Summary
Questo articolo descrive un metodo di trapianto per innestare cellule epiteliali mammarie del donatore nel cuscinetto di grasso bianco interscapular degli animali riceventi. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare gli effetti dell'ospite e/o del donatore sullo sviluppo dell'epitelio mammario ed elimina la necessità di pre-clearing, estendendo così l'utilità di questa tecnica.
Abstract
Già negli anni '70, i ricercatori hanno trapiantato con successo cellule epiteliali mammarie nel cuscinetto di grasso bianco interscapoare dei ratti. L'innesto dell'epitelio mammario con tecniche di trapianto sfrutta l'ambiente ormonale fornito dall'ospite di roditori adolescenti. Questi studi sono ideali per esplorare l'impatto di varie manipolazioni biologiche sullo sviluppo della ghiandola mammaria e sezionare molti aspetti della biologia della ghiandola mammaria. Una caratteristica comune, ma limitante, è che le cellule epiteliali trapiantate sono fortemente influenzate dallo stroma circostante e superate dall'epitelio endogeno; per utilizzare il tessuto mammario nativo, il cuscinetto di grasso bianco addominale-inguinale deve essere eliminato per rimuovere l'epitelio mammario ospite prima del trapianto. Un ostacolo importante quando si utilizza l'organismo modello di ratto è che la cancellazione dell'albero mammario in via di sviluppo nei ratti post-svezzamento non è efficiente. Quando trapiantate in cuscinetti di grasso privi di ghiandola, le cellule epiteliali del donatore possono ripopolare il cuscinetto di grasso ospite eliminato e formare una ghiandola mammaria funzionale. Il cuscinetto di grasso interscapular è una posizione alternativa per questi innesti. Un grande vantaggio è che manca di strutture frandutali ma fornisce il normale stroma che è necessario per promuovere la crescita epiteliale ed è facilmente accessibile nel ratto. Un altro grande vantaggio di questa tecnica è che è minimamente invasiva, perché elimina la necessità di cauterizzare e rimuovere l'albero di mammifero endogeno in crescita. Inoltre, il cuscinetto di grasso interscapular contiene un vaso sanguigno mediale che può essere utilizzato per separare i siti per l'innesto. Poiché le ghiandole endogene rimangono intatte, questa tecnica può essere utilizzata anche per studi che confrontano la ghiandola mammaria endogena con la ghiandola trapiantata. Questo documento descrive il metodo di trapianto di cellule epiteliali mammarie nel cuscinetto di grasso bianco interscapular di ratti.
Introduction
Lo sviluppo della ghiandola mammaria postnatale e la morfogenesi duttale sono processi in gran parte influenzati dalla segnalazione ormonale all'inizio della pubertà. Nei topi e nei ratti, organismi modello comunemente usati della biologia della ghiandola mammaria, questo processo inizia intorno a 3 settimane di età, dove la rapida proliferazione e differenziazione provocano la formazione del parenchyma maturo. La ghiandola mammaria matura può subire numerosi cicli di espansione e involuzione, una proprietà che è stata in fase di studio fin dall'inizio del XXsecolo. Nel contesto dell'iperproliferazione e dello sviluppo del cancro, le tecniche di trapianto di ghiandola mammaria sono state sviluppate negli anni '501e potenziate dalla metodologia quantitativa richiesta da Gould et al. nel 19772,3,4. Il perfezionamento della tecnica di trapianto nei roditori ha contribuito a importanti progressi nella comprensione della normale biologia della ghiandola mammaria che sono ancora ampiamente utilizzati per studiare l'effetto di vari trattamenti e la manipolazione genetica sullo sviluppo normale della ghiandola mammaria e sugli stati della malattia.
Molte ipotesi sono state generate e successivamente testate utilizzando il trapianto di ghiandola mammaria, descritto per la prima volta da DeOme et al. Gli esperimenti di diversi decenni hanno mostrato la propensione del tessuto duttale ascisa dalle ghiandole mammarie del donatore per ripopolare l'intero cuscinetto a grasso5,6,7 e ha indicato che una componente critica dello sviluppo della ghiandola mammaria risiede in queste strutture epiteliali. Studi successivi sui topi hanno mostrato che una singola cellula staminale mammaria può ripopolare un cuscinetto di grasso eliminato e ha contribuito alla scoperta di un singolo progenitore comune di cellule epiteliali mammarie basali e luminali8,9,10. In linea con queste conclusioni, è stato suggerito che il trapianto aumenti il pool di cellule con potenziale di ripopolamento multilineato a causa della plasticità, permettendo alle cellule innestate di coltivare una ghiandola mammaria funzionale7,10,11,12,13. È importante sottolineare che l'uso di tecniche di trapianto nei roditori supera i limiti delle anomalie indotte dalla coltura cellulare14 e spesso fornisce risultati in poche settimane.
Mentre la procedura è stata originariamente descritta nel contesto delle lesioni preneoplastiche nei topi, è stata presto ampliata ai ratti e utilizzata in combinazione con il trattamento cancerogeno per stabilire la molteplicità come misura della suscettibilità al cancro15, ma la popolarità delle tecniche di trapianto ha seguito lo sviluppo di strumenti genetici per ogni specie. Anche se gli studi sui topi che incorporano il trapianto hanno contribuito a molti risultati traslazionali, il parenchyma della ghiandola mammaria del ratto assomiglia più da vicinoall'uomo 16,17 e offre vantaggi distinti per lo studio del cancro al seno del recettore estrogeno-positivo (ER). I tumori mammari sono inducibili in entrambe le specie, ma differiscono in termini di sensibilità ormonale e profili di espressione genica. Una differenza primaria è che i tumori mammari del ratto esprimono e dipendono dalla funzione dei recettori dell'ormone ovarico e ipofisario, vale a dire, estrogeni e progesterone (PR), simile al sottotipo luminale-A del cancro al seno umano. Infatti, il trapianto di cellule epiteliali mammarie, come descritto in questo protocollo, è stato utilizzato per studiare le varianti genetiche coinvolte nel cancro al seno e determinare l'autonomia cellulare degli effetti sulle cellule epiteliali mammarie18.
Oltre alla biologia tumorale, l'epitelio duttale della normale ghiandola mammaria del ratto presenta un livello più elevato di ramificazione ed è affiancato da uno strato più spesso di stroma rispetto al topo. L'importanza dello stroma è ben documentata negli studi sui trapianti epiteliali mammari. L'epitelio mammario deve interagire con stroma grasso, e idealmente il proprio mesenchyme, per sottoporsi alla sua caratteristica morfogenesi19,20. L'innesto del tessuto in una ghiandola mammaria ricevente fornisce un ambiente ottimale; tuttavia, la presenza di epitelio endogeno può interferire con i risultati. Il preclearing della ghiandola mammaria dell'epitelio endogeno è comunemente eseguito nei saggi di trapianto di topi e richiede l'escissione chirurgica del tessuto mammario endogeno e/o la rimozione del capezzolo1,21,22. Anche se possibile, il preclearing dell'epitelio mammario nei ratti post-svezzamento non è così ampiamente eseguito, principalmente a causa dell'inefficacia di cancellare l'albero mammario in crescita nei ratti post-svezzamento. Dal momento che è stato dimostrato che le regioni del tessuto adiposo altrove nel corpo potrebbero sostenere la crescita dell'epitelio mammario trapiantato21,23,24, il processo di preclearing può essere facilmente evitato nei ratti innestando tessuto nella pastiglia bianca interscapoare.
Il metodo di trapianto descritto in questo documento prevede l'iniezione di organoidi della ghiandola mammaria enzimaticamente dissociata (frammenti di epitelio duttile mammario e altri tipi di cellule in grado di morfogenesi) o cellule monodisperse nel lassogio di grasso interscapoare in ceppi inbred, isogenici o congenici di ratti di laboratorio2 . Poiché la macchia di grasso interscalpulare è normalmente priva di tessuto mammario, fornisce un ambiente adatto per più siti di trapianto senza la necessità di epitelio endogeno pre-chiaro. Di conseguenza, le ghiandole mammarie endogene dell'animale ospite non sono soggette a manipolazione chirurgica, si sviluppano normalmente e non possono interferire con l'interpretazione dei risultati. Inoltre, le ghiandole mammarie intatte possono essere utilizzate per il confronto per valutare gli effetti dell'ospite rispetto al donatore sullo sviluppo dell'epitelio mammario e sulla tumorigenesi18,25. Anche se il ripopolamento della ghiandola mammaria da una singola cellula staminale è disponibile per i topi, non è ancora stato sviluppato per il ratto, principalmente a causa della mancanza di disponibilità di anticorpi da selezionare per le cellule staminali mammarie diratto 25,26,27. Nonostante questo, il trapianto di cellule epiteliali mammarie monodisperse per quantificare il potenziale di ripopolamento può essere eseguito con successo, e quelle cellule si svilupperanno normalmente quando innestate nel quadro appropriato2,3,4. Mentre gli organoidi sono buoni per molti scopi, le cellule monodisperse sono necessarie per applicazioni quantitative, ad esempio, per determinare il numero di cellule epiteliali mammarie necessarie per l'avvio del cancro in seguito al trattamento con radiazioni ionizzanti28 o per confrontare le caratteristiche del flusso citometricamente selezionato popolazione di cellule epiteliali29.
Ad oggi, la procedura qui descritta è il metodo più robusto per eseguire il trapianto di ghiandola mammaria nel ratto con l'obiettivo generale di studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria e i meccanismi alla base dello sviluppo del cancro al seno. Spesso, il donatore e/o gli animali ricittori sono esposti a variabili diverse prima, durante o dopo il trapianto epiteliale. Gli esempi includono studi genetici singoli che coinvolgono la carcinogenesi chimica30, radiazioni28,31,32, manipolazione genetica del genoma ospite/donatore18e manipolazione ormonale12. Uno dei principali vantaggi della dissociazione enzimatica descritta in questo protocollo è l'opportunità di isolare organoidi epiteliali o cellule monodisperse per esperimenti complementari che coinvolgono citometria di flusso, coltura 3D, modifica genica e altro ancora. Le future applicazioni di questa tecnica includeranno un'ulteriore manipolazione del donatore e/o del tessuto ospite con l'ingegneria genetica. Ad esempio, le cellule donatrici possono essere geneticamente modificate ex vivo in qualsiasi locus genomico scelto utilizzando il sistema di editing genico CRISPR-Cas9. Allo stesso modo, i ratti riceventi possono anche essere geneticamente modificati per studiare l'interazione tra fattori genetici ingegnerizzati del donatore e del ricevente.
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Protocol
Tutti gli animali sono stati alloggiati e mantenuti in una struttura approvata dall'AAALAC, e gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati approvati dal MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Gli animali da utilizzare nei trapianti reciproci devono essere un ceppo inbred o isogenico, con uno status congenico preferito o arrancato per almeno 6 generazioni.
1. Donatore di ratto mammario ghiandola
- Determinare il numero di ratti donatori necessari per il trapianto.
NOTA: Generalmente, 1 ratto donatore (4 settimane di età) può fornire abbastanza cellule per il trapianto in 4 animali ricogniti. Alcune applicazioni di questo protocollo richiederanno un numero aggiuntivo di cellule, e ci possono essere differenze specifiche di deformazione nella resa totale. - Etichettare tutti i materiali di consumo e garantire un posizionamento accessibile per il chirurgo (Tabella 1).
- Registrare il peso corporeo di ogni ratto donatore femminile. Seguire le linee guida istituzionali per anestesizzare completamente o eutanasia il ratto donatore. Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di risposta al pizzico della punta.
- Spostare l'animale nel campo chirurgico sterile. Posizionare l'animale sulla schiena e spruzzare l'intera superficie ventrale con 70% di etanolo.
- Fare un sagittale, incisione a forma di X, permettendo l'accesso a ghiandole mammarie toraciche, addominali e inguinali. Dissezionare tutto il tessuto della ghiandola mammaria dal ratto donatore utilizzando le forbici (Figura 1). Rimuovere tutti i linfonodi visibili.
- Estrarre il tessuto mammario con pinze e collocarlo in un piatto etichettato da 60 mm sul ghiaccio. Aggiungete al piatto 60 mm 500 l di supporto DMEM/F12 senza sieri. Regolare il posizionamento del tessuto della ghiandola mammaria in modo che rimanga completamente bagnato.
- Tritare finemente il tessuto mammario usando le forbici. Per farlo, tagliare il tessuto in pezzi di 1-2 mm3 di dimensioni (Figura 1C). Mantenere la ghiandola sul ghiaccio fino a quando tutto il tessuto donatore è stato raccolto (non superare i 60 min).
NOTA: il personale aggiuntivo può tritare le ghiandole mammarie e preparare la soluzione di collagenasi mentre il chirurgo procede con le estrazioni dei tessuti.
2. Estrarre tessuto cerebrale da donatori eutanasia
- Ruotare con attenzione il corpo dell'animale donatore per posizionarlo in una posizione prona. Sicuro con spilli. Spruzzare la testa e la parte superiore della schiena con il 70% di etanolo.
- Individuare la base del cranio e fare un'incisione sotto i condili occipitali. Inserire forbici affilate sotto la pelle e tagliare la pelle lontano dal cranio, compresi i lati della testa.
- Utilizzare frese ossee o forbici forti per tagliare il cranio lungo la linea mediana, dalle ossa occipitali a quelli frontali. Mantenere la lama il più superficiale possibile e angolo verso l'alto per evitare la distruzione del tessuto cerebrale sottostante.
- Sbucciare l'osso usando rongeurs o forti pinze. Inserire l'utensile laterale al cervelletto per rompere l'osso su entrambi i lati, esponendo il canale uditivo osseo. Serigisci i collegamenti con le meningi.
- Sollevare delicatamente il cervello con pinze curve e a punta fine. Posizionare il cervello su un pezzo di lamina e registrare il peso, e poi immediatamente trasferire a un tubo 15 mL con una quantità uguale (w:v) di supporto, memorizzato sul ghiaccio.
- Facoltativamente, utilizzare pinze di punta fine per rimuovere la ghiandola pituitaria (situata sotto il cervello) per un ulteriore uso nella procedura di trapianto, se necessario.
- Utilizzare un omogeneizzatore meccanico per interrompere il tessuto. Omogeneizzare il cervello per 10-15 s a bassa velocità. Lasciare riposare il composto sul ghiaccio per almeno 1 min, quindi omogeneizzare di nuovo. L'omogeneizzazione è sufficiente quando la miscela finale è priva di pezzi di grandi dimensioni.
- Filtrare l'omologina passandolo attraverso un filtro da 100 m. Mantenere il filtrato sul ghiaccio fino all'uso (meno di 4 h).
3. Digestione e lavorazione degli estratti di ghiandola mammaria
- Scongere o reagenti caldi come indicato (Tabella 1). Seguire i passaggi appropriati per il recupero di organoidi o cellule monodisperse.
- Preparare 10 mL di supporti di digestione senza siero (senza collagenana) per ogni animale donatore (File supplementare 1).
NOTA: Il volume del supporto di digestione utilizzato può essere regolato (scalato verso l'alto o verso il basso) per adattarsi al tessuto raggruppato, se applicabile.- Per gli organoidi saltare a 3.3.
- Per le cellule monodisperse, preparare la miscela di Monodispersion e la soluzione di inattivazione fresca (File supplementare 2, File supplementare 3) oltre al supporto di digestione del collagene senza siero. Procedere al passaggio 3.3.
- Quando tutto il tessuto mammario dei donatori è stato estratto e macinato, aggiungere l'enzima di collagena al supporto di digestione caldo (o a temperatura ambiente) (File supplementare 1). Mescolare invertendo.
- Passare il supporto di digestione del collagenase attraverso un filtro da 20 m. Distribuisci 10 mL di supporti filtrati nei tubi da 50 mL etichettati per la digestione.
- Utilizzare una nuova punta di pipetta da 1.000 lun per ogni campione e trasferire il tessuto del donatore macinato da ogni piatto da 60 mm al tubo di digestione del collagenae. Tagliare 1 cm dall'estremità di una punta di 1.000 le e posizionarlo manualmente sul dispositivo prima dell'uso. Mescolare delicatamente il tessuto macinato pipeting su e giù 1-2 volte.
NOTA: Se il tessuto è difficile da pipetta durante il trasferimento, utilizzare una piccola quantità del supporto di digestione del collagene dal tubo da 50 mL, quindi trasferirlo di nuovo. - Posizionare i campioni in posizione orizzontale in un'incubatrice agitazione e lasciare che i campioni digeriscano 1,5-2 h a 37 , 200-220 rpm.
- Per gli organoidi saltare a 3.7.
- Per le cellule monodisperse aggiungere DNase I (0,2 g/mL) alla miscela per gli ultimi 10 min della digestione. Incubare come prima, con agitazione vigorosa. Procedere al passaggio 3.7.
- Quando il tessuto è completamente digerito, pellet la sospensione utilizzando la centrifugazione a freddo (4 gradi centigradi) per 10 min a 1.200 x g (Figura 1D).
NOTA: Tenere i tubi sul ghiaccio tra ogni passo per aumentare la vitalità delle cellule. - Assicurarsi che si sia formato un pellet, quindi versare con attenzione lo strato supernatante e grasso. Respendere delicatamente il pellet in 10 mL di supporti DMEM/F12 freschi.
- Rotazione breve a 68 x g per circa 10 s. La lunghezza dello spin (ma non la velocità) può essere aumentata se non vi è una chiara separazione delle celle. Ispezionare visivamente il pellet prima di procedere (Figura 1D).
- Rimuovere con attenzione il supernatante, lasciando dietro di sé un piccolo volume. Procedere al passaggio successivo, in base alla necessità di organoidi o cellule monodisperse.
NOTA È importante lasciare un piccolo volume di supporti nel tubo perché il pellet sarà molto allentato. Il volume residuo dei supporti sarà diluito attraverso passaggi di lavaggio.- Per gli organoidi, aggiungere un altro volume di 10 mL del supporto DMEM/F12 e ripetere il lavaggio/spin. Dopo il secondo lavaggio, riattivare le cellule in un volume più piccolo (1-2 mL) del supporto DMEM/F12 per la filtrazione. Procedere al passaggio 3.11.
- Per le cellule monodisperse, sciogliere in 2 mL di HBSS preriscaldato con 0.025% (w/v) Trypsin e 6.8 mM EDTA. Digerire per 3-5 min a 37 gradi centigradi. Inattivare immediatamente.
- Aggiungere 4 mL di DMEM/F12 con 10% FBS per fermare inattivare la trypsin.
- Girare le celle a 270 x g per 5 min, quindi risospendere in DMEM/ F12 con 10% FBS di nuovo. Procedere al passaggio 3.11 per filtrare le celle.
- Filtrare le celle utilizzando un colino da 40 m posto in un nuovo tubo da 50 mL. Pre-bagnare il colino pipettando 1 mL dello stesso mezzo di base utilizzato per sospendere le cellule, quindi passare la sospensione cellulare attraverso il filtro utilizzando una pipetta per raccogliere frammenti ductali / organoidi.
NOTA: La resa approssimativa dell'epitelio filtrato dal tessuto della ghiandola mammaria di un singolo ratto donatore di 4 settimane è di 1 x 106 cellule.- Per gli organoidi, scartare la filtrata. Gli organoidi mammari rimarranno all'interno del cestello del colino cellulare e le cellule più piccole e indesiderate saranno eliminate. Invertire il colino cellulare su un nuovo tubo da 50 mL e risciacquare con qualsiasi volume necessario per raccogliere le cellule. Procedere al passaggio 3.12.
- Per le cellule monodisperse, scartare il colino cellulare e mantenere il filtrato perché le cellule epiteliali mammarie passeranno attraverso il filtro, insieme a cellule stromali e immunitarie più piccole. Risciacquare il tubo utilizzato per la digestione/centrifugazione con un altro volume di DMEM/F12 con 10% FBS e passare attraverso lo stesso colino cellulare. Pellet le cellule monodisperse per centrifugazione a 1.200 x g per 5 min. Procedere al passaggio 3.12.
NOTA: le celle risospese sono pronte per le applicazioni successive.
- Impulso girare la soluzione e garantire la formazione di un pellet cellulare prima di procedere alla fase successiva. Impulso girare di nuovo, se necessario.
- Rimuovere con attenzione il super-natante. Risospendere il pellet in un piccolo volume (1.000-2.000 L di DMEM/F12) per concentrare le cellule per il conteggio.
- Contare le cellule e diluire se necessario. Risospendere il numero desiderato di cellule per il trapianto in 20 : L di supporti DMEM/F12 per ogni animale. Tenere sempre le cellule sul ghiaccio.
NOTA: per ogni sito di innesto sarà necessario il numero di cellule del donatore nell'intervallo 1 x 105 - 1 x 106 celle in base all'endpoint dello studio. Ad esempio, gli esperimenti di carcinogenesi spesso richiedono un maggior numero di cellule trapiantate, rispetto ad altre applicazioni. Il numero di cellule necessarie deve essere determinato sperimentalmente per ogni ceppo. La procedura descritta in questo protocollo ha utilizzato 250.000 cellule donatrici in supporti 20 -L per sito di innesto, prima di mescolarsi con l'omogenea cerebrale, come descritto al punto 3.16. - Preparare qualsiasi aliquota di cellule necessaria per altri esperimenti (ad esempio, isolamento FACS3,26,27,30,33).
- Per gli organoidi, procedere al passaggio 3.16.
- Per le cellule monodisperse, quantificare le cellule vitali utilizzando trypan o colorazione blu di metilene, e quindi procedere.
- Preparare singoli lotti di materiale donatore per tutti i pazienti del trapianto. Unire i volumi uguali della sospensione cellulare (20 o L) con il 50% di omogeneizzato cerebrale (20 oL) per ogni sito di trapianto.
NOTA: In ogni sito verrà iniettato un totale di 40 l per sito, ma si consiglia di includere un minimo del 25% di volume in più per i rifiuti. - Procedere immediatamente al trapianto o al congelamento delle cellule per il trapianto in un secondo momento (potenziale punto di arresto).
NOTA: Le cellule congelate non sono state testate con questo protocollo e richiederanno l'ottimizzazione prima di generare una coorte di animali per esperimenti di trapianto. Si raccomanda vivamente di trapiantare cellule fresche.
4. Procedura di trapianto (ratti riceventi 4-5 settimane di età)
- Pesare ogni ratto destinatario e calcolare la dose corretta di analgesico approvato che verrà utilizzato nella procedura.
NOTA: i pesi corporei possono essere misurati fino a 24 ore prima della procedura. Seguire le linee guida istituzionali per limitare o anetizzare brevemente ogni animale per tutta la durata della rasatura. - Rasare l'area chirurgica su ogni animale utilizzando clipper elettrici. Identificare la base del cranio e l'inizio della colonna vertebrale. Circa un terzo della strada lungo la colonna vertebrale, radersi una zona di 3 cm x 2 cm sulla parte toracica superiore della schiena.
NOTA: La rasatura può essere eseguita anche in anestesia il giorno del trapianto, ma deve essere eseguita al di fuori del campo sterile. Riportare il ratto alla sua gabbia di casa fino a quando non è necessario. - Individuare tutte le forniture necessarie per il trapianto (Tabella 1).
- Valutare il sistema di anestesia animale da laboratorio prima dell'uso. Antecaricare eventuali fluidi e sostituire eventuali serbatoi o parti necessari. Assicurarsi che la linea di gas alla camera di anestesia sia aperta e che tutte le linee periferiche siano chiuse in modo che l'anestesia isoflurana e l'ossigeno possano fluire liberamente sull'animale una volta che è posto nella camera.
- Cuscinetti riscaldanti caldi per sostenere la temperatura corporea degli animali riceventi.
- Generare il campo sterile che verrà utilizzato per la chirurgia. Disporre i materiali di consumo come descritto nella Tabella 1.
- Amministrare l'analgesico preoperatorio ai ratti riceventi come indicato dal protocollo di cura degli animali approvato dal livello istituzionale.
- Svuotare le siringhe Hamilton con supporti sterili DMEM/F12 per prevenire la perdita di cellule. Assicurarsi che l'ago sia fissato al corpo della siringa, inserire l'ago nel liquido e disegnare indietro lo stantuffo. Riempire fino al volume massimo. Premere lo stantuffo verso il basso ed espellere il contenuto in un tubo di raccolta dei rifiuti. Ripetere 3-5 volte.
- Caricare l'intero volume di materiale donatore (preparato al punto 3.16) in una siringa separata per ogni condizione (ad esempio, controllo, trattamento, tipo selvaggio, knockout, ecc.). Inserire la punta dell'ago nel liquido, disegnare indietro lo stantuffo e mantenere l'ago sotto la superficie della miscela come il volume nel tubo diminuisce.
NOTA: includere almeno il 10% di volume in più in ogni siringa. Non smaltire la miscela rimanente chiudere il tubo e tenerlo sul ghiaccio nel caso in cui sia necessario più. - Invertire la siringa dopo che è completamente caricata e premere leggermente lo stantuffo per rimuovere le bolle d'aria sulla punta dell'ago. Procedere al passaggio successivo quando tutto è preparato.
NOTA: Assicurarsi che la punta dell'ago non tocchi mai qualsiasi altra superficie, anche all'interno del campo sterile. È utile riposare il corpo della siringa su un piccolo contenitore di ghiaccio per promuovere la vitalità delle cellule. - Posizionare l'animale ricevente nella camera di anestesia e accendere la macchina.
- Quando l'animale è completamente rilassato (non reagisce alla maschiatura o al movimento delicato della camera), dirigere l'anestesia verso il cono del naso e trasferire l'animale nel campo sterile.
NOTA: la durata prolungata dell'anestesia non è ben tollerata dai ratti. Completare la procedura per ogni animale in 10 minuti o meno. - Posizionare l'animale in una posizione prona (sullo stomaco) in modo che la parte posteriore della testa e la colonna vertebrale superiore sia accessibile.
NOTA: Assicurare sempre un adeguato supporto termico per l'animale e valutare regolarmente la profondità dell'anestesia utilizzando un pizzico di punta. - Facoltativamente, applicare unguento vet oftalmico per evitare l'essiccazione degli occhi.
- Pulire l'area appena rasata per rimuovere i capelli in eccesso. Utilizzare un movimento circolare e applicare il 70% di etanolo (o un altro reagente, secondo le linee guida istituzionali) sulla pelle, seguito da un antisettico (come lo iodio) e ripetere. Posizionare un drappo asciugamano sopra l'animale in modo che solo la regione per l'area rasata è esposta.
- Assicurarsi che l'animale non risponda agli stimoli profondi con un pizzico fermo del dito del cuore, quindi procedere al passaggio successivo.
- Fare una piccola (2 cm) incisione interscapular utilizzando una lama chirurgica tagliente.
NOTA: Il taglio deve essere superficiale, in quanto il cuscinetto di grasso si trova appena sotto la pelle. - Individuare il vaso sanguigno mediale per l'orientamento (Figura 2B).
- Sollevare la pelle su un lato dell'incisione utilizzando pinze e tenerla lontano dal cuscinetto grasso mentre viene eseguito il trapianto (Figura 2B). Inserire l'ago nel sito dell'innesto.
- Facoltativamente, spostare la punta dell'ago all'interno del tessuto e creare una piccola tasca per raccogliere le cellule. Utilizzare un movimento piccolo e ripetitivo. Non rimuovere l'ago.
NOTA: questo passaggio è consigliato per i nuovi utenti del protocollo. Prestare estrema cautela quando si crea una tasca, come il tessuto cuscinetto di grasso interscapular è molto delicato.
- Facoltativamente, spostare la punta dell'ago all'interno del tessuto e creare una piccola tasca per raccogliere le cellule. Utilizzare un movimento piccolo e ripetitivo. Non rimuovere l'ago.
- Iniettare con cura 40 once di miscela cellulare nel tessuto cuscinetto del grasso interscapolare. Rimuovere l'ago lentamente.
- Tenere il tessuto in posizione e lasciare che le cellule trapiantate si accontentino di 3-5 s. Utilizzare un paio aggiuntivo di pinze, se necessario.
- Rimuovere l'ago. Ripetere la procedura di iniezione (passaggi 4.18-4.21) nel secondo sito di trapianto.
NOTA: L'epitelio di un gruppo di donatori può essere iniettato nello stesso lato del cuscinetto a grasso in ogni animale, o alternando lati per evitare effetti batch dalla dominanza della mano del chirurgo. - Chiudere la ferita chirurgica utilizzando clip o suture della ferita, quindi interrompere l'anestesia.
- Fornire analgesico post-operatorio come indicato dal protocollo approvato dal livello istituzionale.
- Spostare immediatamente l'animale in una gabbia di recupero con il supporto termico. Monitorare i segni di angoscia come sanguinamento dall'incisione o difficoltà respiratorie.
NOTA: L'animale deve recuperare completamente entro 5-10 min. Fare riferimento alle linee guida istituzionali per il ritorno degli animali alla colonia e il monitoraggio post-operatorio dopo le procedure di sopravvivenza. - Facoltativamente, eseguire studi di carcinogenesi presso il sito di innesto somministrando agenti cancerogeni ai ratti riceventi 3-4 settimane dopo il trapianto.
NOTA: In genere, la carcinogenesi mammaria del ratto viene eseguita utilizzando un trattamento chimico cancerogeno a 50-57 giorni di età. Questo trattamento impone l'età della chirurgia del trapianto (che deve essere fatto tra 29-36 giorni di età) per consentire abbastanza tempo per le cellule innestate per avviare la crescita della ghiandola mammaria.
5. Valutazione della crescita epiteliale
- Monitorare il ciclo estrus dei ratti attraverso lo svasatura vaginale quotidiana ed esaminare la citologia su un vetrino del microscopio. Iniziare 8-12 giorni prima del punto finale dello studio. Sacrifica tutti i topi nella stessa fase. Si tratta di un passaggio facoltativo.
NOTA: Il ciclo di ratto estrus è di 4-5 giorni. Permettere all'animale di passare attraverso 1-2 cicli completi faciliterà l'interpretazione, come vetrini di lavanda da cicli precedenti possono essere utilizzati per il confronto. - Ratti per trapianti di sacrificio 6-8 settimane dopo il trapianto, per linee guida istituzionali.
NOTA: L'escrescenza è solitamente rilevabile 3-6 settimane dopo il trapianto, ma potrebbe essere necessario ulteriore tempo. - Posizionare l'animale in posizione prona e pulire il corpo con il 70% di etanolo. Sollevare la pelle con pinze e fare un'incisione lungo la colonna vertebrale per esporre il piagpo interscapular. Dissezionare la pelle lontano dal tessuto in modo che la maggior parte del tampone di grasso è visibile.
- Identificare il vaso sanguigno mediale che separa i siti di innesto nel cuscinetto di grasso interscapular. Accisa l'intero pad come singolo pezzo di tessuto o tagliato lungo il vaso sanguigno e rimuovere i lati singolarmente.
- Posizionare il tessuto su un vetrino a microscopio caricato positivamente per l'intero supporto. Utilizzare 2 paicidi smussate e diffondere delicatamente il tessuto per ripristinare la sua conformazione originale sul vetrino.
NOTA: Il tessuto mammario ratto è estremamente delicato. I bordi del tessuto possono arricciarsi sotto se stesso. Maneggiare sempre con cura e tenere in posizione fino a quando il tessuto aderisce al vetrino (pochi secondi). - Intero-montaggio almeno una delle ghiandole mammarie addominali-inguinali endogene (con linfonodi per l'orientamento) per il confronto.
- Mettere i vetrini nel 70% di etanolo per 7-10 giorni per defare il tessuto. Ricostituire l'etanolo tutte le volte che è necessario per garantire che il tessuto non si asciughi.
- Preparare la macchia dell'asilo ed elaborare i vetrini quando il tessuto è sufficientemente opaco. Lasciare raffreddare la macchia prima dell'uso (File supplementare 4).
NOTA: La macchia può essere preparata fino a un giorno prima dei passaggi di fissaggio e reidratazione. La soluzione può essere immagazzinata a 4 gradi centigradi e ha un potenziale limitato per il riutilizzo. - Fissare il tessuto posizionando i vetrini nel 25% dell'acido acetico glaciale : 75% di etanolo per 60 min.
- Reidratare il tessuto attraverso una serie di 3 lavamenti in una serie di diminuzione della concentrazione di etanolo: 70% etanolo per 15 min, 50% etanolo per 5 min e dH2O per 5 min.
- Macchia con allume di allievio per 4-8 giorni. Controllare la parte posteriore dei vetrini ogni giorno per determinare se la macchia è completamente penetrata nel tessuto. Procedere al passaggio successivo quando la colorazione è completa.
NOTA: la colorazione è completa quando le parti più spesse della ghiandola hanno una tonalità viola e non appaiono più bianche. - Disidratare e disidratare il tessuto trasferendo i vetrini attraverso una serie di crescente concentrazione di etanolo: 70% di etanolo per 30 min, 95% di etanolo per 30 min e 100% etanolo per 30 min.
- Mettere i vetrini disidratati in xilene per più di 3 giorni per eliminare il tessuto. Trasferimento all'olio minerale per lo stoccaggio a lungo termine.
- Dopo che i vetrini sono stati cancellati, utilizzare la microscopia luminosa a bassa potenza o la fotografia digitale ad alta risoluzione per acquisire immagini delle diapositive per l'analisi. Assicurarsi che i parametri di acquisizione delle immagini siano coerenti per tutte le diapositive.
NOTA: l'escrescenza epiteliale deve essere chiaramente distinguibile. - Considerare la presenza di escrescenza come risultato binario.
- Calcolare il numero medio di cellule epiteliali trapiantate che hanno prodotto una crescita mammaria pari a 1 USD nel 50% dei siti di innesto utilizzando le immagini acquisite. Quantificazione altre caratteristiche fisiche, in base alle esigenze.
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Representative Results
Donatore e trighi mammarie destinatarie
I passaggi per isolare e preparare le cellule epiteliali mammarie del ratto per il trapianto sono illustrati nella Figura 1A. A 4 settimane di età, la ghiandola mammaria endogena del ratto donatore ha iniziato la maturazione e l'epitelio può essere visualizzato su interi vetrini montati macchiati con carmine di allume (Figura 1B). Un ratto donatore a questa età fornirà circa 1 x 106 cellule per il trapianto. Se la quantità di tessuto donatore raccolto o successiva macillatura è insufficiente, la resa delle cellule dopo la digestione del collagenasi può essere bassa. Come tale, è importante raccogliere quanto più tessuto della ghiandola mammaria possibile dai donatori. Il tessuto della ghiandola mammaria completamente digerito dovrebbe avere un aspetto oleoso, senza pezzi visibili di tessuto nellasospensione( Figura 1C). La digestione completa del tessuto della ghiandola mammaria da un singolo donatore dovrebbe provocare la formazione di un pellet visibile che contiene gli organoidi mammari, come mostrato nellafigura 1D). Se un pellet non è visibile, l'analisi potrebbe richiedere l'ottimizzazione. Nella Figura 2, vengono mostrate la ghiandola mammaria del ratto e le posizioni del blocco grasso interscapular. I risultati non possono essere interpretati a meno che i punti di riferimento biologici non siano identificati correttamente al momento della raccolta dei tessuti (Figura 2A) e del trapianto (Figura 2B). In questo saggio, il vaso sanguigno mediale del tampone di grasso bianco interscapular viene utilizzato come punto di riferimento biologico.
Valutazione qualitativa e quantitativa della crescita epiteliale
La presenza, l'assenza o l'abbondanza di epitelio possono essere valutati per determinare il successo dell'esperimento, così come l'autonomia degli effetti legati alle variabili sperimentali. Per quest'ultimo, alcuni studi possono richiedere interi vetrini montati con la ghiandola mammaria addominale-inguinale endogena dell'ospite per il confronto. Come misura preliminare, la microscopia leggera può essere utilizzata per documentare l'escrescenza epiteliale come risultato binario. Questi dati possono essere analizzati statisticamente per testare l'ipotesi che il rifiuto dell'innesto dipendio sia dipendente dalle variabili del donatore o del destinatario. Un esperimento di trapianto reciproco in cui ciascuno di questi fattori ha 2 livelli- per esempio, wildtype (WT) vs knockout (KO), creerà 4 gruppi di trapianto per il test di ipotesi (Figura 3A). I gruppi di trapianto, espressi come genotipo donatore:ricevente, sono: WT:WT, WT:KO, KO:KO, KO:WT. Quando si utilizzano animali igenici o quasi congenici, il rigetto dell'innesto è minore e si verifica ugualmente tra i gruppi di trapianto. Uno dei vantaggi di più siti per il trapianto all'interno del cuscinetto di grasso interscapolare è una riduzione degli animali riceventi necessari, poiché 2 tipi di cellule donatori possono essere valutati in un unico host. Inoltre, entrambi i siti possono essere utilizzati per testare un singolo tipo di cellula donatore a un tasso di incidenza più elevato, utilizzando lo stesso numero di ratti. Utilizzando il genotipo come esempio, questo è dimostrato nella Figura 3B.
L'escrescenza epiteliale può anche essere analizzata utilizzando immagini delle diapositive che sono state acquisite in precedenza. Un esempio di un intero cuscinetto di grasso interscapolare contenente escrescenza epiteliale in entrambi i siti di innesto (registrati come esiti positivi) è mostrato per un esperimento utilizzando il protocollo di trapianto di cellule mammarie descritto qui (Figura 3C). La mancanza di epitelio nel cuscinetto di grasso interscapular in molti campioni può indicare un problema tecnico con la procedura ed è trattata come un risultato negativo.
Il risultato di esperimenti di trapianto reciproco può essere ulteriormente utilizzato per distinguere gli effetti autonomi o non autonomi alle cellule epiteliali mammarie. Per testare l'ipotesi che un effetto sia guidato da processi nelle cellule epiteliali mammarie (cellula-autonoma) o influenzato dall'ospite/microambiente (non autonomo), la concordanza del fenotipo della cellula del donatore a quello del fenotipo ospite (endogeno) è trattato come un risultato dicotomio. In un esempio come un saggio di carcinogenesi, l'incidenza del tumore può essere analizzata come dati di risposta binaria e l'analisi di regressione logistica utilizzata per determinare se l'interazione donatore, ospite o donatore-ospite contribuisce in modo significativo al tasso di incidenza del tumore nel sito di trapianto. Se l'effetto è guidato dalle proprietà dell'epitelio del donatore, un esito simile del trapianto può essere osservato tra i gruppi beneficiari, indipendentemente dalle condizioni dell'ospite. Se l'epitelio del donatore si sviluppa come se fosse endogeno all'ospite, a causa di un contributo del genotipo o del trattamento dell'ospite, l'effetto può essere non autonomo. In entrambe le situazioni, i gruppi di trapianto in cui le cellule epiteliali dei donatori corrispondono all'ospite (self:self) devono essere interpretati come controlli e conclusioni supportate da analisi statistiche.
Per dimostrare i risultati degli effetti autonomi e non autonomi sull'epitelio trapiantato, è stata fornita un'illustrazione (Figura 4A), insieme a diapositive da trapianti reciproci di tipo selvatico e esperimenti di epitelio mammario ratto Cdkn1b knockout. I risultati di questo studio suggeriscono effetti non mammari autonomi18 (Figura 4B). Per i reciproci risultati dei trapianti classificati come risposta binaria, la probabilità che il risultato (ad esempio, la concordanza del fenotipo ospiterà l'epitelio, o la riuscita escrescenza nei saggi quantitativi) dipende da variabili categoriche (ad esempio, donatore o genotipo ricevente) può essere testata costruendo un modello di regressione logistica per gli effetti principali e i termini di interazione.
Figura 1: Preparazione delle ghiandole mammarie del donatore. (A) Panoramica della procedura di estrazione del tessuto della ghiandola mammaria dagli animali donatori e recupero degli organoidi per il trapianto. (B) Le ghiandole mammarie addominali-inguinali montate intere di un ratto di 4 settimane (età tipica dei donatori di trapianti), dopo la colorazione dell'almine. A 4 settimane di età, l'epitelio mammario era in fase di espansione, ma l'albero duttale non penetra completamente il cuscinetto di grasso, come dimostra la vicinanza ai linfonodi centrali. (C) La consistenza della ghiandola mammaria tritata viene mostrata dopo il taglio (rosa) in un piatto da 60 mm sul ghiaccio, con una quantità appropriata di supporti DMEM/F12 per mantenerla umida. Le immagini adiacenti forniscono un confronto dell'epitelio macinato dopo il trasferimento del liquame a Collagenase Digestion Media e quando la digestione è completa, 90-120 minuti dopo. (D) Gli organoidi epiteliali pelleti e la separazione degli strati sono visibili dopo la centrifugazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione dei confini per la raccolta dei tessuti e l'iniezione di cellule epiteliali mammarie. (A) Vengono mostrate le posizioni delle ghiandole mammarie dei ratti per la raccolta dei tessuti. Viene delineata la posizione approssimativa delle ghiandole mammarie addominali-inguinali endogene raccolte dai donatori e dai destinatari. (B) Dopo la rasatura e aver fatto un'incisione superficiale, viene esposto il cuscinetto di grasso bianco interscapolare di un ricevente del trapianto. Immagine in alto: il vaso sanguigno mediale (freccia gialla) è visibile al centro dell'incisione. Immagine in basso: la pelle su un lato dell'incisione viene sollevata per mostrare la larghezza del tampone di grasso IS sotto la pelle, rispetto al vaso sanguigno mediale (freccia gialla). L'epitelio del donatore viene iniettato sotto questo lembo nel cuscinetto a grasso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema dei trapianti reciproci. (A) Viene mostrata la progettazione sperimentale tipica per il trapianto reciproco, utilizzando come esempio i genotipi. Il test di una singola variabile sperimentale, come l'abbattimento genico (KO) rispetto all'epitelio donatore di tipo selvatico (WT), crea 4 gruppi di pazienti per il trapianto. (B) Esempio di disegno per un singolo animale ricevente che riceve 2 iniezioni di materiale donatore. Più siti per l'innesto sono accessibili quando si utilizza il tampone grasso bianco interscapular a causa della presenza di un vaso sanguigno lungo la linea mediana. Preparazioni separate di tipo selvaggio e di epitelio del donatore ad eliminazione diretta (o altre condizioni di prova) possono essere iniettate a sinistra e a destra del vaso sanguigno. (C) Rappresentante intero montato IS tessuto cuscinetto agrasso da un recipiente di trapianto è visualizzato nello stesso orientamento come nell'esempio presentato in (B). L'escrescenza epiteliale mammaria è visibile in due siti di trapianto su un vetrino intero montato con tessuto macchiato di allume. Il cuscinetto di grasso interscapolare è stato assolto come un singolo pezzo 6 settimane dopo il trapianto. Può essere necessario un tempo supplementare per lo sviluppo epiteliale, ma può anche facilitare la crescita eccessiva e la difficoltà di distinguere gli innesti individuali dei donatori. Gli artefatti biologici comuni possono essere visibili: MS - muscolo, TP - epitelio trapiantato, BF - tessuto adiposo marrone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi dei risultati autonomi delle cellule mammarie e non autonoma. (A) Simulazione dei risultati che possono essere osservati in caso di contributi significativi di effetti autonomi e non autonomi sul fenotipo dell'epitelio del donatore. In questo esempio, le ghiandole addominali-inguinali endogene dell'host vengono utilizzate come confronto. La concordanza del fenotipo della crescita epiteliale del donatore, rispetto alla ghiandola endogena, può essere utilizzata come riferimento, ma non deve essere utilizzata per determinare esclusivamente gli effetti. (B) L'escrescenza dell'epitelio mammario del donatore è mostrata nel sito di trapianto, adiacente alle immagini della ghiandola endogena per tutti e 4 i gruppi in un esperimento di trapianto reciproco. Effetti non autonomi sull'epitelio mammario osservati dopo l'eliminazione di un singolo gene, Cdkn1b, suggerendo che il microambiente dell'ospite colpisce la ghiandola mammaria in via di sviluppo18. Le barre della scala rappresentano 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passo Necessario | Articoli su ghiaccio | Scongelato/Preriscaldato | Articoli vicino al chirurgo |
| 1. Preparazione dell'epitelio della ghiandola mammaria | Piatto da 60 mm | Strumenti chirurgici sterili | |
| Aliquota di DMEM/F12 | 70% di etanolo | ||
| 2. Estrazione del cervello del donatore | Aliquota del supporto in tubo da 15 o 50 mL (circa 1-2 mL/donatore) | Equilibrio per la pesatura del cervello, all'interno di un campo sterile | |
| Tubo da 15 mL etichettato per ogni donatore, adatto per l'omogeneizzazione | Foglio | ||
| Pipette e punte (1000 l, o elettroniche con pipette sierologiche da 5 mL) | |||
| Omogeneizzatore meccanico | |||
| 3. Digestione ezimatica delle ghiandole dei donatori | Sufficiente DMEM/F12 per i lavatori | Supporti per la digestione senza siero | Scala di laboratorio (g) |
| DNasia I | Miscela di Monodispersion | Incubatore/shaker | |
| Soluzione di inattivazione | Tubo da 50 mL (etichettato) per ogni donatore | ||
| Siringa da 10 mL (o superiore) per supporti per la digestione di collagenase sterile | |||
| 20-40 filtri M | |||
| Aliquota dei supporti per i filtri pre-bagnati | |||
| Tubi da 50 mL per la raccolta di soluzioni enzimatiche filtrate | |||
| Forbici sterili per il taglio di punte usa e getta | |||
| Grande becher per la raccolta di supernatali, o linea di vuoto per aspirare | |||
| 4. Trapianto | Epitelio del donatore - miscela di omogenei cerebrale | Siringhe Hamilton – 1 per genotipo/condizione del donatore | |
| Aliquota di DMEM/F12 a siringhe prime | Scala | ||
| Forniture chirurgiche sterili (scalpel/forbici, pinze multiple) | |||
| Clip/suture per ferite | |||
| Garza | |||
| 70% di etanolo o isopropanolo | |||
| Beta-dine o iodio | |||
| Analgesico | |||
| Supporto termico per gli animali destinatari | |||
| Asciugamani di carta o salviettine delicate |
Tabella 1: Articoli che richiedono un anticipo in ogni fase. Questo elenco è progettato per essere utilizzato come riferimento durante la preparazione di un esperimento e non deve essere considerato esaustivo. I reagenti possono essere necessari solo per applicazioni specifiche del protocollo, in base all'inclusione/esclusione di passaggi facoltativi. In qualsiasi esperimento, questi elementi devono essere accessibili senza indugio una volta avviata la procedura.
File supplementare 1: Preparazione del supporto per la digestione del collageneste senza siero. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
File supplementare 2: Preparazione della miscela monodispersione. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
File supplementare 3: Preparazione della soluzione di inattivazione. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
File supplementare 4: Preparazione della macchia di Allume-Carmine. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Questo protocollo descrive una tecnica di trapianto di cellule epiteliali mammarie ottimizzata per lavorare con i ratti. Gli organoidi epiteliali mammari isolati dai ratti donatori (3-5 settimane di età) vengono innestati nel cuscinetto di grasso bianco interscapular dei ratti ricitti (anche 3-5 settimane di età). I risultati possono essere interpretati appena 4-6 settimane dopo, utilizzando la microscopia leggera per esaminare il tessuto innestato; tuttavia, la quantità ottimale di tempo tra il trapianto e il sacrificio deve essere determinata prima di implementare un esperimento completo. Se è trascorso troppo poco o troppo tempo, i risultati non saranno né interpretabili né significativi. Per ottimizzare il protocollo, analizzare la crescita in un piccolo set di animali 6-8 settimane dopo il trapianto. Se l'epitelio trapiantato è presente, ma sottosviluppato, aumentare la lunghezza del tempo. Se gli innesti sono ben sviluppati ma le caratteristiche sovrapposte dell'epitelio interferiscono con le analisi, considerare la riduzione del numero di settimane per l'escrescenza epiteliale. Se la quantità di tempo non può essere ridotta (ad esempio, negli esperimenti di carcinogenesi), si consiglia di iniettare lo stesso tipo di epitelio del donatore in entrambi i siti di trapianto (uno su ciascun lato del vaso sanguigno mediale), in quanto gli esiti non possono essere interpretati da singoli lati con certezza al 100%. Se si sospetta qualsiasi tipo di interazione (autocrine, paracrina), si consiglia vivamente di includere ulteriori animali di controllo iniettati con lo stesso tipo di epitelio donatore in entrambi i siti di trapianto. I passaggi critici della procedura includono una corretta quantificazione delle cellule donatrici dopo la digestione ezimatica e una miscela uniforme con l'omogenea cerebrale. È necessario prestare particolare attenzione a queste misure per garantire che il numero di cellule trapiantate sia costante tra gli animali ricunati. Inoltre, durante l'iniezione, assicurarsi che la miscela di tessuto innestato non fuoriesca dal cuscinetto di grasso interscapolare. 3. Eccitare il cuscinetto di grasso interscapular all'endpoint dell'esperimento. L'intero pad può essere rimosso come un singolo pezzo, ma è necessario prestare attenzione se si sceglie di separare i due lati del pad grasso interscapular, tagliando solo dopo aver identificato il vaso sanguigno mediale. Può essere difficile determinare il lato da cui ha avuto origine l'escremento, soprattutto quando un innesto è cresciuto troppo nell'altro, rendendo la rimozione come un singolo pezzo più ideale.
Una modifica comune della procedura è l'aggiunta di un trattamento cancerogeno del ratto ricevente25,29. Il tessuto innestato può mantenere la suscettibilità alla carcinogenesi posseduta dal ratto donatore25, o, al contrario, il tessuto donatore può adottare la suscettibilità dell'ospite30. Questi effetti possono essere determinati solo quando si utilizza il cuscinetto di grasso interscapular come sito di trapianto, perché le ghiandole mammarie endogene rimangono intatte e funzionano come un controllo interno positivo.
Quando si utilizzano organoidi della ghiandola mammaria per il trapianto, l'assenza di escrescenza epiteliale può essere dovuta a problemi con la preparazione delle cellule donatorie o la procedura di iniezione. Il rigetto dell'innesto può verificarsi anche quando il ricevente e il ceppo del donatore non sono congeniti, causando una risposta immunitaria nell'ospite. In questi casi, il sistema immunitario ricevente riconosce il tessuto donatore come non-auto, avvia una risposta immunitaria e il tessuto innestato non riesce a crescere. Per ridurre il rischio di insufficienza di innesto quando donatore e ricevente sono su diversi background genetici, un minimo di 6, e, idealmente, più di 10 generazioni di backcrossing sono raccomandati per evitare sfide che possono influenzare l'interpretazione dei risultati. A 6 generazioni di backcross, la maggior parte degli innesti crescerà, ma una minoranza potrebbe ancora fallire. Quando si risolve la preparazione delle cellule del donatore come causa di innesto, considerare se la digestione ezimatica era troppo dura, le cellule sono state mantenute a temperature troppo alte o troppo basse, fonti di contaminazione, ottimizzazione del numero di cellule donatrici utilizzate per il saggio o altre deviazioni del protocollo che influenzano la vitalità e l'escrescenza delle cellule.
È stato dimostrato che le singole cellule staminali mammarie sono state mostrate nel topo per essere in grado di ricostituire una ghiandola mammaria funzionale, il che dimostra che l'aggiunta di supporto ormonale non è necessaria per l'esito primario. L'aggiunta di omogenea cerebrale migliora significativamente l'esito del trapianto servendo come matrice strutturale per le cellule donatrici e riducendo il rischio di rigetto del trapianto di migrazione3,34,35,36. Quando combinato con l'omogenea cerebrale, il numero minimo di cellule epiteliali mammarie necessarie per il trapianto è ridotto di oltre 10 volte, rispetto alle alternative3. È importante sottolineare che l'incommensuranza dell'omogenea cerebrale sinogene non ha dimostrato di influenzare il fenotipo dell'epitelio trapiantato e ha prodotto esiti costanti nella carcinogenesi mammaria e negli studi di suscettibilità per oltre 40 anni.
Alcuni potrebbero sostenere che il cuscinetto di grasso interspolare non è rappresentativo del cuscinetto di grasso mammario endogeno a causa delle distinzioni anatomiche: la vicinanza del tampone di grasso IS al tessuto adiposo marrone, potenziali differenze nella densità dei vasi sanguigni con conseguente differenze nell'esposizione agli ormoni o la presenza di linfonodi prominenti nel grasso inguinale-addominale, che possono esporre l'epitelio a diversi livelli di citochine. Anche se questo non è stato specificamente testato nei ratti, entrambi questi depositi sono sottocutanei e si sviluppano prima dell'adiposo viscerale37,38; nell'uomo adiposo, esistono maggiori differenze molecolari attraverso regioni adipose, e l'eterogeneità all'interno dei gruppi non è pienamente compresa38,39. Un ulteriore fattore da considerare è che le pastiglie di grasso bianche interscapulari e mammarie condividono Myf5- il lignaggio precursore mesenchico, ma differiscono nel numero di cellule derivate da quella popolazione40. Nonostante ciò, ci sono prove sufficienti per suggerire che il cuscinetto bianco interscapolare fornisce un microambiente simile a quello della ghiandola mammaria inferiore. L'epitelio mammario ricombinato con il proprio mesenchyme sviluppa un tipico modello mammario20,un effetto che è ben documentato negli studi sui roditori e supporta le osservazioni nel tessuto adiposo umano19,20,24,41,42. Soprattutto, i principali determinanti del successo del trapianto epiteliale mammario sia nei ratti che nei topi sono le dimensioni e l'integrità del grasso pad43,44. Utilizzando questa tecnica, molti studi di suscettibilità al cancro al seno hanno dimostrato che il tessuto mammario funzionale può essere generato efficacemente e regolarmente quando trapiantato nel piampone bianco interscapular18,30,45.
A causa dell'elevata compatibilità, l'escrescenza epiteliale è suscettibile di fattori mammari autonomi e non autonomi e risponderà alla manipolazione ormonale dei ratti riceventi, ad esempio, per promuovere la differenziazione o la secrezione funzionale del latte. Il trapianto di organoidi è spesso usato per studiare i fattori che influenzano lo sviluppo della ghiandola mammaria e/o la carcinogenesi. Gli organiidi possono essere ulteriormente digeriti in sospensioni a singola cellula per facilitare l'interpretazione quantitativa dei risultati. Mentre il metodo descritto in questo documento può essere adattato per innestare sezioni intatte di tessuto della ghiandola mammaria (come viene comunemente eseguito nei topi), le fasi di dissociazione enzimatica consentono di trarre conclusioni più dettagliate. Poiché il preclearing del grasso mammario endogeno nel ratto non è fattibile, questo è attualmente l'unico metodo che consente l'innesto dell'epitelio mammario del ratto.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal Cancer Center Di Hollings Cancer Center Support Grant P30 CA138313 finanziamenti pilota di ricerca dal National Institutes of Health(https://www.nih.gov/)e fondi dal Dipartimento di Patologia & Medicina di laboratorio presso la Medical University of South Carolina. Ringraziamo Marijne Smiths per aver registrato le dichiarazioni dell'intervista.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | - | - | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | - | - | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | - | - | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | - | - | |
| Clean animal cages for recovery | - | - | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | - | - | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | - | - | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | - | inactivation solution |
| Gauze | - | - | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | - | monodispersion mixture |
| Heating pads | - | - | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | - | - | |
| Incubator with orbital rotation | - | - | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | - | - | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | - | - | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | - | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | - | - | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | - | - | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | - | - | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | - | - | electric clippers, or other |
| Staining jars | - | - | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | - | - | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | - | - | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | - | - | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
References
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