Summary
Vi skisserer en 9-dagers protokoll for transduksjon og utvidelse av rhesus macaque perifere blod mononukleære celler som gir celler med utmerket co-uttrykk av genene av interesse i tilstrekkelig antall for infusjonsstudier av celleeffekt.
Abstract
Nye immunterapier for å behandle smittsomme sykdommer og kreft innebærer ofte transduksjon av cellulære populasjoner med gener som koder sykdomsrettetproteiner. For eksempel, chimeric antigen reseptor (CAR)-T celler for å behandle kreft og virusinfeksjoner innebære transduksjon av T-celler med syntetiske gener koding CAR molekyler. CAR molekylene gjør T-cellene spesielt gjenkjenne og drepe kreft eller viralt infiserte celler. Celler kan også overføres sammen med andre interessegener. For eksempel kan celler overføres sammen med gener som koder proteiner som retter seg mot celler til bestemte steder. Her presenterer vi en protokoll for å overføre primære perifere blod mononukleære celler (PBMCs) med gener som koder en virusspesifikk BIL og B-cellefollikkelhomingmolekylet chemokinreseptor type 5 (CXCR5). Denne prosedyren tar ni dager og resulterer i transducerte T cellepopulasjoner som opprettholder en sentral minne fenotype. Vedlikehold av et sentralt minne eller mindre differensiert fenotype har vist seg å assosiere med utholdenhet av celler etter infusjon. Videre viser celler produsert med denne metoden høye nivåer av levedyktighet, høye nivåer av kopresjon av de to transduserte genene, og store nok mengder celler for immunoterapeutisk infusjon. Denne ni-dagers protokollen kan brukes bredt til CAR-T-celle og andre T-celle immunterapi tilnærminger. Metodene som er beskrevet her er basert på studier presentert i våre tidligere publikasjoner.
Introduction
Cellulære immunterapier fremstår som et nytt middel for å behandle sykdommer, inkludert kreft og smittsomme sykdommer. Disse immunterapimetodene involverer ofte genetisk manipulering av terapeutiske celler for å uttrykke spesifikke molekyler. For eksempel er chimeric antigen reseptor (CAR) T-celler konstruert for å uttrykke et CAR molekyl som har et ekstracellulært domene som spesifikt binder molekyler på syke celler og et signaldomene som utløser immuncellene for å drepe den syke cellen. CAR T-celler brukes med hell i kreft immunterapi, og har vært spesielt effektiv i behandling av B celle leukemier1,2,3. CAR-T-celler utvikles også for å behandle virusinfeksjoner som HIV. HIV-spesifikke CARs retter seg mot konvoluttproteinene på overflaten av vially infiserte celler4. Immunoterapeutiske celler kan også konstrueres for å uttrykke homing molekyler for å målrette terapeutiske celler til bestemte vev steder. Vi har utviklet vektorer som transduce både en virus-spesifikk BIL samt lymfoid follicle homing molekyl CXCR55.
Viral replikering av noen virus, inkludert humant immunsviktvirus (HIV) og simian immunsviktvirus (SIV), er konsentrert i B-cellefollikler i sekundært lymfoidvev6. B cellefollikler er noe immunprivilegerte steder der lave nivåer av virusspesifikke CTL tillater pågående viral replikering7,8. Av disse grunnene er målretting av HIV/SIV-spesifikke T-celler i follikkelen gjennom uttrykk for CXCR5 en strategi for eliminering av follikulært reservoar av vially infiserte celler9,10. Spesielt retter vi oss mot SIV-spesifikke CAR T-celler til B-cellefollikler via CXCR5-kopresjon.
I denne protokollen beskriver vi en metode for å transduce CAR /CXCR5 og utvide PBMCs for å produsere CAR / CXCR5 T celler av tilstrekkelige mengder for terapeutisk infusjon. Celler som er transduced med disse metodene opprettholde en sentral minne fenotype. Studier har vist at celler med en mindre differensiert fenotype, for eksempel sentralminne T-celler og T minne stamceller bedre vedvarer enn mer differensierte celler11,12. I tillegg har mange protokoller designet for å produsere adoptivoverførte celler relativt lange kulturtider som resulterer i celler som har en mer differensiert fenotype og redusert utholdenhet13. Videre, adoptivoverførte celler med lange kulturtider akkumulert i lungene i stedet for mål lymfoid vev i rhesus macaque14,15. I metodene vi beskriver og demonstrerer her, vi raskt transduce og utvide rhesus macaque PBMCs å produsere transduced T celler som opprettholder en sentral minne fenotype.
Både CD4- og CD8 T-celler er inkludert i vår immunterapitilnærming. Denne blandede cellepopulasjonen ble valgt fordi fraværet av CD4+ T-celler i CD8+ T-celleproduktet var korrelert med en svikt i infunderte CD8 T-celler for å vedvare 16. Metodene som er beskrevet her begynner med å aktivere PBMCer med anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer som kraftig stimulerer T-cellereseptoren og gir et kotimulatorisk signal for å unngå klonal anergy17,18.
Etter aktivering blir celler transduced med en gammaretroviral vektor koding en virusspesifikk BIL og lymfoid homing molekylCXCR5. Transduserte celler utvides deretter ved hjelp av plater designet for ikke-tilhengercelleforplantning som har en gassgjennomtrengelig membran ved basen. Denne membranen tillater gassutveksling på bunnen av brønnen som fører til forbedret celleoverlevelse og næringstilgjengelighet19. Ved hjelp av disse metodene kan tilstrekkelige funksjonelle celler produseres i en 9-dagers tidsramme for in vivo infusjonsstudier. Mens denne protokollen er designet for å transducing og utvide rhesus macaque T-celler, med liten endring av de artsspesifikke aktiveringsantistoffene, kan den brukes med celler fra andre arter. Disse metodene er basert på våre tidligere publiserte studier9,20.
Protocol
MERK: Denne rhesus PBMC transduksjonprotokollen krever bruk av en gammaretroviral vektor. Vær oppmerksom på at gammaretrovirus enten kan produseres i laboratoriet eller outsources til et viralt produksjonsselskap. I laboratorieproduksjon kan utføres med protokollen skissert i trinn 1, og viruset kan titeres som beskrevet i trinn 2. Enten viruset er produsert på stedet eller av et produksjonsselskap, bør en MOI (forholdet mellom smittsomme virions til celler i kultur) bestemmes, som skissert i trinn 3, for hver nylig produserte viral forberedelse og cellene av interesse.
FORSIKTIG: Arbeid med gammaretrovirale vektorer eller andre retrovirale vektorer krever riktige sikkerhetsforanstaltninger som bruk av laboratoriefrakker og doble lag med hansker. All håndtering av viruset må forekomme i biosikkerhetshetten. Alle rør skal dekontamineres i en løsning på 10% blekemiddel i 30 min. Alt flytende smittsomt avfall bør dekontamineres med en endelig konsentrasjon på 10% blekemiddel. Sekundær inneslutning, med et tetning som forhindrer frigjøring av mikrobiologiske aerosoler, er nødvendig for sentrifugering
1. Produsere Gammaretroviral Stock
- Plate 293T-celler for transfection. En full virus forberedelse krever 12 T75 kolber på 4,5 x 106 celler / kolbe i Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) + 10% føtal storfe serum (FBS) uten antibiotika.
- La cellene vokse over natten ved 37 °C før transfection.
- Fortynn 60 μL transfection reagens i 1,5 ml redusert serummedia. Forbered ett rør for hver kolbe. Inkuber i 5 minutter ved RT.
- For hver kolbe, forberede et rør som inneholder 1,5 ml redusert serummedia og følgende plasmids: 9,0 μg av en overføringsplasmid som inneholder genet(e) av interesse, 3 μg RD114 og 1,2 μg VSV-G (konvoluttplasmider) og 3 μg gag / pol.
MERK: Konvolutten og gag/pol-genene er nødvendig for retroviral emballasje. For vår retrovirale produksjon legger vi til både RD114-konvolutten og, for ekstra stabilitet, en liten mengde VSV-G-konvolutt. - Tilsett fortynnet plasmider (trinn 1.4) til fortynnet transfection reagens (trinn 1.3). Bland forsiktig. Inkuber i 20 min ved romtemperatur.
- Mateceller 5 ml friske komplette medier og tilsett 3 ml transfection reagens/plasmid blanding dropwise per kolbe og inkuber for 5–6 timer ved 37 °C.
- Tilsett ytterligere 5 ml friskt medium til kolbene og inkuber for 42–43 timer ved 37 °C.
- Etter en total transfection tid på 48 timer, samle media og sentrifuge på 1282 x g i 3 min ved 4 °C for å fjerne cellerester.
- Aliquot i passende volumer for fremtidig bruk, flash fryse viruset i en etanol / tørt isbad og lagre på -80 °C.
2. Titering gammaretrovirus
MERK: Flere fortynninger av virus kan være nødvendig for å få en gyldig titer.
- Plate 293T celler på 600.000 celler / godt i en 6-brønnplate og inkuberplatene i 24 timer ved 37 ° C.
- Fjern mediet fra cellene og legg til ønsket mengde DMEM + 10% FBS til 293T (2 ml totalt virusvolum).
- Tilsett viruset til tilsvarende godt og virvle forsiktig for å blande. Tilsett for eksempel henholdsvis 200 μL, 100 μL, 50 μL og 25 μL til 4 brønner. Inkluder en brønn uten virus for flyt cytometri (mock prøve).
- Inkuber i 48 timer ved 37 °C.
- Trypsinize 293T cellene ved å legge 0,5 ml Trypsin-EDTA og inkubere i 4 min ved 37 °C. Stopp trypsin ved å legge til 1,5 ml DMEM + 10% FBS. Tell cellene og bestem levedyktighet med en automatisert celleteller eller et hemocytometer.
- For å bruke celletelleren, legg til 10 μL celler til 10 μL trypan blå, bland, last kammerlysbildet og sett inn i telleren. Trykk på "capture" -knappen for å telle cellene.
- Samle inn 0,5–1 x 106 celler og vurder nivåer av CAR og CXCR5 etter flytcytometri (se trinn 9.5). Uttrykk for CD4 eller MBL sammen med CXCR5 vil identifisere 293T-celler som er med å uttrykke CAR og CXCR5. Se reaktive antistoffer i trinn 9.5.1.
- Beregn viral titer.
MERK: Velg prøven med et transduksjonsnivå på 20 % eller mindre for beregning av titer.- Bruk følgende formel til å beregne titer:
transduksjonsenheter/ml = (antall celler i kulturen)(% av cellene som er transducert)/volum av virus som er lagt til kulturen
- Bruk følgende formel til å beregne titer:
3. Bestemme optimal MOI for en nylig produsert viral forberedelse og cellene av interesse
- Følg transduksjonsprotokollen (avsnitt 4–9) med primære PBMCer og todoble fortynninger av gammaretroviral preparat.
- Vurder uttrykksnivået for interessegenene ved å flyte cytometri (trinn 9.5).
- Velg en konsentrasjon av virus som tillater maksimal transduksjon uten tap av cellelevedyktighet.
4. Klargjøre plater for T-celleaktivering ved å belegge brønner med anti-CD3 antistoffer
- Forbered anti-macaque CD3 antistoff (FN18) ved å fortynne lageret til 10 μg/ml i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Dispenser 2 ml/brønn i 6-brønnplater. Inkuber ved 37 °C i 2 timer Alternativt kan platene inkuberes over natten ved 4 °C.
- Aspirer PBS og ubundne antistoffer. Skyll brønner to ganger med 2 ml PBS og bruk umiddelbart til plate PBMCs.
5. Stimulere nde Rhesus PBMCer med platebundet Anti-CD3 og oppløselig Anti-CD28
- Tin primære rhesus PBMCs i en 37 °C vannbad, med mild agitasjon, til bare en liten mengde is gjenstår.
- I hetten, forsiktig pipette celler i et konisk rør. Skyll hetteglasset med 1 ml grunnleggende medium og legg det sakte til cellene. Deretter legger du sakte til ytterligere 9 ml varmt grunnleggende medium til cellene.
MERK: Dette trinnet kan skaleres opp, men tiner aldri mer enn 4 hetteglass samtidig. - Sentrifuge ved 600 x g i 5 min ved 22 °C for å pellet cellene. Aspirer supernatanten og deretter resuspendere pellet i en liten mengde vekstmedium. Velg et volum slik at konsentrasjonen av celler vil overstige 2 x 106 celler / ml på dette punktet siden den endelige konsentrasjonen skal være 2 x 106 celler / ml.
- Beis celler med trypan blå og telle cellene for å bestemme antall levedyktige celler.
MERK: Dette kan gjøres med et standard hemocytometer eller en automatisert celleteller. Vi bruker en automatisert celleteller som viser levedyktigheten og antall et levende celler.- For å bruke telleren, tilsett 10 μL celler til 10 μL trypan blå, bland, last kammerlysbildet og sett inn i telleren. Trykk på "capture" -knappen for å telle cellene.
- Beregn det totale antallceller ved å multiplisere cellekonsentrasjonen med volum og fortynn deretter cellene til 2 x 106 celler/ml i vekstmedium. Før plating, legg anti-CD28 til en endelig konsentrasjon på 5 μg / ml for å gi et nødvendig kotimulatorisk signal for T-celleaktivering.
- Pipetteceller i anti-CD3 belagte plater. Tilsett 3–6 x 106 celler per brønn (et godt mål er 4 x 106 celler i 2 ml medier per brønn) og inkuber i 2 dager ved 37 °C i 5 % CO2.
6. Klargjøre Fibronectin-belagte plater
MERK: PBMC- og T-celler uttrykker integrinreseptorer VLA-4 eller VLA-5 og er gode mål for fibronectin-mediert transduksjon.
- Før belegg platene, først forberede fibronectin reagens ved å fortynne den 1:100 i sterile PBS.
- Pipette 2 ml steril fibronectin oppløsning i hver brønn av en 6-brønnplate. Steinplater i 2 timer ved romtemperatur.
MERK: Ikke-behandlet, celle kultur-grade vev kultur plater eller retter bør brukes i dette trinnet. - Fjern fibronectin oppløsningen ved aspirasjon og deretter blokkere med 1 ml steril2% storfe serum albumin (BSA, Brøkdel V) i PBS. Rock platene ved romtemperatur i 30 min.
- Aspirer BSA-oppløsningen og vask platen med 2 ml PBS. Etter aspirasjon av PBS, fibronectin-belagt plater kan forsegles med tetningsfolie og lagres ved 4 °C i opptil en uke.
MERK: Vi forbereder vanligvis platene en dag før transduksjon.
7. Overføring av aktiverte rhesus PBMCer
FORSIKTIG: Arbeid med virale vektorer eller med rhesus macaque PBMCs krever utnyttelse av riktige sikkerhetsforanstaltninger som bruk av laboratoriefrakker og doble lag med hansker. All håndtering av viruset og cellene må forekomme i biosikkerhetshetten. Alle rør skal dekontamineres i en løsning på 10% blekemiddel i 30 min. Alt flytende smittsomt avfall bør dekontamineres med en endelig konsentrasjon på 10% blekemiddel. Sekundær inneslutning med et segl som forhindrer frigjøring av mikrobiologiske aerosoler, er nødvendig for sentrifugering.
- Fest den gammaretrovirale transducingvektoren til den fibronectinbelagte brønnen.
- Varm en sentrifuge til 32 °C ved å kjøre ved 2000 x g i ca. 30 min.
- Varm både serumfri og vekstmedia i et 37 °C-vannbad.
- Tin viruset på is eller ved å virvle hetteglasset forsiktig i et 37 °C-vannbad til bare liten mengde is gjenstår. For å unngå nedbrytning av det virale preparatet, ikke la innholdet varmes opp.
- Fortynn retroviruset til en forhåndsbestemt optimal multiplisitet av infeksjon (MOI) i serumfritt medium.
MERK: Med vår gammaretrovirus og rhesus PBMC har vi funnet ut at en MOI på 0,5 er optimal.- Eksempelfortynning: Å belegge 4 brønner med virus og legge til 1,5 x 106 celler, (4) (1,5 x 106) (0,5) = 3 x 106 TU er nødvendig. Hvis virustiteren er 1,1 TU/ml, bruk deretter 2,7 ml virus i 5,3 ml medier for et totalt volum på 8 ml.
- Tilsett 2 ml fortynnet retrovirus til hver brønn av den fibronectinbelagte platen.
- For negativ kontroll mock-transduced celler, legg media alene til fibronectin-belagt brønner.
- Plasser platene i den forvarmede 32 °C-sentrifugen i mikroplatebærere med biosikre deksler og sentrifuger ved 2000 x g i 2 timer.
MERK: Virusbelagte plater kan brukes umiddelbart eller oppbevares, med virus, ved 4 °C over natten. - For umiddelbar bruk, aspirere viruset forberedelse fra brønnene og legge til 2 ml vekst medium. Hold de virusbelagte brønnene fra tørking.
- Plate de stimulerte PBMCene.
- Kontroller cellene ved hjelp av et omvendt mikroskop. Cellene skal se sunne ut, noe som betyr at de er runde, lyse og frynsete lys. De bør også vise et klumpet utseende som indikerer stimulering.
- Samle målcellene og overfør dem til et 50 ml konisk rør. Skyll brønnen en gang med 1 ml vekstmedier og legg til det koniske røret. Tell antall levende celler med den automatiserte celletelleren som i trinn 5.4.
MERK: Stimulerte celler vil bli klumpet og denne klumpingen kan føre til vanskeligheter med å nøyaktig telle cellene. - Pellet cellene i rørene ved sentrifuging på 600 x g i 5 min ved 32 °C. Aspirer mediene fra cellepellet og resuspendcellene i vekstmedium med en konsentrasjon på 1,5 x 106 celler/ml.
- Til hver virusbelagt brønn (utarbeidet i trinn 7.1) legg til 1 ml cellesuspensjon for totalt 1,5 x 106 celler / 3 ml. Vær oppmerksom på at hver brønn allerede inneholder 2 ml vekstmedium. Utfør de samme trinnene for mock-transduced celler, men plate dem på fibronectin-belagt brønner som fikk ingen virus.
- Sentrifugerplatene ved 1000 x g i 10 min ved 32 °C.
- Inkuber platene i 48 timer ved 37 °C under 5 % CO2.
8. Utvidelse av de transduserte cellene
- Tegn innholdet i brønnene opp og ned med en 5 ml rør for å resuspendere cellene og deretter overføre til et 50 ml konisk rør.
- Legg til 1 ml vekstmedier til hver brønn og trekk opp og ned med en steril overføringsrør for å fjerne festeceller.
- Telle celler for å bestemme det totale cellenummeret og levedyktigheten ved hjelp av en automatisert celleteller som i trinn 5.4.
- Fjern om ønskelig 1 x 106 celler for flytcytometri for å vurdere genuttrykk og fenotype. Se trinn 9.5.1 og materialtabellen for anbefalte antistoffer og gatingstrategi.
- Sentrifugercellene ved 600 x g i 10 min ved 25 °C.
- Aspirer mediene og resuspendcellene i ekspansjonsmediet til en konsentrasjon på 1 x 106 celler/ml. Frø hver gassgjennomtrengelig brønn av en 6-brønnplate med 5 ml celler. Lag forsiktig ytterligere 25 ml ekspansjonsmedier per brønn.
MERK: Vi legger til cellene i et lite volum og lag deretter gjenværende medier slik at cellene forblir på bunnen av brønnen. - Inkuber cellene uforstyrret ved 37 °C i 5% CO2 inkubator i 4 dager.
9. Innsamling av utvidede celler og evaluering av fenotypen til den transduserte cellepopulasjonen
- Samle celler fra gassgjennomtrengelige brønner ved å fjerne og kaste 20 ml medier. Forsiktighet bør tas for å unngå å forstyrre cellene.
MERK: Vi utvider cellene i bare 4 dager og samler cellene på dette tidspunktet. Men hvis flere dager med kultur er ønsket, fjern 20 ml medier uten å forstyrre cellene og erstatte den med 20 ml friske ekspansjonsmedier. - Rør de gjenværende mediene opp og ned for å løsne cellene. Mediene bør være veldig overskyet hvis cellene har vokst godt.
- Ved hjelp av et sterilt overføringsrør skyller du hver brønn med 3 ml medier for å samle inn eventuelle gjenværende celler.
- Tell cellene med den automatiserte telleren eller et hemocytometer for å se etter levedyktighet og cellenummer.
- Utfør flow cytometri for å bestemme transduced genuttrykk og celle fenotype.
- I dette eksemplet, bestemme rhesus macaque PBMC fenotype ved hjelp av antistoffer rettet mot CD4 (M-T477), en klone som er reaktiv med både endogene rhCD4 og rhCD4-MBL CAR; mot CD3 (SP34-2) og CD8 (RPA-T8) som har henholdsvis T-celler og CD8 T-celler; mot dødreseptoren CD95 (DX2) og det kostimulerende molekylet CD28 (CD28.2) som brukes til å bestemme minnefenotypen til cellene; og mot CXCR5 (MU5UBEE) og MBL (3E7) for å oppdage CXCR5 og CD4-MBL CAR på de transduserte cellene.
- Vurder levedyktighet ble vurdert med en fikserbar levedyktig eå.
- Klargjør celler for flyt cytometri.
- Utgjør en antistoffmesterblanding for totalt antall rør. Få opp til totalt volum ved hjelp av PBS.
- Legg til cellene i flytrør. Legg 0,5–1 x 106 celler per rør. Inkluder negative kontroller som ufargede celler samt beiset mock transduced celler.
- Tilsett 2 ml PBS til cellene, sentrifuge på 400 x g i 5 min ved romtemperatur (RT) og dekanter.
- Tilsett 100 μL antistoffblanding i rørene og inkuber i 30 minutter ved RT.
- Tilsett 2 ml PBS, sentrifuge på 400 x g i 5 min ved RT og dekanter.
- Tilsett 300 μL av 1% paraformaldehyd og inkubasjon i 15 min.
- Sentrifuge på 400 x g i 5 min ved RT og dekanter. Tilsett 300 μL PBS og bland.
- På et flow cytometer, erverve 150.000 hendelser for hver prøve.
- Analyser dataene med programvare for flytanalyse.
MERK: Gatingstrategien ble tidligere publisert20.- For identifisering av transduserte celler, gateceller på lymfocytter, singleter, live, CD3+, og MBL +CXCR5+.
- For identifisering av den sentrale minnepopulasjonen, gateceller på lymfocytter, singleter, live CD3 +, CD8+, CD28+ CD95+.
- Bruk celler etter behov. Celler kan brukes til in vitro analyser av funksjon, for eksempel en transwell migrasjon analyse9 eller in vitro celle drap analyser5,9. Celler kan brukes til infusjon i dyr. Alternativt kan du fryse eventuelle gjenværende celler i 90 % FBS med 10 % dimetylsulfoksid (DMSO) for senere bruk eller analyse
MERK: Selv om en måldose for infusjon av adoptivoverførte celler til en rhesus macaque ennå ikke er fastslått, har publiserte adoptivoverføringsstudier hos ikke-menneskelige primater brukt 0,6 til 1,2 x 107 celler/kg21, 1 til 5 x 108 celler/kg22 og 1,4 til 8 x 108 celler/kg10. Med dette området som en retningslinje, kan nok celler til infusjon produseres med denne 9-dagers protokollen.
Representative Results
Celleproduksjon
Resultatene som presenteres i denne publikasjonen ligner på de i vårt tidligere publiserte arbeid9,20. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, forventer vi minst en 8-fold utvidelse av celler mellom dag 5 og 9 (median 11,1 fold, rekkevidde 8,7-13 fold). Gassgjennomtrengelige brønner ble seedet med en starttetthet på 5 x 106 celler, og etter 4 dager med vekst oppnådde vi en median tetthet på 55,6 x 106 celler per brønn (område 43,5–64,8 x 106) (figur 1A). Celletelling med Trypan Blue-eksklusjon viser at cellene opprettholder høy levedyktighet i hele protokollen (dag 9 median 85,8 %, område 83–95 %) (Figur 1B). Vi finner dyr til dyr variabilitet i cellenes evne til å utvide; Men med en startpopulasjon på 50–100 x 106 celler på dag 1, har vi imidlertid brukt denne protokollen til å produsere nok celler til rhesus macaque infusjon på 1–2 x 108 celler/kg.
Kopresjon av de transduserte genene ble overvåket med flow cytometri (Figur 2A). Uttrykket av CAR og CXCR5 på overflaten av de transduserte cellene var relativt stabilt mellom dag 5 og 9 i denne ekspansjonsprotokollen. På dag 5 var det en median på 42,8 % (område 36,5–46,9 %) cellene ble overført med både CD4-MBL CAR og CXCR5 mens på dag 9, var medianuttrykket 47,6 % (område 44,5–64,5 %) med en enkelt omgom transduksjon (figur 2B). Selv om noen protokoller krever en andre runde med transduksjon, har vi ikke sett en fordel når det gjelder totale transduserte celler ved avslutningen av protokollen (data som ikke vises).
Celle fenotype
Transduced celler ble analysert av flow cytometri å overvåke deres minne fenotype. Før transduksjon og utvidelse identifiseres naive, sentrale minne- og effektorminnepopulasjoner (data som ikke vises), men den naive populasjonen går tapt med kuling og cellene er primært sentrale minneceller etter dag 5 (figur 3A) og dag 9 (Figur 3B) som identifisert av CD95+ CD28+ uttrykk. Bruken av denne raske transduksjons- og ekspansjonsprotokollen har produsert celler som primært er sentrale minneceller og dermed vil være mer sannsynlig å spre seg og vedvare når de infunderes inn i et testdyr.
Figur 1: Transduksjons- og ekspansjonsprotokollen produserer rikelig med transduserte celler som er svært levedyktige. (A) Utvidelse av de transduserte cellene fra 6 forskjellige dyr fra dag 5 til 9 i gassgjennomtrengelige fartøy og (B) levedyktighet en transduced PBMC fra de samme 6 dyrene. Trypan blå utelukkelse ved hjelp av en automatisert celleteller ble brukt til å overvåke cellenummer og levedyktighet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Transduksjonsprotokollen produserer celler som opprettholder kopresjon av de to transduserte genene. (A) En representativ flytplott av rhesus PBMC på dag 9 av transduksjons- og utvidelsesprotokollen som viser uttrykk for både CD4-MBL CAR og CXCR5. (B) Uttrykk for CD4-MBL CAR og CXCR5 på transduced rhesus PBMC fra 6 forskjellige dyr på dag 5 og 9 i kultur målt ved strømning cytometri. Portene ble satt på live, CD3+ celler. Transduserte celler er identifisert som MBL+ CXCR5+. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: De fleste cellene som produseres i 9-dagersprotokollen har en sentral minnefenotype. Representative flow cytometri tomter av (A) dag 5 og (B) dag 9 CAR /CXCR5-transduced rhesus PBMC. Portene ble satt på live, CD3+, CD8+ celler. Sentralminne ble definert som CD28+ CD95+. Effector minne ble definert som CD28-, CD95+. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen skisserer en T-celle immunterapi produksjonsstrategi som benytter en gammaretroviral vektor for å transduce rhesus macaque PBMC fører til T cellepopulasjon som uttrykker en antiviral CAR samt follikulær homing reseptor, CXCR5. Med totalt 8 dager med ex vivo kulturtid produseres levedyktige, funksjonelle CAR T-celler i en mengde som er innenfor det publiserte området10,21,22 som brukes til infusjon i ikke-menneskelige primater for preklinisk effekttesting.
Suksessen til transduksjonsprotokollen er avhengig av både sunne, stimulerte PBMCer og kvalitetspreparater av gammaretrovirus. For å oppnå vellykket stimulering og transduksjon, er det viktig at riktig forsiktighet tas i frysing og transport av PBMCs etter innsamling. Ideelt sett, hvis cellene samles inn utenfor stedet, sendes de i flytende nitrogen og raskt plasseres i langsiktig flytende nitrogenlagring. PBMC-er må være mitotisk aktive for å kunne overføres av et gammaretrovirus. Man bør overvåke visuelt for klynger av cellene etter stimulering med anti-CD3 / anti-CD28. En unnlatelse av å aktivere riktig vil føre til lav effektivitet av transduksjon. Det er også viktig å overvåke levedyktigheten i de stimulerte cellene. Dårlig levedyktighet etter stimuleringstrinnet fører vanligvis til en mindre vellykket transduksjon. Enten viruspreparater produseres i laboratoriet eller outsources, bør de lagres ved -80 °C i engangsbruk for å unngå frysetiningssykluser som kan skade viruset og svekke transduksjonseffektiviteten. Viruset må titered slik at konsistente mengder virus kan brukes i hvert eksperiment. Når du bruker viruset for transduksjon, tine viruset raskt og lagre på is til det trengs. Valget av promoter, enhancer og konvolutt proteiner kan alle påvirke transduksjon effektivitet og uttrykk for transgene i målceller. Dermed må en MOI bestemmes empirisk. I tillegg har bruk av et medium designet for å støtte T-celler og plater med gassgjennomtrengelige brønner for ekspansjon ført til utmerket utvidelse av de transduserte cellene. Det er imidlertid dyr til dyr variabilitet i celle ekspansjonshastigheten. Vi anbefaler en studie for å bestemme evnen til et bestemt cellepreparat som skal overføres og utvides. Ekspansjonsnivåene er konsistente i både små og store transduksjoner.
Ved bruk av denne protokollen har vi produsert opptil 2,5 x 109 celler for infusjon i testdyr. Selv om vi har funnet det unødvendig å skalere opp protokollen på dette tidspunktet, er bruk av 6 brønnplater en begrensning for storskala celleforberedelse, og protokollen ville kreve endring for å produsere større antall celler. Eksempler på potensielle modifikasjoner inkluderer å utføre transduksjonen i en fibronectin-belagt kulturpose for å øke antall celler som er transducert og å utnytte et større gassgjennomtrengelig kulturfartøy for ekspansjonstrinnet. Selv om vi ennå ikke har gjort disse endringene, bruker de kommersielt tilgjengelige produkter og er mulige endringer i gjeldende protokoll.
Ved hjelp av denne metoden har vi produsert transduserte celler fra PBMC isolert fra uinfiserte dyr, SIV-infiserte dyr og fra SIV-infiserte dyr behandlet med antiretroviral terapi (ART). Vi har imidlertid notert en reduksjon i transduksjonseffektivitet i ART-behandlede celler20. Denne reduksjonen skyldes antagelig hemming av reverstranskripsjon og/eller integrase av stoffene. Transduksjoner av celler fra ART-behandlede dyr vil kreve endringer i denne protokollen, for eksempel å redusere de intracellulære nivåene av ART-stoffene ved å stoppe ART i flere dager før du samler PBMC eller gjennom bruk av en alternativ vektor som ikke påvirkes av ART-stoffene som vanligvis er i bruk.
Det er viktig at celler produsert for immunterapi være av en minimaldifferensiert fenotype slik at de vil vedvare etter infusjon12. Selv om mange protokoller for adoptivoverføring av celler krever lange kulturtider, har en redusert ex vivo kulturtid vært korrelert med både en reduksjon i differensiering og en forbedring i CAR T cellefunksjon13. Den relativt raske tidsrammen for denne transduksjons- og ekspansjonsprotokollen tillater vedlikehold av ønsket sentral minnefenotype samtidig som de produserer tilstrekkelige celler for testing av deres immunterapeutiske potensial20.
Målet med produksjonsstrategien for dette T-celleimmunterapiproduktet er å produsere T-celler som vil gjenkjenne SIV-infiserte celler, vil trafikktilere til stedet for viral replikering i B-cellefollikkelen og vil vedvare i dyret som resulterer i en langsiktig funksjonell kur uten behov for anti-retrovirale legemidler. For oversettelse til et humant immunterapiprodukt kan denne protokollen endres for å overføre humane T-celler gjennom bruk av menneskespesifikke antistoffer og cytokiner og implementering av GMP-standarder med det endelige målet om en funksjonell kur for Hiv.
Disclosures
Dr. Pamela Skinner er medgrunnlegger og sjefsvitenskapelig offiser i MarPam Pharma.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NIH-tilskudd 5R01AI096966-06S1 (PS, EC og EB), 1UM1AI26617 (PS, EC og EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH-stipend 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A1 43380-01 (PS og EB), 1UM14126617 (PS og EC) samt midler fra NIAID-divisjonen for intramural forskning og NIH Intramural AIDS Målrettet antiviralprogram. Anti-CD3 og anti-CD28 brukt i disse studiene ble levert av NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 som ble brukt i disse studiene ble levert av NCI Preclinical Repository. Vi takker våre samarbeidspartnere i dette CD4-MBL CAR/CXCR5-prosjektet, Dr. Elizabeth Connick ved University of Arizona, Dr. Edward A Berger ved NIAID, NIH, Dr. Eva G Rakasz ved Wisconsin National Primate Research Center og Dr. Geoff Hart og Ms. Preethi Haran ved University of Minnesota, Dr. Leslie Kean ved Harvard Medical School og Dr. Catherine Bollard ved Children's Research Institute. Vi takker også Dr. Scott McIvor ved University of Minnesota, Dr. Christopher Peterson ved Fred Hutchinson Cancer Center, Dr. Matthew Trivett ved NIH, Dr. Agne Taraseviciute ved Seattle Children's Hospital, og Dr. Conrad Russell Cruz ved The Children's Research Institute for deres svært nyttige hjelp til å optimalisere denne protokollen. Vi anerkjenner også ms. Chi Phan og Ms. Jhomary Alegria-Berrocal ved University of Minnesota for gammaretroviral produksjon, og Ms. Kim Weisgrau ved University of Wisconsin-Madison for isolasjon av rhesus macaque PBMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
References
- Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Sadelain, M., Rivière, I., Riddell, S. Therapeutic T cell engineering. Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).
- Kuhlmann, A., Peterson, C. W. Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure. Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).
- Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity. Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).
- Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).
- Connick, E., Mattila, T., et al. CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue. The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).
- Connick, E., Folkvord, J. M., et al. Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL. The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).
- Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication. Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).
- Ayala, V. I., Deleage, C., et al. CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering. Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).
- Redeker, A., Arens, R. Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination. Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).
- Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting Through Subsets. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
- Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection. The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).
- Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).
- Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies. Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).
- Chambers, C. A., Allison, J. P. Costimulatory regulation of T cell function. Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).
- Schwartz, R. H. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).
- Bajgain, P., Mucharla, R., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015 (2014).
- Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).
- Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
- Berger, C., Sommermeyer, D., et al. Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells. Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).
