger, C., Sommermeyer, D., et al. Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells. Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).
