Summary
Vi skitserer en 9-dages protokol for transduktion og udvidelse af rhesus macaque perifere blod mononukleare celler, som giver celler med fremragende co-udtryk for gener af interesse i tilstrækkeligt antal til infusion undersøgelser af celleeffekt.
Abstract
Nye immunterapier til behandling af smitsomme sygdomme og kræft involverer ofte transduktion af cellulære populationer med gener, der koder for sygdomsmodificerende proteiner. For eksempel, kimære antigen receptor (CAR)-T celler til behandling af kræft og virusinfektioner indebærer transduktion af T-celler med syntetiske gener kodning CAR molekyler. CAR molekyler gør T-celler specifikt genkende og dræbe kræft eller viralt inficerede celler. Celler kan også være co-transduceret med andre gener af interesse. For eksempel kan celler være co-transduceret med gener kodning proteiner, der er målrettet celler til bestemte steder. Her præsenterer vi en protokol til at transduceprimære perifere blod mononukleare celler (PBMCs) med gener, der koder en virus-specifik CAR og B-celle follikel homing molekyle chemokinreceptor type 5 (CXCR5). Denne procedure tager ni dage og resulterer i transinducerede T-cellepopulationer, der opretholder en central hukommelsefænotype. Vedligeholdelse af en central hukommelse eller mindre differentieret fænotype har vist sig at associere sig med persistens af celler efter infusion. Desuden viser celler, der er produceret med denne metode, høje niveauer af levedygtighed, høje niveauer af samekspression af de to transinducerede gener og store nok mængder celler til immunterapeutisk infusion. Denne ni-dages protokol kan anvendes bredt til CAR-T celle og andre T-celle immunterapi tilgange. De metoder, der er beskrevet her, er baseret på undersøgelser, der er præsenteret i vores tidligere publikationer.
Introduction
Cellulære immunterapier er ved at opstå som et nyt middel til behandling af sygdomme, herunder kræft og smitsomme sygdomme. Disse immunterapi metoder involverer ofte genetisk manipulere terapeutiske celler til at udtrykke specifikke molekyler. For eksempel er kimære antigen receptor (CAR) T-celler manipuleret til at udtrykke en CAR molekyle, der har en ekstracellulær domæne, der specifikt binder molekyler på syge celler og et signaldomæne, der udløser immunceller til at dræbe den syge celle. CAR T-celler anvendes med succes i kræftimmunterapier og har været særligt effektive til behandling af B-celle leukæmi1,2,3. CAR-T celler er også ved at blive udviklet til behandling af virusinfektioner såsom HIV. HIV-specifikke CAR'er er målrettet mod kuvertproteiner på overfladen af viralt inficerede celler4. Immunoterapeutiske celler kan også manipuleres til at udtrykke homing molekyler til at målrette terapeutiske celler til specifikke væv steder. Vi har udviklet vektorer, der transduce både en virus-specifikke CAR samt lymfoide follikel homing molekyle CXCR55.
Viral replikering af visse vira, herunder human immundefektvirus (HIV) og simian immundefektvirus (SIV), er koncentreret i B-cellefollikler i sekundære lymfoide væv6. B-celle follikler er noget immun privilegerede steder, hvor lave niveauer af virus-specifikke CTL tillader løbende viral replikation7,8. Af disse grunde er målretning mod HIV/SIV-specifikke T-celler i follikelen gennem ekspression af CXCR5 en strategi for eliminering af det follikulære reservoir af viralt inficerede celler9,10. Konkret er vi rettet mod SIV-specifikke CAR T-celler til B-cellefollikler via CXCR5 co-udtryk.
I denne protokol beskriver vi en metode til at transducere CAR/CXCR5 og udvide PBMC'er til at producere CAR/CXCR5 T-celler af tilstrækkelige mængder til terapeutisk infusion. Celler transduceret med disse metoder opretholde en central hukommelse fænotype. Undersøgelser har vist, at celler med en mindre differentieret fænotype, såsom centrale hukommelse T-celler og T-hukommelse stamceller bedre fortsætter end mere differentierede celler11,12. Desuden har mange protokoller, der er designet til at producere adoptivoverførte celler, relativt lange dyrkningstider, der resulterer i celler, der har en mere differentieret fænotype og reduceret persistens13. Desuden, adoptivløst overførte celler med lange kultur gange akkumuleret i lungerne i stedet for mål lymfoide væv i rhesus makak14,15. I de metoder, vi beskriver og demonstrerer her, gennemfører og udvider vi hurtigt rhesus macaque PBMC'er til at producere transinducerede T-celler, der opretholder en central hukommelsesfænotype.
Både CD4- og CD8 T-celler er inkluderet i vores immunterapitilgang. Denne blandede cellepopulation blev valgt, fordi fraværet af CD4+ T-celler i CD8+ T-celleproduktet i kliniske forsøg var korreleret med en fejl i infunderede CD8 T-celler til at vare ved 16. De metoder, der er beskrevet her, begynder med at aktivere PBMC'er med anti-CD3- og anti-CD28-antistoffer , som kraftigt stimulerer T-cellereceptoren og giver et cotimulatorisk signal for at undgå klonanteri17,18.
Efter aktivering transinduceres cellerne med en gammaretroviral vektor, der koder en virusspecifik CAR og lymfehomingsmolekylet CXCR5. Transinducerede celler udvides derefter ved hjælp af plader, der er konstrueret til ikke-klæbende celleformering, og som har en gasgennemtrængelig membran i bunden. Denne membran tillader gasudveksling i bunden af brønden, der fører til forbedret celleoverlevelse og næringsstoftilgængelighed19. Ved hjælp af disse metoder kan der produceres tilstrækkelige funktionelle celler inden for en 9-dages tidsramme for in vivo-infusionsundersøgelser. Mens denne protokol er designet til at transducing og udvide rhesus makak T-celler, med mindre ændring af de artsspecifikke aktiverende antistoffer, kan det bruges med celler fra andre arter. Disse metoder er baseret på vores tidligere offentliggjorte undersøgelser9,20.
Protocol
BEMÆRK: Denne rhesus PBMC-transduktionsprotokol kræver brug af en gammaretroviral vektor. Bemærk, at gammaretrovirus enten kan produceres i laboratoriet eller outsources til et viralt produktionsselskab. I lab produktion kan udføres med protokollen er skitseret i trin 1 og virus kan titered som skitseret i trin 2. Uanset om virusset produceres på stedet eller af et produktionsselskab, bør en MOI (forholdet mellem infektiøse virioner og celler i kultur) som beskrevet i trin 3 bestemmes for hvert nyproduceret viralt præparat og de celler, der er af interesse.
FORSIGTIG: Arbejde med gammaretrovirale vektorer eller andre retrovirale vektorer kræver passende sikkerhedsforanstaltninger såsom brug af laboratoriekitler og dobbelte lag af handsker. Al håndtering af virus skal foregå i biosikkerhedshætten. Alle pipetter skal dekontamineres i en opløsning på 10% blegemiddel i 30 min. Alt flydende infektiøs affald bør dekontamineres med en endelig koncentration på 10% blegemiddel. Sekundær indeslutning med en forsegling, der forhindrer frigivelse af mikrobiologiske aerosoler, er nødvendig for centrifugering
1. Fremstilling af Gammaretroviral bestand
- Plade 293T celler til transfection. Et fuldstændigt viruspræparat kræver 12 T75-kolber ved 4,5 x 106 celler/kolbe i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) + 10% føtal kvægserum (FBS) uden antibiotika.
- Lad cellerne vokse natten over ved 37 °C før transfektion.
- 60 μL transfektionsreagens fortyndes i 1,5 ml reduceret serummedie. Der fremstilles et rør til hver kolbe. Inkuber i 5 minutter på RT.
- For hver kolbe fremstilles et rør, der indeholder 1,5 ml reduceret serummedier, og følgende plasmider: 9,0 μg af en overførselsplasmid, der indeholder det eller de interessegener, 3 μg RD114 og 1,2 μg VSV-G (kuvertplasmider) og 3 μg gag/pol.
BEMÆRK: Konvolutten og gag/pol-generne er nødvendige for retroviral emballage. Til vores retrovirale produktion tilføjer vi både RD114-konvolutten og, for at øge stabiliteten, en lille mængde VSV-G kuvert. - Fortyndet plasmider (trin 1.4) tilsættes fortyndet transfektionsreagens (trin 1.3). Bland forsigtigt. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Foderceller 5 ml friske, komplette medier, og der tilsættes 3 ml transfektionsreagens/plasmidblanding dråbevis pr. kolbe og inkuberer i 5-6 timer ved 37 °C.
- Der tilsættes yderligere 5 ml frisk medium til kolberne og inkuberes i 42-43 timer ved 37 °C.
- Efter en total transfektionstid på 48 timer indsamles medier og centrifugeres ved 1282 x g i 3 minutter ved 4 °C for at fjerne celleaffald.
- Aliquot i passende mængder til fremtidig brug, flash fryse virus i en ethanol / tøris bad og opbevares på -80 °C.
2. Titering af Gammaretrovirus
BEMÆRK: Der kan være behov for flere fortyndinger af virus for at opnå en gyldig titer.
- Plade 293T celler ved 600.000 celler / godt i en 6-brønd plade og inkubere pladerne i 24 timer ved 37 °C.
- Fjern mediet fra cellerne og tilsæt den ønskede mængde DMEM + 10% FBS til 293T (2 ml samlet virus).
- Tilsæt virus til den tilsvarende godt og hvirvle forsigtigt at blande. For eksempel tilsættes 200 μL, 100 μL, 50 μL og 25 μL henholdsvis til 4 brønde. Medtag en brønd uden virus til flow cytometri (mock prøve).
- Inkuber i 48 timer ved 37 °C.
- Trypsinize 293T celler ved at tilføje 0,5 ml Trypsin-EDTA og inkubere i 4 min ved 37 °C. Stop trypsin ved at tilføje 1,5 ml DMEM + 10% FBS. Tæl cellerne og bestemme levedygtighed med en automatiseret celle tæller eller et hæmocytometer.
- Hvis du vil bruge celletælleren, skal du tilsætte 10 μL celler til 10 μL trypanblå, blande, indlæse kammerdiaset og indsætte i tælleren. Tryk på "capture"-knappen for at tælle cellerne.
- Indsamle 0,5-1 x 106 celler og evaluere niveauer af CAR og CXCR5 ved flow cytometri (se trin 9.5). Udtryk af CD4 eller MBL sammen med CXCR5 vil identificere transinducerede 293T celler co-udtrykke CAR og CXCR5. Se reaktive antistoffer i trin 9.5.1.
- Beregn viral titer.
BEMÆRK: Vælg prøven med et transduktionsniveau på 20 % eller mindre til beregning af titer.- Brug følgende formel til at beregne titer:
transduktionsenheder/ml = (antal celler i kultur)(% af de transinducerede celler)/virusvolumen, der tilsættes til kulturen
- Brug følgende formel til at beregne titer:
3. Bestemmelse af den optimale MOI for en nyproduceret viral forberedelse og celler af interesse
- Følg transduktionsprotokollen (afsnit 4-9) med primære PBMC'er og dobbelte fortyndinger af gammaretroviralt præparat.
- Vurder niveauet for udtryk af de gener af interesse ved flow cytometri (trin 9.5).
- Vælg en koncentration af virus, der tillader maksimal transduktion uden tab af celle levedygtighed.
4. Forberedelse plader til T-celle aktivering af Belægning Brønde med Anti-CD3 antistoffer
- Der fremstilles antimakak-CD3-antistof (FN18) ved at fortynde bestanden til 10 μg/ml i fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Dispenser 2 ml/brønd i 6-brønds plader. Inkuber ved 37 °C i 2 timer. Alternativt kan pladerne inkuberes natten over ved 4 °C.
- Aspirate PBS og ubundne antistoffer. Prøverne skylles to gange med 2 ml PBS, og der anvendes straks til at pladevaskere.
5. Stimulerende Rhesus PBMC'er med pladebundet anti-CD3 og opløselig anti-CD28
- Optø primære rhesus PBMC'er i et 37 °C vandbad med let omrøring, indtil der kun er en lille mængde is tilbage.
- I hætten, forsigtigt pipette celler i et konisk rør. Skyl hætteglasset med 1 ml basismedium og tilsæt det langsomt til cellerne. Dernæst langsomt tilføje en ekstra 9 ml varm grundlæggende medium til cellerne.
BEMÆRK: Dette trin kan skaleres op, men aldrig tø mere end 4 hætteglas på én gang. - Der centrifugeres ved 600 x g i 5 min ved 22 °C for at pelletere cellerne. Aspirer supernatanten og derefter resuspender pellet i en lille mængde vækstmedium. Vælg et volumen, således at koncentrationen af celler vil overstige 2 x 106 celler /ml på dette tidspunkt, da den endelige koncentration bør være 2 x 106 celler / ml.
- Pletterceller med trypan blå og tælle cellerne til at bestemme antallet af levedygtige celler.
BEMÆRK: Dette kan gøres med en standard hæmocytometer eller en automatiseret celle tæller. Vi bruger en automatiseret celletæller, der viser levedygtigheden og antallet af levende celler.- For at bruge tælleren tilsættes 10 μL celler til 10 μL trypanblå, bland, læg kammerdiaset og indsæt i tælleren. Tryk på "capture"-knappen for at tælle cellerne.
- Beregn det samlede antal celler ved at gange cellekoncentrationen med volumen og derefter fortynde cellerne til 2 x 106 celler/ml i vækstmedium. Før plettering tilsættes anti-CD28 til en endelig koncentration på 5 μg/ml for at give et nødvendigt cotimulatorisk signal til T-celleaktivering.
- Pipetteceller i anti-CD3 belagte plader. Der tilsættes 3-6 x 106 celler pr. brønd (et godt mål er 4 x 106 celler i 2 ml medier pr. brønd) og inkuberes i 2 dage ved 37 °C i 5% CO2.
6. Forberedelse fibronectin-belagte plader
BEMÆRK: PBMC og T-celler udtrykker integrinske receptorer VLA-4 eller VLA-5 og er gode mål for fibronectin-medieret transduktion.
- Før pladerne belægning, først forberede fibronectin reagens ved fortynding det 1:100 i sterile PBS.
- Pipette 2 ml af den sterile fibronectin opløsning i hver brønd af en 6-brønd plade. Forsigtigt rock plader i 2 timer ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Ikke-behandlede, cellekultur-grade væv kultur plader eller retter bør anvendes i dette trin. - Fibronectinopløsningen fjernes ved aspiration, og bloker derefter med 1 ml sterilt 2% bovinserumalbumin (BSA, Fraktion V) i PBS. Rock pladerne ved stuetemperatur i 30 min.
- Sug BSA-opløsningen og vask pladen med 2 ml PBS. Efter aspiration af PBS kan de fibronectinbelagte plader forsegles med forseglingsindpakning og opbevares ved 4 °C i op til en uge.
BEMÆRK: Vi forbereder normalt pladerne en dag før transduktion.
7. Transduktion af aktiverede PbMC'er
FORSIGTIG: Arbejde med virale vektorer eller med rhesus makak PBMC'er kræver brug af passende sikkerhedsforanstaltninger såsom brug af laboratoriekitler og dobbelt lag handsker. Al håndtering af virus og celler skal foregå i biosikkerhedshætten. Alle pipetter skal dekontamineres i en opløsning på 10% blegemiddel i 30 min. Alt flydende infektiøs affald bør dekontamineres med en endelig koncentration på 10% blegemiddel. Sekundær indeslutning med en forsegling, der forhindrer frigivelse af mikrobiologiske aerosoler, er nødvendig for centrifugering.
- Fastgør gammaretroviral transducing vektor til fibronectin-belagt godt.
- En centrifuge opvarmes til 32 °C ved at køre ved 2000 x g i ca. 30 min.
- Varm både serumfri og vækstmediet i et 37 °C vandbad.
- Tø virussen op på is eller ved forsigtigt at hvirvle hætteglasset op i et 37 °C vandbad, indtil der kun er en lille mængde is tilbage. For at undgå nedbrydning af det virale præparat må indholdet ikke varme op.
- Retrovirus fortyndes til en forudbestemt optimal mangfoldighed af infektion (MOI) i serumfrit medium.
BEMÆRK: Med vores gammaretrovirus og rhesus PBMC har vi konstateret, at en MOI på 0,5 er optimal.- Eksempel fortynding: Til pels 4 brønde med virus og tilsæt 1,5 x 106 celler, (4) (1,5 x 106)(0,5) = 3 x 106 TU er nødvendige. Hvis den virale titer er 1,1 TU/ml, skal du bruge 2,7 ml virus i 5,3 ml medier til et samlet volumen på 8 ml.
- Der tilsættes 2 ml fortyndet retrovirus til hver brønd af den fibronectinbelagte plade.
- For negativ kontrol mock-transduceret celler, tilføje medier alene til fibronectin-belagte brønde.
- Pladerne anbringes i den forvarmede centrifuge på 32 °C i mikropladeholdere med biosikre dæksler og centrifuger ved 2000 x g i 2 timer.
BEMÆRK: Virusbelagte plader kan anvendes med det samme eller opbevares med virus ved 4 °C natten over. - Til øjeblikkelig brug, aspirere virus præparatet fra brøndene og tilsæt 2 ml vækstmedium. Hold de virusbelagte brønde fra tørring.
- Plade de stimulerede PBMC'er.
- Kontroller cellerne ved hjælp af et omvendt mikroskop. Cellerne skal se sunde ud, hvilket betyder, at de er runde, lyse og fraktillysede lys. De bør også vise en klumpet udseende angiver stimulation.
- Saml målcellerne og overføre dem til en 50 ml konisk rør. Skyl brønden én gang med 1 ml vækstmedier og tilsæt til det koniske rør. Tæl antallet af levende celler med den automatiserede celletæller som i trin 5.4.
BEMÆRK: Stimulerede celler vil blive klumpet sammen, og denne sammenklumpning kan føre til vanskeligheder med præcist at tælle cellerne. - Cellerne pelleterer cellerne i rørene ved centrifugering ved 600 x g i 5 min ved 32 °C. Aspirat medierne fra cellepellet og resuspendercellerne i vækstmedium ved en koncentration på 1,5 x 106 celler/ml.
- Til hver virusbelagt brønd (tilberedt i trin 7.1) tilsættes 1 ml cellesuspension til i alt 1,5 x 106 celler/3 ml. Bemærk, at hver brønd allerede indeholder 2 ml vækstmedium. Udfør de samme trin for mock-transduced celler, men plade dem på fibronectin-belagte brønde, som ikke modtog virus.
- Pladerne centrifugeres ved 1000 x g i 10 min ved 32 °C.
- Pladerne inkuberes i 48 timer ved 37 °C under 5 % CO2.
8. Udvidelse af de transinducerede celler
- Træk indholdet af brøndene op og ned med en 5 ml pipet for at resuspendere cellerne og derefter overføre til et 50 ml konisk rør.
- Tilføj 1 ml vækstmedier til hver brønd og træk op og ned med et sterilt overførselspipet for at fjerne tilsidderceller.
- Tæl celler for at bestemme det samlede celletal og levedygtighed ved hjælp af en automatiseret celletæller som i trin 5.4.
- Hvis det ønskes, fjernes 1 x 106 celler for flowcytometri for at vurdere genekspression og fænotype. Se trin 9.5.1 og materialetabellen for anbefalede antistoffer og gatingstrategi.
- Cellerne centrifugeres ved 600 x g i 10 min ved 25 °C.
- Aspirerer mediet og resuspendercellerne i ekspansionsmedier til en koncentration på 1 x 106 celler/ml. Frø hver gas-gennemtrængelig brønd af en 6-brønd plade med 5 ml celler. Lag forsigtigt yderligere 25 ml udvidelsesmedier pr. brønd.
BEMÆRK: Vi tilføjer cellerne i en lille mængde og derefter lag resterende medier, så cellerne forbliver på bunden af brønden. - Cellerne inkuberes uforstyrret ved 37 °C2 i 5% CO 2-inkubator i 4 dage.
9. Indsamling af udvidede celler og evaluering af fænotypen af den transinducerede cellepopulation
- Opsaml celler fra gasgennemtrængelige brønde ved at fjerne og kassere 20 ml medier. Der skal udvises forsigtighed for at undgå at forstyrre cellerne.
BEMÆRK: Vi udvider cellerne i kun 4 dage og samler cellerne på dette tidspunkt. Men hvis der ønskes yderligere kulturdage, skal du fjerne 20 ml medier uden at forstyrre cellerne og erstatte dem med 20 ml friske ekspansionsmedier. - Pipet de resterende medier op og ned for at løsne cellerne. Medierne skal være meget uklare, hvis cellerne er vokset godt.
- Ved hjælp af en steril overførsel pipet, skyl hver brønd med 3 ml medier til at indsamle eventuelle resterende celler.
- Tæl cellerne med den automatiske tæller eller et hæmocytometer for at kontrollere for levedygtighed og cellenummer.
- Udfør flowcytometri for at bestemme transduceret genekspression og cellefænotype.
- I dette eksempel bestemmes rhesus macaque PBMC fænotype ved hjælp af antistoffer rettet mod CD4 (M-T477), en klon, der er reaktiv med både endogen rhCD4 og rhCD4-MBL CAR; mod CD3 (SP34-2) og CD8 (RPA-T8), som pletter henholdsvis T-celler og CD8 T-celler mod dødsreceptoren CD95 (DX2) og det costimulerende molekyle CD28 (CD28.2), som anvendes til at bestemme cellernes hukommelsesfænotype og mod CXCR5 (MU5UBEE) og MBL (3E7) for at detektere CXCR5 og CD4-MBL CAR på de transinducerede celler.
- Vurdere levedygtigheden blev vurderet med et fixable levedygtighedsfarvestof.
- Forbered celler til flow cytometri.
- Der fyldes op om et antistofmastermix for det samlede antal rør. Bring op til den samlede volumen ved hjælp af PBS.
- Tilsæt cellerne til flow rør. Anbring 0,5-1 x 106 celler pr. rør. Medtag negative kontroller såsom ufarvede celler samt farvede mock transinducerede celler.
- Der tilsættes 2 ml PBS til cellerne, der centrifugeres ved 400 x g i 5 min ved stuetemperatur (RT) og dekantering.
- Der tilsættes 100 μL antistofblanding til rørene og inkuberes i 30 min ved RT.
- Der tilsættes 2 ml PBS, der centrifugeres ved 400 x g i 5 min ved RT og dekanterles.
- Der tilsættes 300 μL 1% paraformaldehyd og inkuberes i 15 min.
- Centrifugeres ved 400 x g i 5 min ved RT og dekantering. Der tilsættes 300 μL PBS og blandes.
- På et flow cytometer, erhverve 150.000 arrangementer for hver prøve.
- Analysér dataene med flowanalysesoftware.
BEMÆRK: Gating-strategien blev tidligere offentliggjort20.- Til identifikation af transinducerede celler, gateceller på lymfocytter, singlets, live, CD3+, og MBL+CXCR5+.
- Til identifikation af den centrale hukommelsepopulation, gateceller på lymfocytter, singlets, live CD3+, CD8+, CD28+ CD95+.
- Brug celler efter behov. Celler kan anvendes til in vitro-funktionsanalyser, såsom en transwell-migreringsanalyse9 eller in vitro-celledræbende analyser5,9. in vitro Celler kan anvendes til infusion til dyr. Alternativt kan du fryse eventuelle resterende celler i 90% FBS med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) til senere brug eller analyse
BEMÆRK: Mens en måldosis for infusion af adoptivvant overførte celler til en rhesus macaque endnu ikke er fastlagt, har offentliggjorte adoptivoverførselsundersøgelser hos ikke-menneskelige primater brugt 0,6 til 1,2 x 107 celler/kg21, 1 til 5 x 108 celler/kg22 og 1,4 til 8 x 108 8 celler/kg10. Med dette interval som en retningslinje kan der produceres nok celler til infusion med denne 9-dages protokol.
Representative Results
Celleproduktion
Resultaterne i denne publikation svarer til resultaterne i vores tidligere offentliggjorte værk9,20. Ved hjælp af protokollen præsenteres her, forventer vi mindst en 8-fold udvidelse af celler mellem dag 5 og 9 (median 11,1 fold, rækkevidde 8,7-13 fold). Gas gennemtrængelige brønde blev seedet ved en starttæthed på 5 x 106 celler, og efter 4 dages vækst opnåede vi en mediantæthed på 55,6 x 106 celler pr. brønd (interval 43,5-64,8 x 106) (Figur 1A). Celletælling med Trypan Blue-eksklusion viser, at cellerne opretholder høj levedygtighed i hele protokollen (dag 9 median 85,8%, interval 83-95%) (Figur 1B). Vi finder dyr til dyr variabilitet i cellernes evne til at udvide; Men med en startpopulation på 50-100 x 106 celler på dag 1 har vi brugt denne protokol til at producere nok celler til rhesus macaque infusion på 1-2 x 108 celler/kg.
Co-ekspression af de transinducerede gener blev overvåget med flowcytometri (figur 2A). Udtrykket af CAR og CXCR5 på overfladen af de transinducerede celler var relativt stabil mellem dag 5 og 9 i denne ekspansionprotokol. På dag 5 var en median på 42,8 % (interval 36,5-46,9 %) af cellerne blev transduceret med både CD4-MBL CAR og CXCR5, mens medianudtrykket på dag 9 var 47,6% (interval 44,5-64,5%) med en enkelt transduktionsrunde (figur 2B). Selv om nogle protokoller kræver en anden runde af transduktion, har vi ikke set en fordel i form af samlede transduceret celler ved afslutningen af protokollen (data ikke vist).
Cellefænotype
Transinducerede celler blev analyseret af flow cytometri at overvåge deres hukommelse fænotype. Før transduktion og ekspansion identificeres naive, centrale hukommelses- og effektorhukommelsespopulationer (data ikke vist), men den naive population går tabt med dyrkning, og cellerne er primært centrale hukommelsesceller pr. dag 5 (figur 3A) og dag 9 (Figur 3B) som identificeret ved CD95+ CD28+ udtryk. Anvendelsen af denne hurtige transduktions- og ekspansionsprotokol har produceret celler, som primært er centrale hukommelsesceller og dermed vil være mere tilbøjelige til at formere sig og vare ved, når de infunderes til et forsøgsdyr.
Figur 1: Transduktions- og ekspansionsprotokollen producerer rigelige transinducerede celler, som er meget levedygtige. AA) Udvidelse af de transinducerede celler fra 6 forskellige dyr fra dag 5 til 9 i gasgennemtrængelige beholdere og(B)levedygtigheden af den transinducerede PBMC fra de samme 6 dyr. Trypan blå udelukkelse ved hjælp af en automatiseret celle tæller blev brugt til at overvåge cellenummer og levedygtighed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Transduktionsprotokollen producerer celler, der bevarer medpressionen af de to transinducerede gener. (A) Et repræsentativt flowplot af rhesus PBMC på dag 9 i transduktions- og ekspansionsprotokollen, der viser både CD4-MBL CAR og CXCR5. (B) Angivelse af CD4-MBL CAR og CXCR5 på transduceret rhesus PBMC fra 6 forskellige dyr på dag 5 og 9 i kultur målt ved flowcytometri. Gates blev sat på live, CD3+ celler. Transinducerede celler identificeres som MBL+ CXCR5+. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: De fleste af de celler, der produceres i 9-dages protokollen, har en central hukommelsesfænotype. Repræsentative flow cytometri parceller af (A) dag 5 og (B) dag 9 CAR / CXCR5-transduceret rhesus PBMC. Gates blev sat på live, CD3+, CD8+ celler. Central hukommelse blev defineret som CD28+ CD95+. Effektorhukommelse blev defineret som CD28-, CD95+. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol skitserer en T-celle immunterapi produktionsstrategi, som udnytter en gammaretroviral vektor til at transduce rhesus makak PBMC fører til T-celle befolkning, der udtrykker en antiviral CAR samt follikulære homing receptor, CXCR5. Med i alt 8 dages ex vivo kulturtid produceres levedygtige, funktionelle CAR T-celler i en mængde, der ligger inden for det offentliggjorte område10,,21,22, der anvendes til infusion til ikke-menneskelige primater til præklinisk e-test.,
Transduktionsprotokollens succes afhænger både af sunde, stimulerede PBMC'er og af kvalitetspræparater af gammaretrovirus. For at opnå en vellykket stimulering og transduktion er det vigtigt, at der udvises passende forsigtighed ved nedfrysning og transport af PBMC'erne efter indsamlingen. Ideelt set, hvis cellerne er indsamlet off site, de sendes i flydende nitrogen og hurtigt placeret i langsigtet flydende kvælstof opbevaring. PBMC'er skal være mitotically aktive for at kunne transinduceres med en gammaretrovirus. Man bør overvåge visuelt for klyngedannelse af cellerne efter stimulation med anti-CD3/anti-CD28. Hvis en manglende aktivering aktiveres korrekt, vil det medføre lav effektivitet i transduktionen. Det er også vigtigt at overvåge levedygtigheden i de stimulerede celler. Dårlig levedygtighed efter stimulering trin fører normalt til en mindre vellykket transduktion. Uanset om viruspræparater produceres i laboratoriet eller outsources, bør de opbevares ved -80 °C i enkeltbrugsaliquots for at undgå fryseoptøningscyklusser, der kan beskadige virusset og forringe transduktionseffektiviteten. Virussen skal titered således, at ensartede mængder af virus kan anvendes i hvert eksperiment. Når du bruger virus til transduktion, tø virus hurtigt og opbevares på is, indtil det er nødvendigt. Valget af promotor- og kuvertproteiner kan alle påvirke transduktionseffektiviteten og ekspressionen af transgene i målcellerne. Således skal en MOI være empirisk bestemt. Desuden har brugen af et medie designet til at understøtte T-celler og plader med gasgennemtrængelige brønde til ekspansion ført til en fremragende udvidelse af de transinducerede celler. Der er dog dyr til dyr variabilitet i cellen ekspansion sats. Vi anbefaler en forsøgsundersøgelse for at bestemme evnen af en bestemt celle præparat, der skal transduceret og udvidet. Ekspansionsniveauerne er ensartede i både små og store transduktioner.
Med brugen af denne protokol har vi produceret op til 2,5 x 109 celler til infusion i forsøgsdyr. Selv om vi har fundet det unødvendigt at opskalere protokollen på nuværende tidspunkt, er brugen af 6 brøndplader en begrænsning af storstilet celleforberedelse, og protokollen vil kræve ændringer for at producere et større antal celler. Eksempler på potentielle ændringer omfatter udførelse af transduktion en fibronectin-belagt kulturpose for at øge antallet af transinducerede celler og for at udnytte et større gasgennemtrængeligt dyrkningsfartøj til ekspansionstrinnet. Selv om vi endnu ikke har foretaget disse ændringer, de udnytter kommercielt tilgængelige produkter og er gennemførlige ændringer til den nuværende protokol.
Ved hjælp af denne metode har vi produceret transinducerede celler fra PBMC isoleret fra ikke-inficerede dyr, SIV-inficerede dyr og fra SIV-inficerede dyr behandlet med antiretroviral behandling (ART). Men vi har bemærket en reduktion i transduktionseffektiviteten i ART-behandlede celler20. Denne reduktion skyldes formentlig hæmning af omvendt transkriptase og/eller integrase af stofferne. Transduktioner af celler fra ART-behandlede dyr vil kræve ændringer af denne protokol, såsom at reducere de intracellulære niveauer af ART narkotika ved at stoppe ART i flere dage før indsamling af PBMC eller ved brug af en alternativ vektor, som ikke er påvirket af ART narkotika almindeligt i brug.
Det er vigtigt, at celler, der produceres til immunterapi, er af en minimalt differentieret fænotype, så de vil fortsætte efter infusion12. Selv om mange protokoller for adoptivoverførsel af celler kræver lange dyrkningstider, er en reduceret ex vivo kulturtid blevet korreleret med både en reduktion i differentiering og en forbedring af CAR T-cellefunktionen13. Den relativt hurtige tidsramme for denne transduktions- og ekspansionsprotokol gør det muligt at opretholde den ønskede centralhukommelsefænotype, mens der stadig produceres tilstrækkeligt mange celler til test af deres immunterapeutiske potentiale20.
Målet med produktionsstrategien for denne T-celle immunterapi produkt er at fremstille T-celler, der vil genkende SIV-inficerede celler, vil trafikken til det sted, viral replikation i B-celle follikel og vil fortsætte i dyret resulterer i en langsigtet funktionel kur uden behov for antiretrovirale lægemidler. For oversættelse til et humant immunterapiprodukt kan denne protokol ændres til at transducere humane T-celler ved hjælp af humant specifikke antistoffer og cytokiner og gennemførelse af GMP-standarder med det endelige mål at producere en funktionel kur mod Hiv.
Disclosures
Dr. Pamela Skinner er medstifter og videnskabelig chef for MarPam Pharma.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NIH-tilskud 5R01AI0969666-06S1 (PS, EF og EB), 1UM1AI26617 (PS, EF og EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH-tilskud 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A1 43380-01 (PS og EB), 1UM14126617 (PS og EF) samt midler fra NIAID Division of Intramural Research og NIH Intramural AIDS Targeted Antiviral Program. Anti-CD3 og anti-CD28, der anvendes i disse undersøgelser blev leveret af NIH Nonhuman Primate Reagens Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2, der blev anvendt i disse undersøgelser, blev leveret af NCI's prækliniske depot. Vi takker vores samarbejdspartnere i denne CD4-MBL CAR / CXCR5 projekt, Dr. Elizabeth Connick ved University of Arizona, Dr. Edward A Berger på NIAID, NIH, Dr. Eva G Rakasz på Wisconsin National Primate Research Center og Dr. Geoff Hart og Ms Preethi Haran ved University of Minnesota, Dr. Leslie Kean på Harvard Medical School og Dr. Catherine Bollard på Children's Research Institute. Vi takker også Dr. Scott McIvor ved University of Minnesota, Dr. Christopher Peterson på Fred Hutchinson Cancer Center, Dr. Matthew Trivett på NIH, Dr. Agne Taraseviciute på Seattle Children's Hospital, og Dr. Conrad Russell Cruz på The Children's Research Institute for deres meget hjælpsomme bistand til at optimere denne protokol. Vi har også taknemmeligt anerkender Ms Chi Phan og Ms Jhomary Alegria-Berrocal ved University of Minnesota for gammaretroviral produktion, og Ms Kim Weisgrau ved University of Wisconsin-Madison for isolering af rhesus makak PBMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
References
- Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Sadelain, M., Rivière, I., Riddell, S. Therapeutic T cell engineering. Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).
- Kuhlmann, A., Peterson, C. W. Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure. Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).
- Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity. Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).
- Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).
- Connick, E., Mattila, T., et al. CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue. The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).
- Connick, E., Folkvord, J. M., et al. Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL. The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).
- Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication. Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).
- Ayala, V. I., Deleage, C., et al. CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering. Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).
- Redeker, A., Arens, R. Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination. Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).
- Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting Through Subsets. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
- Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection. The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).
- Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).
- Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies. Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).
- Chambers, C. A., Allison, J. P. Costimulatory regulation of T cell function. Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).
- Schwartz, R. H. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).
- Bajgain, P., Mucharla, R., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015 (2014).
- Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).
- Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
- Berger, C., Sommermeyer, D., et al. Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells. Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).
