Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60401
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Summary

Bu makalede, alıcı hayvanların interscapular beyaz yağ yastığı içine donör sıçan meme epitel hücreleri greft bir transplantasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme epitel gelişimi üzerindeki konak ve/veya donör etkilerini incelemek ve ön temizleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve böylece bu tekniğin kullanışlılığını genişletmek için kullanılabilir.

Abstract

1970'lerin başlarında araştırmacılar, meme epitel hücrelerini farelerin kesiler arası beyaz yağ yastığına başarıyla naklettiler. Transplantasyon teknikleri kullanılarak meme epitelinin aşılanması, ergen kemirgen konaktarafından sağlanan hormonal ortamdan yararlanır. Bu çalışmalar ideal meme bezi gelişimi üzerinde çeşitli biyolojik manipülasyonlar etkisini keşfetmek ve meme bezi biyolojisi birçok yönlerini incelemek için uygundur. Yaygın ama sınırlayıcı bir özellik, nakledilen epitel hücrelerinin çevredeki stromadan güçlü bir şekilde etkilenmesi ve endojen epitelile daha fazla rekabet etmiş olmasıdır; yerli meme dokusu kullanmak için, karın-inguinal beyaz yağ yastığı transplantasyon öncesi ev sahibi meme epitel kaldırmak için temizlenmelidir. Fare modeli organizma kullanırken önemli bir engel post-kesilmiş sıçanlarda gelişmekte olan meme ağacı temizleme verimli değildir. Bezsiz yağ pedleri içine nakledildiğinde, donör epitel hücreleri temizlenmiş konak yağ pedi yeniden doldurmak ve fonksiyonel bir meme bezi oluşturabilirsiniz. Interscapular yağ yastığı bu greftler için alternatif bir yerdir. Önemli bir avantajı, duktal yapılar henüz epitel büyümesini teşvik etmek için gerekli olan ve sıçan kolayca erişilebilir normal stroma sağlar olmasıdır. Bu tekniğin bir diğer önemli avantajı minimal invaziv olmasıdır, çünkü büyüyen endojen meme ağacını kaldırma ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, interscapular yağ yastığı aşılama için ayrı siteler için kullanılabilecek bir medial kan damarı içerir. Endojen bezleri bozulmamış kalır çünkü, Bu teknik de nakledilen bezi endojen meme bezi karşılaştırarak çalışmalar için kullanılabilir. Bu yazıda farelerin interscapular beyaz yağ yastığı içine meme epitel hücre nakli yöntemi açıklanmaktadır.

Introduction

Postnatal meme bezi gelişimi ve duktal morfogenez büyük ölçüde ergenlik başlangıcında hormonal sinyal etkilenir süreçlerdir. Farelerde ve sıçanlarda, meme bezi biyolojisinin yaygın olarak kullanılan model organizmalar, bu süreç yaş yaklaşık 3 hafta başlar, hızlı çoğalma ve farklılaşma olgun parankim oluşumuile sonuçlanır. Olgun meme bezi genişleme ve involution, erken20. Hiperproliferasyon ve kanser gelişimi bağlamında, meme bezi transplantasyon teknikleri 1950'lerde geliştirilmiş ve 1977 yılında Gould ve ark. tarafından katkıda kantitatif metodoloji ile geliştirilmiş2,3,4. Kemirgenlerde transplantasyon tekniğinin iyileştirilmesi, çeşitli tedavilerin ve genetik manipülasyonun normal meme bezi gelişimi ve hastalık durumları üzerindeki etkisini incelemek için hala yaygın olarak kullanılan normal meme bezi biyolojisinin anlaşılmasında önemli ilerlemelere katkıda bulunmuştur.

Birçok hipotez ler üretilmiş ve daha sonra meme bezi nakli kullanılarak test edilmiştir, ilk olarak DeOme ve ark. tarafından 19591. Birkaç on yıl boyunca deneyler tüm yağ pedi yeniden doldurmak için donör meme bezleri nden excised duktal doku eğilimi gösterdi5,6,7 ve meme bezi gelişiminin kritik bir bileşeni bu epitel yapılarda bulunduğunu belirtti. Farelerde daha sonra yapılan çalışmalar, tek bir meme kök hücresi temizlenmiş bir yağ yastığı yeniden doldurmak ve bazal ve luminal meme epitel hücrelerinin tek, ortak atasının keşfine katkıda bulundu gösterdi8,9,10. Bu sonuçlar doğrultusunda, bu transplantasyon plastisite sonucu multilineage-repopulating potansiyeli ile hücrelerin havuzu artırır, aşılanmış hücrelerin fonksiyonel bir memebezi7büyümeye izin,10,11,12,13olduğu ileri sürülmüştür. Daha da önemlisi, kemirgenlerde transplantasyon tekniklerinin kullanımı hücre kültürüne bağlı anormalliklerin14'ün sınırlarını aşar ve genellikle sadece birkaç hafta içinde sonuç verir.

Prosedür aslında farelerde preneoplastik lezyonlar bağlamında açıklanan iken, yakında sıçanlara genişletilmiş ve kanser duyarlılığı bir ölçüsü olarak çokluk kurmak için kanserojen tedavi ile birlikte kullanılan15, ama transplantasyon teknikleri popülaritesi her tür için genetik araçların geliştirilmesi izledi. Transplantasyon içeren fare çalışmaları birçok çeviri bulgular katkıda bulunmuş olsa da, sıçan meme bezinin parankim daha yakından insan benzer16,17 ve östrojen reseptörü-pozitif çalışma için farklı avantajlar sunuyor (ER +) meme kanseri. Meme tümörleri her iki türde de indükleyicidir, ancak hormon duyarlılığı ve gen ekspresyonu profilleri açısından farklılık gösterirler. Birincil bir fark sıçan meme tümörleri ifade ve yumurtalık ve hipofiz hormon reseptörlerinin işlevine bağlıdır, yani, östrojen ve progesteron (PR), insan meme kanseriluma benzer-A alt tipi. Nitekim, meme epitel hücre nakli, bu protokolde açıklandığı gibi, meme kanseri nde yer genetik varyantları incelemek ve meme epitel hücreleri üzerindeki etkilerihücresel özerkliğini belirlemek için kullanılmıştır18.

Tümör biyolojisine ek olarak, normal sıçan meme bezinin duktal epitel dallanma daha yüksek bir düzeyde sergiler ve fare daha stroma daha kalın bir tabaka ile çevrilidir. Meme epitelyal transplantasyon çalışmalarında stromanın önemi iyi belgelenmiştir. Meme epitel yağ stroma ile etkileşim gerekir, ve ideal olarak kendi mezenkim, karakteristik morfogenez geçmesiiçin 19,20. Alıcı meme beziiçine doku aşılama optimal bir ortam sağlar; ancak, endojen epitel varlığı sonuçları etkileyebilir. Endojen epitelin meme bezinin temizlenmesi genellikle fare transplantasyonu tahlillerinde yapılır ve endojen meme dokusunun cerrahi eksizyonu ve/veya meme ucunun çıkarılmasını gerektirir1,21,22. Mümkün olsa da, post-kesişen sıçanlarda meme epitel preclearing yaygın olarak gerçekleştirilen değildir, özellikle post-kesen sıçanlarda büyüyen meme ağacı temizleme etkisizliği nedeniyle. Vücudun başka bir yerinde yağ dokusu bölgeleri nakledilen meme epitel büyümesini destekleyebilir gösterilmiştir beri21,23,24, interscapular beyaz yağ yastığı içine doku aşılayarak sıçanlarda preclearing süreci kolayca önlenebilir.

Bu yazıda açıklanan transplantasyon yöntemi enzimatik olarak ayrıştırılmış meme bezi organoidlerinin (meme duktal epitel ve morfogenez yeteneğine sahip diğer hücre tipleri parçaları) veya laboratuvar sıçanlarının inbred, izojenik veya konjenik suşları interskapular yağ yastığı içine monodispersed hücrelerin enjeksiyonu içerir2. Interscapular yağ yastığı normalde meme dokusu yoksun olduğundan, endojen epitel önceden temizlemek için gerek kalmadan birden fazla transplantasyon siteleri için uygun bir ortam sağlar. Sonuç olarak, konak hayvanın endojen, abdominal-inguinal meme bezleri cerrahi manipülasyona tabi değildir, normal gelişir ve sonuçların yorumlanmasına engel olamaz. Ayrıca, bozulmamış meme bezleri memmary epitel gelişimi ve tümörigenez18,25konak karşı donör etkilerini değerlendirmek için karşılaştırma için kullanılabilir. Tek bir kök hücreden meme bezinin repopülasyonfareler için kullanılabilir olmasına rağmen, henüz sıçan için geliştirilmiş değil, özellikle sıçan meme kök hücreleri için seçmek için antikorların durumu eksikliği nedeniyle25,26,27. Buna rağmen, repopulating potansiyelini ölçmek için monodispersedilmiş meme epitel hücrelerinin nakli başarıyla yapılabilir, ve bu hücreler uygunçerçeve2,3,4aşılı zaman normal gelişecektir . Organoidler birçok amaç için iyi olsa da, monodispersed hücreler kantitatif uygulamalar için gereklidir, örneğin, iyonlaştırıcı radyasyon tedavisi28 aşağıdaki kanser inisiyasyonu için gerekli meme epitel hücrelerinin sayısını belirlemek için veya akış sitometrik olarak seçilmiş meme epitel hücre popülasyonlarının özelliklerini karşılaştırmak için29.

Bugüne kadar, burada açıklanan prosedür meme bezi gelişimi ve meme kanseri gelişimi altında yatan mekanizmaları çalışma genel bir amacı ile sıçanda meme bezi nakli gerçekleştirmek için en sağlam yöntemdir. Genellikle, donör ve / veya alıcı hayvanlar önce farklı değişkenlere maruz kalan, sırasında veya epitel nakli nden sonra. Örnekler kimyasal karsinogenez içeren tek gen çalışmaları içerir30, radyasyon28,31,32, konak / donör genom genetik manipülasyon18, ve hormonal manipülasyon12. Bu protokolde tanımlanan enzimatik ayrışmanın en önemli avantajı, akış sitometrisi, 3-B kültürü, gen düzenleme ve daha fazlasını içeren tamamlayıcı deneyler için epitel organoidleri veya monodispersi hücreleri izole etme fırsatıdır. Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları genetik mühendisliği ile donör ve / veya konak doku ek manipülasyon içerecektir. Örneğin, donör hücreler CRISPR-Cas9 gen düzenleme sistemi kullanılarak seçilen herhangi bir genomik lokusta genetik olarak ex vivo değiştirilebilir. Benzer şekilde, alıcı sıçanlar da genetik donör ve alıcı mühendislik genetik faktörler arasındaki etkileşimi incelemek için değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvanlar AAALAC onaylı bir tesiste barındı ve bakımını aldı ve bu protokolde açıklanan deneyler MUSC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Karşılıklı transplantasyonda kullanılacak hayvanlar, en az 6 nesil boyunca konjenikojenik durum tercih edilen veya backcrossed olan, inbred veya izojenik bir tür olmalıdır.

1. Hasat donör sıçan meme bezi epitel

  1. Transplantasyon için gerekli donör sıçan sayısını belirleyin.
    NOT: Genellikle, 1 donör sıçan (4 haftalık yaş) 4 alıcı hayvana transplantasyon için yeterli hücre sağlayabilir. Bu protokolün bazı uygulamaları ek sayıda hücre gerektirir ve toplam verimde gerginliğe özgü farklılıklar olabilir.
  2. Tüm malzemeleri etiketle ve cerrah için erişilebilir yerleşimi sağlamak(Tablo 1).
  3. Her kadın donör sıçan vücut ağırlığını kaydedin. Donör sıçanı tamamen anestezik veya ötenazi yapmak için kurumsal yönergeleri uygulayın. Parmak ucuna yanıt eksikliği ile anestezi derinliği ni kontrol edin.
  4. Hayvanı steril cerrahi alana taşıyın. Hayvanı sırtına yerleştirin ve tüm ventral yüzeyini %70 etanol ile püskürtün.
  5. Torasik, abdominal ve inguinal meme bezlerine erişim sağlayan sagittal, X şeklinde bir kesi yapın. Makas kullanarak donör sıçan tüm meme bezi dokusu nu sikiksiyon(Şekil 1). Tüm görünür lenf düğümlerini çıkarın.
  6. Meme dokusunu forceps kullanarak ayıklayın ve buz üzerinde 60 mm'lik etiketli bir tabağa yerleştirin. 60 mm'lik tabağa 500 μL serumsuz DMEM/F12 ortam ekleyin. Tamamen ıslak kalacak şekilde meme bezi dokusunun yerleşimini ayarlayın.
  7. İnce makas kullanarak meme dokusu kıyma. Bunu yapmak için, 1-2 mm3 boyutunda(Şekil 1C)doku kesmek. Tüm donör doku hasat edilene kadar bezi buz üzerinde tutun (60 dakikayı geçmeyin).
    NOT: Ek personel meme bezleri kıyma ve ayrıca cerrah doku ekstraksiyon ile devam ederken kollajenaz çözeltisi hazırlamak.

2. Ötenazi donörlerden beyin dokusu ayıklamak

  1. Dikkatli bir şekilde donör hayvanın vücut eğilimli bir pozisyonda yerleştirmek için ters çevirin. İğnelerle sabitle. Sprey baş ve üst sırt% 70 etanol ile.
  2. Kafatasının tabanını bulun ve oksipital konilerin altında bir kesi yapın. Derinin altına keskin makas yerleştirin ve başın kenarları da dahil olmak üzere kafatasından deriyi kesin.
  3. Kemik kesiciler veya güçlü makas kullanın orta hat boyunca kafatası kesmek için, oksipital frontal kemiklere kadar. Altta yatan beyin dokusunun tahrip önlemek için mümkün olduğunca yüzeysel ve açı yukarı bıçak tutun.
  4. Rongeurs veya güçlü forceps kullanarak uzak kemik soyma. Her iki tarafta kemik kırmak için beyincik lateral aracı ekleyin, kemik işitsel kanal açığa. Menenjitlerle olan bağlantılarını kes.
  5. Kavisli, ince uçlu forsepslerle beyni hafifçe kaldırın. Beyni folyo parçasına yerleştirin ve ağırlığı kaydedin ve hemen 15 mL'lik bir tüpe eşit miktarda (w:v) ortam ile buz üzerinde depolanan bir tüpe aktarın.
    1. İsteğe bağlı olarak, gerekirse nakil prosedüründe ek kullanım için hipofiz bezini (beynin altında bulunan) çıkarmak için ince uçlu forseps kullanın.
  6. Doku bozmak için mekanik bir homogenizer kullanın. Düşük hızda 10-15 s için beyin homojenize. Karışımı en az 1 dakika buz üzerinde oturup ve daha sonra tekrar homojenize edelim. Son karışım büyük parçalardan arındırıldığında homojenizasyon yeterlidir.
  7. Homojeni 100 μm'lik bir filtreden geçirerek filtreleyin. Kullanıma kadar (en az 4 saat) buz üzerinde filtrat tutun.

3. Meme bezi özlerinin sindirimi ve işlenmesi

  1. Belirtildiği gibi çözülme veya sıcak reaktifler (Tablo 1). Organoidler veya monodispersed hücreleri kurtarmak için uygun adımları izleyin.
  2. Her donör hayvan için 10 mL serumsuz sindirim ortamı (kollajenaz olmadan) hazırlayın(Ek Dosya 1).
    NOT: Kullanılan sindirim ortamının hacmi, varsa gruplanmış dokuya uyum sağlayacak şekilde ayarlanabilir (yukarı veya aşağı ölçeklenebilir).
    1. Organoidler için 3.3 atlamak.
    2. Monodispersed hücreler için, serumsuz kollajenaz sindirim ortamına ek olarak taze Monodispersiyon Karışımı ve İnaktivasyon Solüsyonu(Ek Dosya 2, Ek Dosya 3)hazırlayın. Adım 3.3'e geçin.
  3. Donörlerden tüm meme dokusu ayıklanmış ve kıyılmış olduğunda, sıcak kollajenaz enzimi ekleyin (veya oda sıcaklığında) sindirim ortamı(Ek Dosya 1). Ters çevirerek karıştırın.
  4. Kollajenaz sindirim ortamını 20 μm'lik bir filtreden geçirin. Sindirim için etiketli 50 mL tüplerde 10 mL filtreli ortam dağıtın.
  5. Her numune için yeni bir 1.000 μL pipet ucu kullanın ve her 60 mm çanak kıyma donör doku kolajenaz sindirim tüpü ne aktını transfer. 1.000 μL'lik bir ucun ucundan 1 cm kesin ve kullanmadan önce el ile cihaza yerleştirin. Kıymalı dokuyu 1-2 kez yukarı ve aşağı borulandırarak hafifçe karıştırın.
    NOT: Transfer sırasında dokuda pipet zorsa, 50 mL tüpten küçük miktarda kollajenaz sindirim ortamı kullanın ve sonra geri aktarın.
  6. Numuneleri sallayarak bir kuvözde yatay konuma yerleştirin ve numunelerin 37 °C, 200-220 rpm'de 1,5-2 saat sindirmesine izin verin.
    1. Organoidler için 3.7 atlamak.
    2. Monodispershücreler için sindirimin son 10 dakikası için karışıma DNase I (0.2 μg/mL) ekleyin. Daha önce olduğu gibi inkübül, güçlü sallayarak. Adım 3.7'ye geçin.
  7. Doku tamamen sindirildiğinde, 1200 x g (Şekil 1D)10 dk için soğuk santrifüj (4 °C) kullanarak süspansiyon pelet.
    NOT: Hücrelerin canlılığını artırmak için her adım arasında buz tüpleri tutun.
  8. Bir pelet oluşmuş olduğundan emin olun ve sonra dikkatle supernatant ve yağ tabakası dökün. Taze DMEM/F12 medyasında 10 mL'lik peleti yavaşça askıya alın.
  9. Yaklaşık 10 s için 68 x g'de kısaca döndürün. Hücrelerin net bir ayrımı yoksa dönüş uzunluğu (ancak hızı değil) artabilir. Devam etmeden önce peleti görsel olarak inceleyin (Şekil 1D).
  10. Küçük bir hacim geride bırakarak, dikkatle supernatant çıkarın. Organoidlerin veya monodispersi hücrelerin gerekli olup olmadığına bağlı olarak bir sonraki adıma geçin.
    NOT Pelet çok gevşek olacağından tüpte küçük bir hacimde ortam bırakmak önemlidir. Ortam artık hacmi yıkama adımları ile seyreltilir.
    1. Organoidler için 10 mL'lik bir DMEM/F12 ortamı daha ekleyin ve yıkama/döndürmeyi tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonra, filtreleme için DMEM/F12 media'nın daha küçük bir hacimde (1-2 mL) hücreleri yeniden askıya alın. Adım 3.11'e geçin.
    2. Monodispersedilmiş hücreler de %0.025 (w/v) Tripsin ve 6.8 mM EDTA ile önceden ısıtılmış HBSS'nin 2 mL'sinde çözünür. 37 °C'de 3-5 dk sindirin. Hemen etkinleştirin.
      1. Trypsin'i inaktive etmeyi durdurmak için %10 FBS ile 4 mL DMEM/F12 ekleyin.
      2. Hücreleri 270 x g'de 5 dk verin ve dmem/F12'de tekrar %10 FBS ile yeniden askıya alın. Hücreleri filtrelemek için adım 3.11'e geçin.
  11. Hücreleri yeni bir 50 mL tüpe yerleştirilen 40 μm'lik hücresüzsüz kullanarak filtreleyin. Hücreleri askıya almak için kullanılan aynı baz ortamının 1 mL'ini boruile ıslatarak süzgeci önceden ıslatın ve kanal parçaları/organoidleri toplamak için bir pipet kullanarak hücre süspansiyonundan filtreden geçirin.
    NOT: Tek, 4 haftalık donör bir sıçanın meme bezi dokusundan filtrelenmiş epitelin yaklaşık verimi 1 x 106 hücredir.
    1. Organoidler için, filtrat atın. Meme organoidleri hücre süzgeci sepet içinde kalacak ve daha küçük, istenmeyen hücreler ortadan kaldırılacak. Hücre süzgecini yeni bir 50 mL tüp üzerinden ters çevirin ve hücreleri toplamak için gerekli olan herhangi bir hacimle durulayın. Adım 3.12'ye geçin.
    2. Monodispersed hücreler için, hücre süzgeci atın ve meme epitel hücreleri filtre geçecek, çünkü filtrat tutmak, küçük stromal ve bağışıklık hücreleri ile birlikte. Sindirim/santrifüj için kullanılan tüpü %10 FBS ile dmem/F12 hacmi ile durulayın ve aynı hücresüzden geçirin. 5 dk. 1.200 x g santrifüj ile monodispersed hücreleri pelet.
      NOT: Askıya alınan hücreler sonraki uygulamalar için hazırdır.
  12. Darbe çözeltiyi döndürün ve bir sonraki adıma geçmeden önce bir hücre peletinin oluşumunu sağlayın. Gerekirse nabız tekrar döner.
  13. Dikkatle supernatant çıkarın. Küçük bir hacimde (1.000-2.000 μL DMEM/F12) hücreleri saymak için konsantre etmek için peleti yeniden askıya alın.
  14. Hücreleri sayın ve gerekirse seyreltin. Her hayvan için 20 μL DMEM/F12 media transplantasyonu için istenilen sayıda hücreyi yeniden askıya alın. Hücreleri her zaman buzda tut.
    NOT: Her greft bölgesi için çalışmanın son noktasına göre 1 x 105 - 1 x 106 hücre aralığında donör hücre sayıları gerekecektir. Örneğin, karsinogenez deneyleri genellikle diğer uygulamalara göre daha fazla sayıda nakledilen hücre gerektirir. Her türiçin gerekli hücre sayısı deneysel olarak belirlenmelidir. Bu protokolde tanımlanan prosedür, 3.16'da açıklandığı gibi beyin homojenate ile karıştırmadan önce greft yeri başına 20 μL medyada 250.000 donör hücresi kullanmaktadır.
  15. Diğer deneyler için gerekli olan hücrelerin aliquot(lar)ını hazırlayın (örn. FACS izolasyon3,26,27,30,33).
    1. Organoidler için 3.16.adıma geçin.
    2. Monodispers hücreler için, Trypan veya metilen mavisi boyama kullanarak canlı hücreleri ölçün ve sonra devam edin.
  16. Tüm nakil alıcıları için tek bir yığın donör malzeme hazırlayın. Hücre süspansiyonunun eşit hacimlilerini (20 μL) her transplantasyon bölgesi için %50 beyin homojeni (20°L) ile birleştirin.
    NOT: Her siteye saha başına toplam 40°L enjekte edilecektir, ancak atıklar için en az %25 ekstra hacim dahil edilmesi önerilir.
  17. Hemen transplantasyon veya daha sonra (potansiyel durdurma noktası) transplantasyon için hücreleri dondurmaya devam edin.
    NOT: Dondurulmuş hücreler bu protokol ile test edilmemiştir ve transplantasyon deneyleri için bir hayvan kohortu oluşturmadan önce optimizasyon gerektirir. Bu kuvvetle taze hücrelerin nakli için tavsiye edilir.

4. Transplantasyon prosedürü (alıcı sıçanlar 4-5 haftalık)

  1. Her alıcı sıçan tartmak ve prosedürde kullanılacak onaylı analjezik doğru dozu hesaplamak.
    NOT: Vücut ağırlıkları işlemden 24 saat önce ölçülebilir. Tıraş süresince her hayvanı dizginlemek veya kısaca anestezik etmek için kurumsal yönergeleri izleyin.
  2. Elektrikli makasları kullanarak her hayvanın cerrahi alanını tıraş edin. Kafatasının tabanını belirleyin ve vertebral sütunun başlangıcını başlatın. Omurganın yaklaşık üçte biri, sırtın üst torasik kısmında 3 cm x 2 cm'lik bir alanı tıraş eder.
    NOT: Tıraş, transplantasyon günü anestezi altında da yapılabilir, ancak steril alan dışında yapılmalıdır. Gerekli olana kadar fareyi ev kafesine geri getirin.
  3. Transplantasyon için gerekli tüm malzemeleri bulun (Tablo 1).
  4. Kullanmadan önce Laboratuvar Hayvan Anestezi Sistemini değerlendirin. Herhangi bir sıvı top up ve gerekli herhangi bir tank veya parçaları değiştirin. Anestezi odasına giden gaz hattının açık olduğundan ve tüm çevre hatlarının kapalı olduğundan emin olun, böylece isofluran anestezi ve oksijen odaya yerleştirildikten sonra hayvana serbestçe akabilir.
  5. Alıcı hayvanların vücut ısısını desteklemek için Sıcak ısıtma pedleri.
  6. Ameliyat için kullanılacak steril alanı oluşturun. Tablo 1'deaçıklandığı gibi malzemeleri düzenleyin.
  7. Kurumsal olarak onaylanmış hayvan bakım protokolünde belirtildiği gibi alıcı sıçanlara ameliyat öncesi analjezik uygulayın.
  8. Hamilton şırıngalarını steril DMEM/F12 ortamlarıyla yıkayın ve hücre kaybını önleyin. İğnenin şırınganın gövdesine sabitolduğundan emin olun, iğneyi sıvının içine yerleştirin ve pistonu geri çekin. Maksimum ses düzeyine doldurun. Pistonu bastırın ve içindekileri bir atık toplama tüpüne atın. 3-5 kez tekrarlayın.
  9. Donör malzemenin tüm hacmini (adım 3.16'da hazırlanmış) her durum için ayrı bir şırıngaya yükleyin (örn. kontrol, işlenmiş, vahşi tip, nakavt, vb.). İğneucunu sıvıya takın, pistonu geri çekin ve tüpteki hacim azaldıkça iğneyi karışımın yüzeyinin altında tutun.
    NOT: Her şırıngaya en az %10 ekstra hacim ekleyin. Kalan karışımı atmayın tüpü kapatın ve daha fazla ihtiyaç olması durumunda buzüzerinde tutun.
  10. Şırıngayı tamamen yüklendikten sonra ters çevirin ve iğnenin ucundaki hava kabarcıklarını çıkarmak için pistonuna hafifçe basın. Her şey hazır olduğunda bir sonraki adıma geçin.
    NOT: İğneucunun steril alan içinde bile başka bir yüzeye dokunmadığından emin olun. Bu hücrelerin canlılığını teşvik etmek için buz küçük bir kap üzerinde şırınga vücut dinlenmek için yararlıdır.
  11. Alıcı hayvanı anestezi odasına yerleştirin ve makineyi açın.
  12. Hayvan tamamen rahatladığında (odanın dokunmasına veya nazik hareketine tepki vermez), anesteziyi burun konisine yönlendirin ve hayvanı steril alana aktarın.
    NOT: Anestezisüresinin uzatılması sıçanlar tarafından iyi tolere edilmez. 10 dakika veya daha az her hayvan için prosedürü tamamlayın.
  13. Baş ın arkasına ve üst omurgaya ulaşılabilmesi için hayvanı (midesi üzerinde) yatkın bir konuma yerleştirin.
    NOT: Hayvan için her zaman yeterli ısı desteği sağlamak ve düzenli olarak sağlam bir ayak ucurması kullanarak anestezi derinliğini değerlendirmek.
  14. İsteğe bağlı olarak, gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik veteriner merhemuygulayın.
  15. Fazla tüyleri gidermek için taze tıraş lı bölgeyi temizleyin. Dairesel bir hareket kullanın ve cilde %70 etanol (veya kurumsal kurallara göre başka bir reaktif) uygulayın, ardından bir antiseptik (iyot gibi) uygulayın ve tekrarlayın. Hayvanın üzerine bir havlu örtü yerleştirin, böylece sadece tıraş alanı için bölge ortaya çıktı.
  16. Hayvan ın derin uyaranlara karşı tepkisiz kaldığından emin olun ve bir sonraki adıma geçin.
  17. Keskin bir cerrahi bıçak kullanarak küçük bir (2 cm) interscapular kesi yapın.
    NOT: Yağ yastığı derinin hemen altında yer almaktadır gibi kesim yüzeysel olmalıdır.
  18. Oryantasyon için medial kan damarını bulun (Şekil 2B).
  19. İnzonun bir tarafındaki deriyi forseps kullanarak kaldırın ve nakil yapılırken yağ yastığından uzak tutun(Şekil 2B). İğneyi greft bölgesine yerleştirin.
    1. İsteğe bağlı olarak, doku içinde iğne ucu hareket ve hücreleri toplamak için küçük bir cep oluşturmak. Küçük, tekrarlayan bir hareket kullanın. İğneyi çıkarmayın.
      NOT: Bu adım protokolü ilk kez kullananlar için önerilir. Interscapular yağ yastığı dokusu çok hassas olduğu gibi, bir cep oluştururken aşırı dikkatli kullanın.
  20. Hücre karışımının 40 μL'sini interskapular yağ yastığı dokusuna dikkatlice enjekte edin. İğneyi yavaşça çıkar.
  21. Yerinde doku tutun ve nakledilen hücrelerin 3-5 s yerleşmek için izin. Gerekirse forseps ek bir çift kullanın.
  22. İğneyi çıkar. İkinci nakil yerinde enjeksiyon işlemini (4.18-4.21 adımları) tekrarlayın.
    NOT: Bir donör grubundan epitel, cerrahın el hakimiyetinden kaynaklanan toplu etkileri önlemek için her hayvandaki yağ yastığının aynı tarafına veya alternatif kenarlara enjekte edilebilir.
  23. Yara klipleri veya dikişler kullanarak cerrahi yarakapatın ve sonra anestezi durdurun.
  24. Kurumsal olarak onaylanmış protokolde belirtildiği gibi postoperatif analjezik sağlayın.
  25. Hemen ısı desteği ile bir kurtarma kafesine hayvan taşıyın. Kesiden kanama veya nefes almada sorun gibi sıkıntı belirtileri için monitör.
    NOT: Hayvan 5-10 dakika içinde tamamen iyileşir.
  26. İsteğe bağlı olarak, transplantasyondan 3-4 hafta sonra alıcı sıçanlara kanserojen madde uygulayarak greft yerinde karsinogenez çalışmaları yapın.
    NOT: Tipik olarak sıçan meme kanserinezezisi 50-57 günlük kenlerde kimyasal kanserojen tedavi ile yapılır. Bu tedavi, greftli hücrelerin meme bezinin büyümesini başlatmak için yeterli zaman sağlamak için nakil ameliyatının yaşını (29-36 gün arasında yapılması gereken) belirler.

5. Epitel büyümenin değerlendirilmesi

  1. Günlük vajinal lavaj yoluyla farelerin estrus döngüsünü izlemek ve bir mikroskop slayt üzerinde sitoloji incelemek. Çalışmanın bitiş noktasından 8-12 gün önce başlayın. Tüm fareleri aynı sahnede kurban edin. Bu isteğe bağlı bir adımdır.
    NOT: Sıçan estrus döngüsü 4-5 gündür. Önceki döngülerden lavaj slaytlar karşılaştırma için kullanılabilir gibi hayvan 1-2 tam döngüleri geçmesine izin, yorumlama kolaylaştıracaktır.
  2. Kurban nakli alıcısı, naklinden 6-8 hafta sonra, kurumsal kurallara göre.
    NOT: Büyüme genellikle transplantasyondan 3-6 hafta sonra saptanabilir, ancak ek süre gerekebilir.
  3. Hayvanı yatkın bir pozisyonda yerleştirin ve vücudu %70 etanol ile temizleyin. Forseps ile deri kaldırın ve interscapular yağ yastığı ortaya çıkarmak için vertebral sütun boyunca bir kesi yapmak. Yağ yastığının büyük bir kısmı görünür olacak şekilde cildi dokudan ayırın.
  4. Interskapular yağ yastığında greft bölgelerini ayıran medial kan damarını belirleyin. Doku tek bir parça olarak tüm ped excise veya kan damarı boyunca kesilmiş ve ayrı ayrı yanları çıkarın.
  5. Tüm montaj için pozitif yüklü mikroskop slayt üzerine doku yerleştirin. Künt forseps 2 çift kullanın ve yavaşça slayt üzerinde orijinal konformasyon geri doku yayıldı.
    NOT: Sıçan meme dokusu son derece hassastır. Dokunun kenarları kendi altında kıvrılabilir. Doku slayta yapışana kadar (birkaç saniye) her zaman dikkatli bir şekilde tutun ve yerinde tutun.
  6. Tam montaj endojen abdominal-inguinal meme bezlerinin en az biri (oryantasyon için lenf düğümleri ile) karşılaştırma için.
  7. Doku defat için 7-10 gün boyunca% 70 etanol slaytlar yerleştirin. Doku kuruması değil sağlamak için gerekli sıklıkta etanol doldurmak.
  8. Şap-karmin lekesi hazırlayın ve doku yeterince opak olduğunda slaytları işlayın. Kullanmadan önce lekenin soğumasına izin verin (Ek Dosya 4).
    NOT: Leke fiksasyon ve rehidrasyon adımlarından bir gün önce hazırlanabilir. Çözelti 4 °C'de saklanabilir ve yeniden kullanım için sınırlı potansiyele sahiptir.
  9. % 25 buzul asetik asit slaytlar yerleştirerek doku düzeltmek : 60 dakika için% 75 etanol.
    1. Etanol konsantrasyonu azalan bir dizi 3 yıkar bir dizi doku rehydrate: 15 dakika için% 70 etanol, 5 dakika için% 50 etanol ve 5 dakika için dH2O.
  10. 4-8 gün boyunca şap karmin ile leke. Lekenin dokuya tamamen girip girmediğini belirlemek için her gün slaytların arkasını kontrol edin. Boyama tamamlandığında bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Bezin en kalın kısımları mor bir tona sahip olduğunda ve artık beyaz görünmediğinde boyama tamamlanır.
  11. Destain ve etanol artan konsantrasyonu bir dizi slaytlar aktararak doku dehydrate: 30 dakika için% 70 etanol, 30 dakika için% 95 etanol ve 30 dakika için% 100 etanol.
  12. Dokuyu temizlemek için 3+ gün boyunca susuz slaytları ksilene yerleştirin. Uzun süreli depolama için mineral yağa aktarın.
  13. Slaytlar temizlendikten sonra, analiz için slaytların görüntülerini elde etmek için düşük güçlü ışık mikroskobu veya yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf kullanın. Görüntü edinme parametrelerinin tüm slaytlar için tutarlı olduğundan emin olun.
    NOT: Epitel büyümesi açıkça ayırt edilebilir olmalıdır.
  14. Büyümenin varlığını ikili bir sonuç olarak ele alın.
  15. Elde edilen görüntüleri kullanarak greft bölgelerinin %50'sinde ≥1 meme büyümesi üreten ortalama nakledilen epitel hücrelerinin sayısını hesaplayın. Gerektiğinde diğer fiziksel özellikleri niteleme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Donör ve alıcı meme bezleri
Sıçan meme epitel hücrelerini organ nakli için izole etme ve hazırlama adımları Şekil 1A'dagösterilmiştir. 4 haftalık ken, donör sıçan Endojen meme bezi olgunlaşma başladı ve epitel alum karmin ile boyanmış tüm monte slaytlar üzerinde görüntülenebilir (Şekil 1B). Bu yaştaki bir donör sıçan, transplantasyon için yaklaşık 1 x 106 hücre sağlayacaktır. Toplanan donör doku miktarı veya sonraki kıyma yetersiz ise, kollajenaz sindirim sonrası hücrelerin verimi düşük olabilir. Bu nedenle, bağışçılardan mümkün olduğunca çok meme bezi dokusu toplamak önemlidir. Tam sindirilmiş meme bezi dokusu, süspansiyonda görünür doku parçaları olmayan yağlı bir görünüme sahip olmalıdır (Şekil 1C). Meme bezi dokusunun tek bir donörden tam olarak sindirimi, resimde gösterildiği gibi, meme organoidlerini içeren görünür bir peletin oluşmasına neden olmalıdır (Şekil 1D). Bir pelet görünmüyorsa, taht optimizasyonu gerektirebilir. Şekil 2'desıçan meme bezi ve interskapular yağ yastığı yerleri gösterilmiştir. Doku toplama ve transplantasyon sırasında biyolojik referans noktaları doğru bir şekilde tanımlanmadıkça sonuçlar yorumlanamaz (Şekil 2B). Bu tahsinte, interskapular beyaz yağ yastığı medial kan damarı biyolojik bir referans noktası olarak kullanılır.

Epitel büyümenin nitel ve nicel değerlendirmesi
Epitelin varlığı, yokluğu veya bolluğu deneyin başarısını ve deneysel değişkenlerle ilgili etkilerin özerkliğini belirlemek için değerlendirilebilir. İkincisi için, bazı çalışmalar karşılaştırma için konak endojen abdominal-inguinal meme bezi ile bütün monte slaytlar gerektirebilir. Bir ön önlem olarak, ışık mikroskobu ikili bir sonuç olarak epitel büyüme belgelemek için kullanılabilir. Bu veriler, greft reddinin donör veya alıcı değişkenlerine bağlı olduğu hipotezini test etmek için istatistiksel olarak analiz edilebilir. Bu faktörlerin her birinin 2 seviyesine sahip olduğu karşılıklı transplantasyon deneyi, örneğin wildtype (WT) vs nakavt (KO), hipotez testi için 4 nakil grubu oluşturur(Şekil 3A). Donör:alıcı genotip olarak ifade edilen nakil grupları şunlardır: WT:WT, WT:KO, KO:KO, KO:WT. Izojenik veya konjeniye yakın hayvanlar kullanıldığında greft reddi minördür ve nakil gruplarında eşit olarak görülür. Interskapular yağ yastığı içinde transplantasyon için birden fazla sitenin bir avantajı, 2 donör hücre tipi tek bir konakta değerlendirilebildiği için, gerekli alıcı hayvanların azaltılmasıdır. Ayrıca, her iki site de sıçan aynı sayıda kullanarak, daha yüksek bir insidansı hızında tek bir donör hücre tipi test etmek için kullanılabilir. Örnek olarak genotip kullanılarak Şekil 3B'degösterilmiştir.

Epitel büyüme de daha önce elde edildi slaytların görüntüleri kullanılarak analiz edilebilir. Burada açıklanan meme hücresi transplantasyon protokolü kullanılarak yapılan bir deneyde, her iki greft yerinde de epitel outgrowth içeren bir bütün monte edilmiş interskapular yağ yastığı örneği (olumlu sonuçlar olarak kaydedilmiştir) gösterilmiştir. Birçok örnek arasında interscapular yağ yastığı epitel eksikliği prosedür ile teknik bir sorun gösterebilir ve olumsuz bir sonuç olarak kabul edilir.

Karşılıklı transplantasyon deneylerinin sonucu, meme epitel hücrelerine özerk veya otonom olmayan etkileri ayırt etmek için daha fazla kullanılabilir. Bir etkinin meme epitel hücrelerindeki (hücre özerk) süreçler tarafından yönlendirildiği veya konak/mikroortamdan (otonom olmayan) etkilendiği hipotezini test etmek için, donör hücre fenotipinin konak (endojen) fenotipile uyumu iki dilli bir sonuç olarak ele alınmaktadır. Karsinogenez tahlilleri gibi bir örnekte, tümör insidansı ikili yanıt verileri olarak analiz edilebilir ve donör, konak veya donör-konak etkileşiminin nakil yerindeki tümör insidansı oranına önemli ölçüde katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için kullanılan lojistik regresyon analizi. Eğer etki donör epitelin in özelliklerinden kaynaklanıyorsa, ev sahibinin durumuna bakılmaksızın alıcı gruplar arasında benzer bir transplantasyon sonucu gözlemlenebilir. Donör epitel, konakçının genotip veya tedavisinin katkısı nedeniyle konakçıya endojen miş gibi gelişirse, etkisi otonom olmayabilir. Her iki durumda da donör epitel hücrelerinin konakçıyla (self:self) eşleştiği transplantasyon grupları kontrol ler olarak yorumedilmeli ve istatistiksel analizlerle desteklenmelidir.

Nakledilen epitel üzerinde otonom ve otonom olmayan etkilerin sonuçlarını göstermek için, yabani tip ve Cdkn1b nakavt sıçan meme epitel deneylerinin karşılıklı naklinden slaytlarla birlikte bir illüstrasyon(Şekil 4A)verilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları meme dışı hücre otonom etkilerini ilerisürmüştür 18 (Şekil 4B). İkili yanıt olarak sınıflandırılan karşılıklı transplantasyon sonuçları için, kategorik değişkenlere (örneğin, donör veya alıcı genotip) bağımlı olan sonucun (örn. epitel barındırmak için fenotip uyumu veya nicel tahlillerde başarılı büyüme) olasılığı, ana etkiler ve etkileşim terimleri için lojistik bir regresyon modeli oluşturarak test edilebilir.

Figure 1
Şekil 1: Donör meme bezlerinin hazırlanması. (A) Donör hayvanlardan meme bezi dokusu ayıklamak ve organoidleri transplantasyon için kurtarmak için prosedüre genel bakış. (B) 4 haftalık bir sıçanın tüm monte endojen abdominal-inguinal meme bezleri (nakil donörlerinin tipik yaş), şap karmin boyama sonra. 4 haftalık bir yaşta, meme epitel genişletme sürecinde, ama duktal ağaç tam olarak yağ yastığı nüfuz etmez, merkezi lenf düğümlerine yakınlık ile kanıtlandı. (C) Kıyılmış meme bezinin kıvamı, buz üzerinde 60 mm'lik bir tabakta doğrama (pembe) sonra, nemli tutmak için uygun miktarda DMEM/F12 ortamla gösterilir. Bitişik görüntüler kollajenaz Sindirim Medya bulamaç transfer sonra ve sindirim tamamlandığında, 90-120 dakika sonra kıyılmış epitel bir karşılaştırma sağlar. (D) Peletli epitel organoidler ve tabaka ayrımı santrifüj den sonra görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Doku toplama ve meme epitel hücre enjeksiyonu için sınırların belirlenmesi. (A) Doku toplama için sıçan meme bezlerinin yerleri gösterilir. Donör ve alıcılardan alınan endojen abdominal-inguinal meme bezlerinin yaklaşık yeri özetlenmiştir. (B) Tıraş ve yüzeysel bir kesi yapıldıktan sonra, bir nakil alıcısının beyaz interskapular yağ yastığı maruz kalır. Üst görüntü: medial kan damarı (sarı ok) kesi merkezinde görülebilir. Alt takim: kesiğin bir tarafındaki deri, medial kan damarına (sarı ok) göre, derinin altındaki IS yağ yastığının genişliğini göstermek için kaldırılır. Donör epitel ihyasına bu flepin altına yağ yastığına enjekte edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Karşılıklı transplantasyon şeması. (A) Karşılıklı transplantasyon için tipik deneysel tasarım, örnek olarak genotipler kullanılarak gösterilmiştir. Wildtype (WT) donör epiteline göre gen nakavt (KO) gibi tek bir deneysel değişkenin test edilmesi 4 transplantasyon alıcı grubu oluşturur. (B) 2 adet donör madde enjeksiyonu alan tek bir alıcı hayvan için örnek tasarım. Aşılama için birden fazla site, orta hat boyunca bir kan damarı varlığı nedeniyle interscapular beyaz yağ yastığı kullanırken erişilebilir. Yabani tip ve nakavt donör epitel (veya diğer test koşulları) ayrı preparatlar kan damarının sol ve sağ enjekte edilebilir. (C) Bir nakil alıcısından gelen temsili tüm bağlı IS yağ pedi dokusu (B)olarak sunulan örnekte olduğu gibi aynı yönde görüntülenir. Meme epitel büyümesi şap-karmin lekeli doku ile bütün monte slayt üzerinde transplantasyon iki yerinde görülebilir. Interskapular yağ yastığı transplantasyondan 6 hafta sonra tek parça olarak çıkarıldı. Epitel gelişimi için ek zaman gerekebilir ama aynı zamanda bireysel donör greftleri ayırt etmede aşırı büyüme ve zorluk kolaylaştırabilir. Ortak biyolojik eserler görülebilir: MS = kas, TP = nakledilen epitel, BF = kahverengi yağ dokusu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Meme hücresi otonom ve otonom olmayan sonuç analizi. (A) Donör epitelinin fenotipüzerinde otonom ve otonom olmayan etkilerinin önemli katkıları olduğunda gözlemlenebilen sonuçların simülasyonu. Bu örnekte, konaktan endojen abdominal-inguinal bezleri karşılaştırma olarak kullanılır. Donör epitel büyüme fenotip uyum, endojen bezi ile karşılaştırıldığında, bir referans olarak kullanılabilir, ancak sadece etkilerini belirlemek için kullanılmamalıdır. (B) Donör meme epitel iması, karşılıklı transplantasyon deneyinde 4 grup için endojen bezin görüntülerine bitişik olarak transplantasyon yerinde gösterilir. Tek bir genin nakavt sonrasında gözlenen meme epitel üzerinde non-özerk etkileri, Cdkn1b, konak mikroçevre gelişmekte olan sıçan meme bezi etkiler düşündüren18. Ölçek çubukları 5 mm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gerekli Adım Buz üzerindeki eşyalar Çözülmüş/Önceden ısıtılmış Cerrahın yanındaki eşyalar
1. Meme bezi epitelinin hazırlanması 60 mm çanak Steril cerrahi aletler
Aliquot of DMEM/F12 %70 Etanol
2. Donör beyin çıkarma 15 veya 50 mL tüp (yaklaşık 1-2 mL/donör) ortam Aliquot Steril alan içinde, beyin tartma dengesi
Her donör için 15 mL etiketlenmiş tüp, homojenizasyon için uygundur Folyo
Pipet ve uçları (1000 μL veya 5 mL serolojik pipetli elektronik)
Mekanik homogenizer
3. Donör bezlerinin enzimatik sindirimi Yıkıntılar için yeterli DMEM/F12 Serumsuz sindirim ortamı Laboratuvar ölçeği (g)
DNAse I Monodispersiyon Karışımı Kuluçka makinesi/çalkalayıcı
Inaktivasyon Çözümü Her donör için 50 mL tüp (etiketli)
Steril filtreleme kollajenaz sindirim ortamı için 10 mL (veya daha büyük) şırınga
20-40 μM filtreler
Önceden ıslak filtre(ler) için ortam Aliquot
Filtrelenmiş enzim çözeltisi toplamak için 50 mL tüp(ler)
Tek kullanımlık pipet uçları kesmek için steril makas
Supernatant toplamak için büyük bir beher, ya da vakum hattı aspirating için
4. Transplantasyon Donör epitel + beyin homojen karışımı Hamilton şırıngaları – donör genotip/durum başına 1
DMEM/F12'den asal şırıngalara Aliquot Ölçek
Steril cerrahi sarf malzemeleri (neşter/makas, çoklu forceps)
Yara klipleri/dikişleri
Gazlı bez
%70 etanol veya isopropanol
Beta-dine veya iyot
Analjezik
Alıcı hayvanlar için ısı desteği
Kağıt havluveya hassas görev mendilleri

Tablo 1: Her adımda önceden dikkate alınması gereken öğeler. Bu liste, bir deneme hazırlanırken başvuru olarak kullanılmak üzere tasarlanmıştır ve ayrıntılı olarak düşünülmemelidir. Reaktifler yalnızca isteğe bağlı adımların dahil edilmesine/hariç tutulmasına bağlı olarak protokolün belirli uygulamaları için gerekli olabilir. Herhangi bir denemede, yordam başlatıldıktan sonra bu öğelere gecikmeden erişilen öğeler olmalıdır.

Ek Dosya 1: SerumSuz Kollajenaz Sindirim Ortam Hazırlama. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosya 2: Monodispersiyon Karışım Hazırlama. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosya 3: Inaktivasyon Çözüm Hazırlama. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Dosya 4: Alum-Karmin Leke Hazırlama. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, sıçanlarla çalışmak için optimize edilmiş bir meme epitel hücre nakli tekniğini tanımlar. Donör sıçanlardan izole edilmiş meme epitel organoidleri (3-5 haftalık yaş) alıcı sıçanların interskapular beyaz yağ yastığına (ayrıca 3-5 haftalık) aşılanır. Sonuçlar 4-6 hafta sonra, aşılı dokuyu incelemek için ışık mikroskobu kullanılarak yorumlanabilir; ancak, tam bir deney uygulamadan önce transplantasyon ve kurban arasında en uygun süre belirlenmelidir. Çok az veya çok fazla zaman geçtiyse, sonuçlar ne yorumlanabilir ne de anlamlı olacaktır. Protokolü optimize etmek için, nakilden 6-8 hafta sonra küçük bir hayvan kümesindeki büyümeyi analiz edin. Nakledilen epitel mevcutsa, ancak gelişmemişse, süreyi arttırır. Greftler iyi gelişmiş ancak epitelin örtüşen özellikleri analizleri engelliyorsa, epitel büyümesi için hafta sayısını azaltmayı düşünün. Eğer süre kısaltılamıyorsa (örneğin, karsinogenez deneylerinde), sonuçlar bireysel olarak yorumlanamaz gibi, her iki transplantasyon bölgelerine de (medial kan damarının her iki tarafında birer tane) aynı tip donör epitelenjekte edilmesi tavsiye edilir. %100 kesinlik ile taraf. Herhangi bir etkileşim türünden (otokrin, parakrin) şüpheleniliyorsa, her iki transplantasyon yerine de aynı tip donör epitel enjekte edilen ek kontrol hayvanlarının dahil edilmesi önemle tavsiye edilir. Prosedürde kritik adımlar enzimatik sindirim sonrası donör hücrelerinin uygun niceliksel ve beyin homojen ile düzgün karıştırma içerir. Nakledilen hücre sayısının alıcı hayvanlar arasında tutarlı olduğundan emin olmak için bu adımlara ekstra özen gerekir. Ayrıca, enjeksiyon sırasında, aşılanmış doku karışımı interskapular yağ yastığı dışarı sızıntı olmadığından emin olun. 3. Deneyin son noktasında interscapular yağ yastığı excising. Tüm ped tek bir parça olarak kaldırılabilir, ancak interskapular yağ yastığının 2 tarafını ayırmayı seçerken dikkatli olunmalıdır, sadece medial kan damarını tanımladıktan sonra kesilmelidir. Büyümenin ortaya çıktığı tarafı belirlemek zor olabilir, özellikle de bir greft diğerine aşırı büyümüşse, bu da tek bir parça olarak çıkarılmasını daha ideal hale getirir.

Prosedürün ortak bir değişiklik alıcı sıçan25,29bir kanserojen tedavi eklenmesidir. Aşılanmış doku donör sıçan tarafından ele geçirildi karsinogenez yatkınlığını koruyabilir25, ya da, tersine, donör doku konak duyarlılık benimseyebilir30. Bu etkiler sadece transplantasyon yeri olarak interskapular yağ yastığı kullanılırken belirlenebilir, endojen meme bezleri bozulmamış kalır ve olumlu bir iç kontrol olarak işlev çünkü.

Transplantasyon için meme bezi organoidleri kullanılırken, epitel outgrowth yokluğu donör hücre hazırlama veya enjeksiyon prosedürü ile ilgili sorunlar nedeniyle olabilir. Greft reddi de alıcı ve donör zorlanma konjenik olmadığında oluşabilir, konak bir bağışıklık yanıtı neden. Bu gibi durumlarda, alıcı bağışıklık sistemi olmayan kendini olarak donör doku tanır, bir bağışıklık yanıtı başlatır, ve aşılanmış doku büyümek için başarısız olur. Donör ve alıcı farklı genetik geçmişe sahip olduğunda greft yetmezliği riskini azaltmak için, en az 6, ve ideal olarak, 10'dan fazla nesil backcrossing sonuç yorumunu etkileyebilecek zorlukları önlemek için tavsiye edilir. 6 backcross nesiller, en greftler dışarı büyüyecek, ama bir azınlık hala başarısız olabilir. Greft yetmezliğinin nedeni olarak donör hücre hazırlama sorunu olduğunda, enzimatik sindirimin çok sert olup olmadığını, hücrelerin çok yüksek te veya çok düşük sıcaklıklarda tutulup tutulmadığını, kontaminasyon kaynaklarını, tahsin için kullanılan donör hücre sayılarının optimizasyonu hücre canlılığını ve büyümesini etkileyen diğer protokol sapmaları.

Tek meme kök hücreleri fonksiyonel bir meme bezi yeniden mümkün olmak için fare gösterilmiştir, hormonal destek eklenmesi birincil sonuç için gerekli olmadığını gösteren. Beyin homojenate eklenmesi önemli ölçüde donör hücreler için yapısal bir matris olarak hizmet veren ve göç nakli reddi3,34,35,36riskini azaltarak transplantasyon sonucunu artırır. Beyin homojenile kombine edildiğinde, transplantasyon için gerekli meme epitel hücrelerinin minimum sayısı alternatifleri ile karşılaştırıldığında, 10 kat daha fazla azalır3. Daha da önemlisi, sinjenezik beyin homojenkarışımının nakledilen epitelin fenotipini etkilediği gösterilmemiştir ve 40 yılı aşkın bir süredir meme kanserinogenezde tutarlı sonuçlar ve duyarlılık çalışmalarında ortaya çıkmıştır.

Bazı interscapular yağ yastığı anatomik ayrımlar nedeniyle endojen meme yağ yastığı temsilcisi olmadığını iddia edebilir: kahverengi yağ dokusu na IS yağ yastığı yakınlığı, hormonlara maruz kalma farklılıkları veya inguinal abdominal-yağ yastığı belirgin lenf düğümlerinin varlığı ile sonuçlanan kan damarı yoğunluğu potansiyel farklılıklar, hangi cytokines farklı düzeylerde epitel maruz bırakabilir. Bu özellikle sıçanlarda test edilmemiş olmasına rağmen, bu depoların her ikisi de deri altı ve visseral yağlanma önce geliştirmek37,38; insan yağ, daha fazla moleküler farklılıklar yağ bölgeleri arasında var ve gruplar içinde heterojenlik tam olarak anlaşılamamıştır38,39. Dikkate alınması gereken ek bir faktör beyaz interscapular ve meme yağ pedleri myf5+ mezenkimal öncül soy paylaşmak, ancak bu popülasyon dan elde edilen hücrelerin sayısı farklı40. Bununla birlikte, beyaz interskapular yağ yastığı alt meme bezi benzer bir mikroortam sağlar önermek için yeterli kanıt vardır. Meme epitel kendi mezenkim ile yeniden biraraya tipik bir meme deseni geliştirir20, kemirgen çalışmalarda iyi belge bir etki ve insan yağ dokusu19gözlemleri destekler,20,24,41,42. Her şeyden önce, hem sıçan larda hem de farelerde meme epitel nakli başarısının birincil belirleyicileri yağ yastığının büyüklüğü vebütünlüğü43,44. Bu tekniği kullanarak, birçok meme kanseri duyarlılık çalışmaları fonksiyonel meme dokusu etkili ve rutin beyaz interskapular yağ yastığıiçinenakledilen oluşturulan olabileceğini kanıtlamıştır18 ,30,45.

Yüksek uyumluluk nedeniyle, epitel outgrowth meme hücre özerk ve non-özerk faktörlere münferit ve alıcı sıçanların hormonal manipülasyon yanıt verecek, örneğin, farklılaşma veya süt fonksiyonel salgılanmasını teşvik etmek. Organoidlerin nakli genellikle meme bezi gelişimini ve/veya karsinogenezi etkileyen faktörleri incelemek için kullanılır. Organoidler sonuçların nicel yorumlanmasını kolaylaştırmak için tek hücresüspansiyonlarına daha fazla sindirilebilir. Bu yazıda açıklanan yöntem meme bezi dokusunun bozulmamış kısımlarına uyarlanabilse de (farelerde yaygın olarak yapıldığı gibi), enzimatik ayrışma adımları daha ayrıntılı sonuçlar almasına olanak sağlar. Sıçanda endojen meme yağ yastığı preclearing mümkün olmadığından, bu şu anda sıçan meme epitel aşılama için izin veren tek yöntemdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Hollings Kanser Merkezi Destek Hibe P30 CA138313 ulusal Sağlık Enstitüleri pilot araştırma fonu tarafından finanse edilmiştir(https://www.nih.gov/), ve Güney Carolina Tıp Üniversitesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü fonları. Marijne Smiths'e röportaj açıklamalarını kaydettiği için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µM syringe filters Fisher Scientific 09-715G sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) Fisher Scientific 05-408-129 containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers Corning 431752 filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles Hamilton 81001 & 90525 For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette - - transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube Falcon (Corning) 352196 brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers Corning 431750 filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes Fisher Scientific 05-539-6 for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes Thermo Scientific 130181 for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate Sigma-Aldrich 243361/237086 staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use - - follow institutional protocol
Beta-dine or iodine - -
Borosilicate glass culture tube for homogenization Fisher Scientific 14-961-26 for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine Sigma-Aldrich C6152/1022 staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus - -
Clean animal cages for recovery - - follow institutional protocol
Collagenase Type 3 Worthington Biochemical Corp. LS004183 enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water - - for chemical solutions
DMEM/F12 GIBCO 11320033 for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA - - monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2705/2701 mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone - inactivation solution
Gauze - -
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-212 use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS GIBCO - monodispersion mixture
Heating pads - - follow institutional protocol
Ice buckets (x2) - -
Incubator with orbital rotation - - must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia - - follow institutional protocol
Light microscope or digital camera - - visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer Fisher Scientific - TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure Sigma-Aldrich/ ACROS Organics 8042-47-5 long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer - - follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes - -
Positively-charged microscope slides Thermo Scientific P4981-001 mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic - - Institutional protocol
Scale body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver - - electric clippers, or other
Staining jars - - minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes IMCO 4410-IMC used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) - - autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater) - - for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin Worthington monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) - -
Wound clip applier, clips, and removal tool Fine Science Tools 12020-00 Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 clearing mammary gland whole mount slides after staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343 (1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173 (1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7 (2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634 (1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002 (2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).

Tags

Kanser Araştırma Sayı 157 sıçan meme bezi epitel nakli monodispersed hücreleri nicelik meme bezi gelişimi meme kanseri karsinom greft
Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shunkwiler, L. B., Haag, J. D.,… More

Shunkwiler, L. B., Haag, J. D., Gould, M. N., Smits, B. M. G. Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad. J. Vis. Exp. (157), e60401, doi:10.3791/60401 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter