Profilering af Ubiquitin og Ubiquitin-lignende afhængige posttranslationelle ændringer og identificering af væsentlige ændringer

Summary

Denne protokol tager sigte på at etablere ubiquitin (UB) og ubiquitin-Likes (Ubls) specifikke proteomer med henblik på at identificere ændringer af denne form for post-translationelle modifikationer (PTMs), forbundet med en bestemt tilstand, såsom en behandling eller en fænotype.

Abstract

Ubiquitin (UB) og ubiquitin-lignende (UBL) afhængige post-translationelle modifikationer af proteiner spiller grundlæggende biologiske regulerings roller i cellen ved at kontrollere protein stabilitet, aktivitet, interaktioner og intracellulær lokalisering. De gør det muligt for cellen at reagere på signaler og tilpasse sig ændringer i dens miljø. Ændringer inden for disse mekanismer kan føre til alvorlige patologiske situationer, såsom neurodegenerative sygdomme og kræft. Formålet med den teknik, der er beskrevet her, er at etablere UB/ubls afhængige PTMs-profiler, hurtigt og præcist, fra dyrkede cellelinjer. Sammenligningen af forskellige profiler opnået fra forskellige betingelser gør det muligt at identificere specifikke ændringer, såsom dem, der er fremkaldt af en behandling f. eks. Lentiviral medieret celle transduktion udføres for at skabe stabile cellelinjer, der udtrykker en to-Tags (6His og flag) version af modifikatoren (ubiquitin eller en UBL såsom SUMO1 eller Nedd8). Disse mærker tillader rensning af ubiquitin og derfor af allestedsnærværende proteiner fra cellerne. Dette gøres gennem en to-trins rensningsproces: den første er udført i Denaturerings betingelser ved hjælp af 6His tag, og den anden i indfødte forhold ved hjælp af flaget tag. Dette fører til en meget specifik og ren isolering af modificerede proteiner, som efterfølgende identificeres og semi-kvantificeres ved væskekromatografi efterfulgt af tandem massespektrometri (LC-MS/MS) teknologi. Easy Informatik analyse af MS data ved hjælp af Excel-software gør det muligt at etablere PTM profiler ved at eliminere baggrunds signaler. Disse profiler sammenlignes mellem hver betingelse for at identificere specifikke ændringer, som derefter vil blive undersøgt mere specifikt, begyndende med deres validering af standard biokemiske teknikker.

Introduction

Den metode, der foreslås her, er dedikeret til at studere PTMs medieret af ubiquitin familiemedlemmer fra dyrkede pattedyrceller for at identificere potentielle ændringer i forbindelse med en bestemt tilstand (behandling, differentiering, osv.). PTMs repræsenterer det sidste trin i reguleringen af proteiner ' funktioner¹. Faktisk, når fremstillet af translationelle maskiner, de fleste, hvis ikke alle proteiner gennemgår forskellige former for PTMs at moduere deres aktivitet, molekylære interaktioner, og intracellulære placering¹. Blandt de overflod af PTMs er dem, medieret af ubiquitin-familien af proteiner, ubiquitin selv og alle ubiquitin-Likes, har potentiale til at regulere alle intracellulære eller delvist cytoplasmiske proteiner². Fordi de selv er proteiner, kan de konjugeres til hinanden og danne homogene og heterogene kæder af forskellige topologier, der hver er forbundet med specifikke reguleringsfunktioner². Værktøjer er nødvendige for at forsøge at dechifrere og forstå dette komplekse maskineri. Mange tilgange blev udviklet i hele verden, har deres egne fordele og ulemper, og her foreslår vi en med høj ydeevne egnet til dyrkede celler.

Den største fordel ved denne metode er dens nøjagtighed. Faktisk er renheden af isolerede modificerede proteiner stærkt forbedret ved kombinatorisk brug af de to Tags (6his og flag) og de to trin-procedure, og derfor er det meget mere selektiv end et enkelt tag fusion UB/UBL^3,4. Tilstedeværelsen af 6His-mærket muliggør et første rensningstrin i en fuldt Denaturerings tilstand og undgår derved enhver samtidig rensning af proteiner, der indeholder ubiquitin-bindings domæner eller andre proteiner, som binder sig til de allestedsnærværende. Dette er et teknisk problem stødt på flere andre tilgange baseret på affinitet rensning af allestedsnærværende proteomer ved hjælp af enten specifikke antistoffer⁵ eller tandem ubiquitin bindende elementer (rør)⁶. Vigtigere, denne teknik er ikke partisk til fordel for rensning af en bestemt type af allestedsnærværende, som det kunne være tilfældet for nogle andre tilgange, da både mono og forskellige former for polyubiquitinationer blev identificeret⁷. Derfor vil en ændring af allestedsnærværende, når den er fundet, skulle undersøgt nærmere ved standard biokemiske tilgange for at identificere den nøjagtige form for allestedsnærværende.

Endelig, en anden teknisk fordel ved denne protokol er brugen af lentivira, der nemt og hurtigt skaber stabile udtrykker cellelinjer med et rimeligt niveau af udtryk for Tagged modifikator uden at forstyrre den normale cellulære adfærd.

Der henviser til, at en vigtig rolle for allestedsnærværende er at målrette proteiner mod proteasomal nedbrydning, er det nu kendt, at det har mange andre regulerende egenskaber for potentielt mest intracellulære eller delvist intracellulære proteiner¹. Antallet af disse funktioner forstærkes yderligere af eksistensen af mange ubiquitin som proteiner, der danner en familie af proteiner regulerer næsten hver celle mekanismer¹. Deres ændringer kan have drastiske konsekvenser for cellebiologi og kan føre eller deltage i patologiske situationer⁸, såsom kræft⁹. Derfor, værktøjer er nødvendige for at udforske dette store landskab og identificere de ændringer, der er forbundet med en patologisk tilstand, som kunne tjene som nye terapeutiske mål.

Denne protokol er dedikeret til celler i kultur, da de skal transduceres til at udtrykke eksogene Tagged UB/UBL. Når de er oprettet, kan disse stabile cellelinjer bruges til at generere UBL profiler fra kultur i 2D eller 3D eller xenografts, og derved forlænge horisonten for de forskellige eksperimentelle modeller, der kan anvendes til at studere PTMs profiler.

Protocol

1. generering af stabile cellelinjer, som udtrykker 6His-flaget-UBL

Bemærk: Co-transfection af HEK-293T celler med pCCL-6HF-UBL, pVSVG og Delta-Helper.

1. Dag 0: frø 293T celler i en 6-brønd plade for at opnå 50-70% sammenløbet dagen efter.
2. Dag 1: Co-transfect 50-70% flydende-celler med en blanding af 1 μg pccl-6hf-UBL eller pccl-gfp, 1 μg pvsvg og 1 μg Delta-Helper vektorer, ved hjælp af et transfektering reagens og protokol for lentivirus produktion. Efter 6 timer af transfection skiftes mediet til et nyt, der svarer til de celler, der skal transduceret. Frø cellerne, der skal transduces i en 6 brønd plade for at opnå en 10-20% sammenløbet dagen efter (dagen for start af transduktion).
3. Dag 2:24 h efter transfection, genvinde mediet indeholdende lentiviral partikler og filter ved hjælp af 0,45 μm filtre. Hvis det er nødvendigt, tilsættes frisk medium på dette tidspunkt for at producere en anden batch af lentivira. Udskift det medium af celler, der skal transduceret (10-20% sammenløbet) med den ene, der indeholder lentivira.
   Bemærk: Lentiviral medium kan opbevares ved + 4 °C i flere dage før transduktion eller opbevares ved-80 °C i måneder.
4. Inkubér cellerne med lentivira mellem 24 timer og 72 h i en standard inkubator (37 °C, 5% CO₂), og skift derefter mediet for frisk standard. Hvis det er muligt, skal du kontrollere GFP-udtryk ved hjælp af et inverteret fluorescerende mikroskop for at evaluere effektiviteten af transduktion: procentvise celler og det relative udtryksniveau pr. celle. Hvis der ikke registreres nogen fluorescens, skal du vente i yderligere 2-3 dage, da udtrykket kan tage længere tid, afhængigt af den celletype, som skal transduceret.
5. Hvis GFP-kontrol er positiv, skal du dyrke alle celler, indtil du har nok til at udføre en udtryks kontrol af 6HF-UBL ved immunofluorescens og Western blot ved hjælp af anti-flag antistof.

2. dobbelt rensning af modificerede proteiner

Bemærk: buffer 1:6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M na₂HPO₄/Nah₂PO₄, pH 8,0, 0,5% Triton X-100.
Buffer 2:50 mM NaH₂po₄, 150 mm NaCl, 1% Tween20, 5% glycerol, pH 8,0.
Buffer 3:100 mM NH₄HCO₃, pH 8,0.

1. Celle lysis: når du er klar, skal du vaske kultur skåle mindst én gang med fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved stuetemperatur (RT) og fortsætte til cellelyse eller, alternativt, flash fryse i væske N₂ og opbevares ved-80 °c. Til lysis tilsættes 2 mL buffer 1 pr. 15 cm skål ved RT. Brug en celle skraber til at genvinde alle lysater i 50 mL koniske centrifugeglas (endelig volumen ca. 20 mL).
2. Soniker lysaterne tre gange i 30 s adskilt af en 1 min pause.
3. Centrifugeres de sonilerede lysater ved 15.000 x g i 15 minutter.
4. Supernatanten overføres til et nyt rør ved hjælp af en celle-si (40 μm).
5. Bestemme prøvernes koncentration og om nødvendigt justere for at opnå den samme mængde proteiner og samme volumen. Brug en samlet mængde protein mellem 50 og 100 mg (10 retter med 15 cm diameter for MiaPaCa-2 celler).
6. Tilsæt ni^{2 +}-NTA perler, ved hjælp af 2 μl perler pr 1 mg protein.
7. Drej ved 30 rpm under 2,5 h ved RT.
8. Pellet perlerne på 500 x g i 5 min.
9. Perlerne vaskes med 1 mL buffer 1, der overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, hvorefter rørene overføres på is. Udfør alle de næste trin på is eller ved 4 °C.
10. Vask to gange med 1 mL iskold buffer 2 indeholdende 10 mM imidazol.
11. For at eluere bundne proteiner tilsættes 600 μL buffer 2 indeholdende 250 mM imidazol og roterer i 2 timer ved 4 °C.
12. Pellet perlerne ved centrifugering ved 500 x g i 1 min. Overfør Supernatanterne til nye, forkølede 1,5 ml rør og tilsæt 50 μl anti-flag m2 antistof konjugerede perler.
13. Roter ved 30 rpm for 2,5 h ved 4 °C, og vask derefter 2 gange med 500 μL buffer 2 og derefter 2 gange med 500 μL buffer 3.
14. Til den endelige eluering tilsættes 100 μL buffer 3 med et flag peptid ved 0,1 μg/μL og roterer ved 4 °C for 1,5 h.
15. Centrifuge ved 500 x g i 1 min. og Overfør Supernatanterne til nye forkølede rør.
16. Tag 10% (10 μL) til at indlæse på SDS-side og udføre en sølvfarvning af gelen for at kontrollere rensnings kvaliteten. Hvis rensningen ser godt ud, analysere 90% efterladt af LC-MS/MS.

3. behandling af massespektrometri data til at generere profiler af UB/Ubls PTMs og til at identificere væsentlige forskelle mellem dem

Bemærk: resultaterne fra MS Analysis indeholder mange oplysninger, herunder det samlede antal peptider samt peak Area værdier (gennemsnit af TOP 3 peptid område¹⁰) for hvert protein, der er identificeret i hver prøver. Disse data kan behandles ved hjælp af enten peptidtælle numrene eller peak Area-værdierne eller begge dele. Til beregning med peak områder, fordi disse værdier er normalt i intervallet 10⁶, er det nødvendigt at opdele dem ved denne ordre, før du anvender de samme formler som nedenfor. De opnåede resultater med begge metoder til optælling bør vise en stærk sammenhæng, som det normalt gør. For hvert identificeret protein, brug følgende formler, hvor:
v1 -peptider værdier i ikke-behandlet ubiquitin-prøve (f. eks. UB-Drug)
v2 -peptider-værdier i Gemcitabin-behandlet ubiquitin-prøve (f. eks. UB + lægemiddel)
K1 peptider værdier i ikke-behandlet kontrol gfp-prøve (f. eks. gfp-lægemiddel)
K2 peptider-værdier i Gemcitabin-behandlet Control gfp-prøve (f. eks. gfp +-lægemiddel).

1. Normalisering: normaliserer værdier mellem stof behandlede celler og ubehandlede celler for Ubiquitin og GFP ved hjælp af følgende formler. Normaliseret v = V og normaliseret k = K.
   V1 = v1. (for v1 + version v2)/(2. nr. v1); V2 = v2. (er v1 + version v2)/(2. version v2)
   K1 = K1. (nr. K1 + en K2)/(2. nr. K1); K2 = K2. (nr. K1 + en K2)/(2. nr. K2)
2. Fjernelse af baggrund: ved hjælp af følgende formler trækkes værdier i kontrolprøve (GFP) fra værdier i ubiquitin-prøven for at opnå specifikke værdier (V ' 1 og V ' 2) for hvert identificeret protein under begge forhold.
   V ' 1 = v1-K1, hvis v1-K1 ≥ 0; V ' 1 = 0 Hvis v1-K1 < 0
   V ' 2 = v2-K2, hvis v2-K2 ≥ 0; V ' 2 = 0 Hvis v2-K2 < 0
3. Variation (var) af allestedsnærværende. For at opnå en score (mellem-100 og + 100) for positive og negative variationer af PTMs induceret af et lægemiddel, skal du bruge følgende formel, hvor forskellen mellem specifikke værdier af behandlede og ubehandlede prøver divideres med summen af alle værdier, herunder dem i kontrol (til at straffe proteiner også identificeret i kontrol GFP), og multiplicere med 100.
   Var = (V'2-V ' 1)/(v1 + K1 + v2 + K2) * 100; -100 < var < 100
   Variationer under-50 (undertrykkelse af PTM) eller over 50 (induktion af PTM) betragtes sædvanligvis som signifikante.
4. Tillid (conf). Brug følgende formel til at opnå en tillids værdi på mellem 0 og 100%:
   Conf = ((v1 + v2)²/(1 + v1 + v2 + K1 + K2)²) * 100-100/(1 + V ' 1 + v ' 2); = 0 Hvis < 0
   Værdier over 50 er normalt anses for at være sikker.
5. For at opnå en pænere fordeling af induktions-/undertrykkelses værdier og for at overveje både variation og konfidensparametre skal du multiplicere var og conf -værdier ved hjælp af følgende formel, hvor V var og C conf
   = SI (v2 > 0;((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6);-((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6))
   Bemærk: da peak Area værdier er normalt mere nøjagtige end peptid optælling, er det muligt at bruge specifik software, der er dedikeret til fortolkningen af denne form for data såsom Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), efter anbefalinger af brug.

Representative Results

Transduktion af kultur pattedyrceller til at skabe GFP og 6HF-UB udtrykker celler
For at producere lentivira, som vil blive brugt senere til at transduce miapaca-2 celler, 70% flydende hek-293t celler er co-transficeret med en tilsvarende mængde af de tre vektorer, pccl-6hf-ubiquitin eller gfp/Delta-Helper/pvsvg. Efter 24 timers produktion opsamles det medium, der indeholder lentiviral partikler, og filtreres. Det er muligt på dette tidspunkt at kontrollere effektiviteten af transfektering ved at kontrollere den grønne fluorescens af gfp udtrykker 293t celler på et inverteret mikroskop. Det bør være tæt på 100% af cellerne. MiaPaCa-2 celler inkuberet med lentiviral supernatanten i 1 til 3 dage. Effekten af lentiviral transduktion kontrolleres først ved at se på GFP-fluorescensen af GFP-transducerede celler (figur 1A øverste panel). GFP-udtryks niveauet kan variere fra en celle til en anden, men 100% af dem skal være fluorescerende. Når denne kontrol er udført, skal udtrykket af flag-ubiquitin også kontrolleres. Dette gøres ved immunofluorescens farvning ved hjælp af et anti-flag antistof (sædvanligvis m2 monoklonalt) (figur 1A lavere panel). Dette vil vise procentdelen af transducerede celler, som bør være 100% for at sikre et stabilt udtryk over fremtidige passager af cellekultur. For at kontrollere ekspressions niveauet for eksogene flag-ubiquitin analyseres lysater fra transducerede celler med SDS-side efterfulgt af Western blot med anti-flag antistof (figur 1B). Begge cellelinjer kan fryses.

To trin rensning og kontrol ved SDS side og sølvfarvning
Når de stabile udtrykker cellelinjer er blevet valideret, forstærkes både GFP og 6HF-ubiquitin celler, indtil der opnås nok materiale for at fortsætte med to-trins rensning. Det anbefales at holde en sikkerhedskopi af disse cellelinjer som frosset bestand i flydende kvælstof for at være i stand til at tø dem, når det er nødvendigt. 36 h før behandling behandles halvdelen af cellerne (halvdelen GFP og halv 6HF-Ubiquitin) med 10 μM Gemcitabin. Når de er klar, renses allestedsnærværende proteiner fra 6HF-ubiquitin og fra GFP-kontrol celler ved hjælp af to-trins rensnings protokol (figur 2A). 10% af den endelige eluering anvendes til at kontrollere mængden og integriteten af renset materiale ved SDS-side og sølvfarvning af gelen (figur 2B). Molekylvægt markører kan anvendes til at estimere mængden af rensede allestedsnærværende proteiner. Alternativt kan en kendt mængde BSA eller andet protein læsses i en linje af gelen for at hjælpe med at kvantificere de rensede proteiner. Når denne verifikation er udført, analyseres de resterende 90% af prøverne ved væskekromatografi koblet til tandem massespektrometri for at muliggøre identifikation og semi kvantitering af rensede proteiner.

Identifikation af allestedsnærværende proteiner efter baggrund (GFP-prøver) subtraktion
Data fra LC-MS/MS-analyse af prøverne giver navne og kvantifikationer (spids arealer og antal observerede peptider) af hvert identificeret protein i GFP-og 6HF-UB-prøver. Proteinerne med den højeste kvantificering i ubiquitin-prøven sammenlignet med GFP-prøven er mest tilbøjelige til at være dem, der virkelig er allestedsnærværende og anvende formlerne beskrevet i metoderne ovenfor tillader deres klassificering ved at give en tillids score fra 0 til 100% . Proteiner, der identificeres med en score over 50%, betragtes som allestedsnærværende (figur 3a).

Dette trin, som dybest set fjerner baggrunds proteiner (GFP) fra ubiquitin prøver førte til identifikationen af 364 proteiner signifikant allestedsnærværende (figur 3B)⁷. Bemærk her, at proteiner identificeret med den højeste score er for det meste allerede kendt som vigtigste mål for allestedsnærværende, som viser effekten af denne oprensnings metode.

Derefter er det muligt at foretage en analyse af genudsætningen af disse allestedsnærværende proteiner for at fremhæve de biologiske processer, som de er involveret i (figur 3C), deres molekylære funktioner, deres cellulære rum, eller andre gener ontologi kategorisering. Det er interessant at sammenligne denne allestedsnærværende proteom med den fulde proteom af cellen, når det er muligt. Denne analyse afslører faktisk det reelle bidrag fra disse allestedsnærværende proteiner i specifikke processer såsom oversættelse eller proteolyse for eksempel (figur 3C).

Hovedformålet med denne form for eksperiment er at identificere ændringer inden for den allestedsnærværende proteom induceret af en behandling for eksempel, her Gemcitabin. Ved at sammenligne allestedsnærværende (det allestedsnærværende specifikke proteome) i behandlede og ubehandlede celler ved hjælp af den specifikke formel giver en værdi fra-100 (undertrykkelse af allestedsnærværende) til + 100 (induktion af allestedsnærværende). I betragtning af at kun værdierne under-50 eller derover + 50 er signifikante, er der identificeret i alt 73 inducerede allestedsnærværende og 29 undertrykte allestedsnærværende (figur 4a). GSEA analyse af disse ændringer af allestedsnærværende afslørede specifikke berigning i DNA reparationsprocesser eller celle cyklus, og vigtige variationer i oversættelse og RNA metaboliske processer (figur 4B). Dette resultat er meget logisk, da Gemcitabin er en base analog, der blokerer DNA-syntese og provokerer DNA-skader.

For at gå videre er det også interessant at bruge databaser med interagerende proteiner for at udforske og validere potentielle interagerende netværk dannet af Gemcitabin inducerede ændringer af allestedsnærværende (figur 5). Dette førte til identifikationen af funktionelle interagerende netværk, der var stærkt påvirket af øget eller nedsat allestedsnærværende af de involverede proteiner.

Endelig, blandt de ændrede allestedsnærværende, nogle kan omfatte proteiner af højeste interesse, på grund af deres kendte eller potentielle funktioner i henhold til litteratur. Derfor er et vigtigt skridt er at validere, at hvad der observeres af massespektrometri er reel og troværdig. PCNA var et af de mest over allestedsnærværende proteiner efter behandling med Gemcitabin, som blev påvist ved massespektrometri-analyse (figur 4A). For at verificere, at Gemcitabin faktisk inducerer den allestedsnærværende behandling af PCNA, er MiaPaCa-2-celler, der udtrykker 6HF-UB og GFP, dyrket, behandlet eller ej og underlagt enten ni-NTA-rensning under Denaturerings betingelser eller til anti-flag-immunopræcipitation efterfulgt af flag peptideluering under Native betingelser, løst på SDS side efterfulgt af Western blot med det tilsvarende antistof. Resultatet vist i figur 6 bekræftede, at pcna er stærkt allestedsnærværende som reaktion på gemcitabins behandling i MiaPaCa-2-celler.

Figur 1: etablering af stabile cellelinjer, som udtrykker 6His-flaget-UBL. A) kontrol af gfp-udtryk i gfp-transducerede celler (øvre panel) og af 6His-flag-Ubiquitin ved immunofluorescens ved hjælp af anti-flag (m2) antistof som primær og alexa-567 anti-mus sekundært antistof. DAPI blev brugt til at plette kerner. Scale bar: 50 μm. B) kontrol af 6his-flag-ubiquitin-ekspression i celle lysater ved Western blot ved hjælp af anti-flag antistof (Alternativt kan der anvendes et anti-6his-antistof) til venstre og anti-ubiquitin-antistoffer til højre for at sammenligne udtrykket af 6His-flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) med endogene Ubiquitin (endo. Ubiq). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: rensning af allestedsnærværende proteiner i to trin. A) skematisk gengivelse af proceduren. B) 10% af den endelige eluering blev underkastet SDS side efterfulgt af sølvfarvning af gelen med henblik på at anslå mængden og renheden (sammenlignet med gfp) af isolerede proteiner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: identifikation af allestedsnærværende proteiner (tilpasset fra Bonacci et al. ⁷). (A) den relative mængde af specifik (ubiquitin-prøve) og ikke-specifik (gfp-prøve) peptider for hvert identificeret protein blev afbildet i funktion af deres selv sikre scorer. Som det fremgår, bliver andelen af ikke-specifikke over allestedsnærværende proteiner for vigtig underscore på 50. Derfor, kun proteiner identificeret med en score bedre end 50 anses for signifikant. (B) tabel, der viser de 20 bedste allestedsnærværende proteiner blandt 364-i alt identificeret. C) opdeling af allestedsnærværende proteiner og totale proteiner af MiaPaCa-2-celler i biologiske processer (værdier > 1,5% blev kun taget i betragtning). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Gemcitabin-inducerede ændringer af PTM-profiler (tilpasset fra Bonacci et al. ⁷). A) liste over de 20 proteiner, der er højest forhøjet (i alt 73) eller nedsat (i alt 29) allestedsnærværende ved behandling med Gemcitabin (conf: tillid; Ind: induktion; Rep: undertrykkelse). B) repartitionering af Gemcitabin induceret ændret allestedsnærværende i biologiske processer og sammenligning med ikke-behandlet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: gemcitabins funktionelle interactomer inducerede ændret allestedsnærværende. Potentielle interaktioner mellem alle proteiner med Gemcitabin induceret ændring af allestedsnærværende er identificeret ved hjælp af en protein-protein interaktioner database (STRING: string-db.org). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: biokemiske valideringer af interessante Gemcitabin-inducerede ændringer af allestedsnærværende. For at validere den øgede allestedsnærværende PCNA efter behandling med Gemcitabin blev lysater af celler, der udtrykte 6HF-Ubiquitin, behandlet eller ikke med Gemcitabin, underkastet nikkel pull-down (ni-NTA) efterfulgt af anti-PCNA Western blot. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi har udviklet en robust og pålidelig metode til at generere profiler af proteiner modificeret af de vigtigste ubiquitin familiemedlemmer. Faktisk har vi med succes anvendt denne protokol til at generere profiler af PTMs af ubiquitin, og også af SUMO og Nedd8, og til at opdage ændringer i forbindelse med en behandling⁷, som reaktion på over ekspression eller Knockdown af et bestemt gen (data ikke viste) og i celler, der erhvervede en resistent fænotype til forskellige kemoterapeutika.

Der er kun få kritiske trin under proceduren, at manipulatoren skal være forsigtig med. Ved Pipettering af perler (ni-NTA eller anti-flag koblet), er det vigtigt at resuspendere dem grundigt, især anti-flag perler da er suspenderet i en viskøs glycerol baseret buffer, og at skære lidt enden af spidsen for at øge afsnittet. En anden forsigtighed bør følges er at pipetten langsomt for at undgå stabling af perler. Yderligere kritiske trin er elueringsprocessen med imidazol og derefter med flag peptid. En ren Hamilton sprøjte skal bruges til at genvinde supernatanten efter eluering at undgå, så meget som muligt Pipettering af perlerne, hvor uspecifikke proteiner forbliver.

Afhængigt af celle typen og mængden af det påkrævede endelige materiale til massespektrometri kan udgangsmaterialet øges eller nedsættes tilsvarende. Derefter er den eneste vigtige justering ligger i mængden af nikkel perler, da det bør være på 2 μL pr 1 mg proteiner i lysat. Det kan ske, at mængden af rensede proteiner er for lav. Udtryks niveauet for mærket UB/UBL skal styres, og hvis det er for lavt, kan cellerne re-transduceret ved hjælp af de samme lentivira. Alternativt er det muligt at øge mængden af udgangsmateriale. Nogle gange er mængden af uspecifik renset materiale i GFP eller forældre celler for høj. En løsning til at overvinde dette problem er at øge mængden og antallet af skylninger på både ni-NTA og flag rensning trin. Det er også muligt at øge koncentrationen af imidazol i vaske med guanidin buffer, op til 20 mM. Omvendt er det ikke nødvendigt at øge koncentrationen af flagets peptid i det sidste elueringstrin, da det ikke vil øge Elueringen. Det er mere vigtigt at bruge frisk peptid som over tid, selv hvis opbevares ved-20 °C, effekten af peptid kan falde.

Den vigtigste begrænsning af denne protokol er, at det kun er egnet til dyrkede celler, fordi de skal transduceres til at udtrykke den ønskede Tagged UBL. Derfor skal enhver undersøgelse af væv eller tumorprøver udføres ved hjælp af alternative tilgange såsom diGly peptider beridelser efter trypsin fordøjelse¹¹, immunopræcipitation med antistoffer, der er specifikke for UB/UBL af interesse⁵, eller brug af Rør⁶. Alle disse alternative metoder er også velegnede til deres anvendelse i dyrkede celler. De har fordelen ved at bruge de endogene UB/Ubls maskiner. Der findes dog flere ulemper. Immunopræcipitationer er svære at udføre med lav baggrund, og ligesom rør tilgange, kan proteiner interagere med modificerede proteiner, og selv modifikatoren selv, ikke elimineres, selv om praktiske forbedringer er opnået ved hjælp af strengere betingelser. DiGly peptider berigelse er en meget kraftfuld teknik, men kan svare til forskellige slags PTMs. For eksempel vil den fordøjelige berigelse fra en trypsin fordøjet lysat identificere hovedsageligt allestedsnærværende proteiner, men også neddylerede dem, som Nedd8 efterlader den samme rest digly signatur som ubiquitin gør¹¹.

En anden begrænsning af denne protokol er, at tilstedeværelsen af 6His-flaget kan ændre den normale funktion af UB/UBL, og overekspression af sig selv kan ændre maskinen. Dette kan for eksempel hæmme genereringen af polyubiquitin kæder og favorisere monoubiquitination. Men da både mono multi og polyubiquitin kæder er blevet identificeret ved hjælp af denne protokol, ser det ud til, at det ikke er tilfældet⁷. Tilstedeværelsen af mærket ved N-endestation forhindrer også dannelsen af lineær allestedsnærværende, hvor ubiquitin-delen er kædet sammen via N-terminalens methionin i ubiquitin. Men selv om 6HF-udiquitin ikke kan være allestedsnærværende på sin første met rest, det stadig har evnen til at afslutte denne form for kæde.

Også, mens det er en væsentlig fordel at bruge lentivira, som gør det muligt at oprette stabile celler linjer i en eller to uger, det kan være, at ikke alle celler ville udtrykke den ønskede konstruktion. Dette kan ikke være et reelt problem for rensningsproceduren, så længe nok celler udtrykker den eksogene UB/UBL, men problemet kan komme med langsigtet kultur som over flere passager kan der være en klon variation med tilsætning i celler med mindre eller ingen Udtryk. Denne ulempe, dog, kan let omgås ved hjælp af lentivira, der indeholder enten en modstand udvælgelse gen eller et fluorescerende protein, som kan bruges i flow flowcytometri at vælge kun positive celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag