Profilering Ubiquitin og Ubiquitin-lignende avhengige post-translational modifikasjoner og identifisering av vesentlige endringer

Summary

Denne protokollen tar sikte på å etablere ubiquitin (UB) og ubiquitin (Ubls) spesifikke proteomes for å identifisere endringer av disse type post-translational modifikasjoner (PTMs), forbundet med en bestemt tilstand, for eksempel en behandling eller en fenotype.

Abstract

Ubiquitin (UB) og Ubiquitin (ubl) avhengig post-translational modifikasjoner av proteiner spille grunnleggende biologiske regulatoriske roller i cellen ved å kontrollere protein stabilitet, aktivitet, interaksjoner, og intracellulære lokalisering. De gjør det mulig for cellen å reagere på signaler og tilpasse seg endringer i miljøet. Endringer innenfor disse mekanismene kan føre til alvorlige patologiske situasjoner som nevrodegenerative sykdommer og kreft. Målet med teknikken er beskrevet her er å etablere UB/ubls avhengige PTMs profiler, raskt og nøyaktig, fra kulturperler cellelinjer. Sammenligningen av ulike profiler innhentet fra ulike forhold tillater identifisering av spesifikke endringer, slik som de som er indusert av en behandling for eksempel. Lentiviral mediert celle Transduction er utført for å lage stabile cellelinjer uttrykker en to-koder (6His og Flag) versjon av spesial (ubiquitin eller en ubl som SUMO1 eller Nedd8). Disse kodene tillater rensing av ubiquitin og derfor av ubiquitinated proteiner fra cellene. Dette gjøres gjennom en to-trinns rensing prosess: den første er utført i denaturering forhold ved hjelp av 6His-koden, og den andre i native vilkår ved hjelp av flagget tag. Dette fører til en svært spesifikk og ren isolering av modifiserte proteiner som senere identifiseres og semi-kvantifisert av flytende kromatografi etterfulgt av tandem masse massespektrometri (LC-MS/MS) teknologi. Enkel informatikk analyse av MS data ved hjelp av Excel-programvare muliggjør etablering av PTM profiler ved å eliminere bakgrunns signaler. Disse profilene er sammenlignet mellom hver betingelse for å identifisere spesifikke endringer som vil bli studert mer spesifikt, og starter med sin validering av standard biokjemi teknikker.

Introduction

Metoden foreslås her er dedikert til å studere PTMs formidlet av ubiquitin familiemedlemmer fra kultivert pattedyrceller for å identifisere potensielle endringer knyttet til en bestemt tilstand (behandling, differensiering, etc). PTMs representerer det siste trinnet i regulering av proteiner ' funksjoner¹. Faktisk, en gang produsert av translational maskiner, de fleste om ikke alle proteiner gjennomgår ulike typer PTMs som modulere sin aktivitet, molekylære interaksjoner, og intracellulære plassering¹. Blant overflod av PTMs er de mediert av ubiquitin familien av proteiner, ubiquitin seg selv og alle ubiquitin-liker, har potensial til å regulere alle intracellulære eller delvis cytoplasmatiske proteiner². Fordi de er selv proteiner, kan de bli bøyd til hverandre, danner homogene og heterogene kjeder av mangfoldig topologi, hver knyttet til spesifikke regulatoriske funksjoner². Verktøy er nødvendig for å prøve å dechiffrere og forstå denne komplekse maskiner. Mange tilnærminger ble utviklet over hele verden, har sine egne fordeler og ulemper, og her foreslår vi en med høy ytelse egnet for kulturperler celler.

Den største fordelen med denne metoden er dens nøyaktighet. Faktisk er renheten av isolerte modifiserte proteiner svært forbedret ved Kombinatorisk bruk av de to kodene (6His og flagg) og de to trinn-prosedyre, og derfor er det mye mer selektiv enn en enkelt tag Fusion UB/ubl^3,4. Tilstedeværelsen av 6His koden gjør et første skritt i rensing i en fullt denaturering tilstand og dermed unngår enhver co-rensing av proteiner som inneholder ubiquitin bindende domener eller andre proteiner binding til ubiquitinated seg. Dette er et teknisk problem som oppdages av flere andre tilnærminger basert på affinitet rensing av ubiquitinated proteomes ved hjelp av enten spesifikke antistoffer⁵ eller tandem ubiquitin bindende elementer (TUBEs)⁶. Viktigere, denne teknikken er ikke partisk til fordel for rensing av en bestemt type ubiqitinering, som det kan være tilfelle for noen andre tilnærminger, siden både mono og ulike typer polyubiquitinations ble identifisert⁷. Følgelig, en gang grunnlegge, en omleggingen av ubiqitinering ville være nødt til å bli studert inne flere detaljene av målestokk biokjemiske tilnærmelser for at identifisere det pressepenger av type av ubiqitinering involvert.

Til slutt, en annen teknisk fordel med denne protokollen er bruk av lentiviruses, som enkelt og raskt skaper stabile uttrykker cellelinjer med rimelig nivå av uttrykk for kodede spesialfunksjoner uten å forstyrre den normale cellulære atferd.

Mens en viktig rolle ubiqitinering er å målrette proteiner for proteasomal degradering, er det nå kjent at den har mange andre regulatoriske egenskaper for potensielt mest intracellulære eller delvis intracellulære proteiner¹. Antallet av disse funksjonene er ytterligere forsterket av eksistensen av mange ubiquitin som proteiner, danner en familie av proteiner som regulerer nesten alle celle mekanismer¹. Deres endringer kan ha drastisk innvirkning på cellebiologi og kan lede eller delta i patologiske situasjoner⁸, som for eksempel kreft⁹. Derfor er verktøy som trengs for å utforske dette enorme landskapet og identifisere endringer knyttet til en patologisk tilstand som kan tjene som romanen terapeutiske mål.

Denne protokollen er dedikert til celler i kulturen siden de må være transduced å uttrykke eksogene Tagged UB/ubl. Når disse stabile cellelinjene er opprettet, kan de brukes til å generere ubl-profiler fra kultur i 2D-eller 3D-eller xenotransplantater, og dermed forlenge horisonten på de ulike eksperimentelle modellene som kan brukes til å studere PTMs-profiler.

Protocol

1. generering av stabile cellelinjer uttrykker 6His-Flag-ubl

Merk: co-transfeksjoner av HEK-293T celler med pCCL-6HF-ubl, pVSVG og delta-Helper.

1. Dag 0: Seed 293T celler i en 6-brønn plate for å få 50-70% samløpet dagen etter.
2. Dag 1: co-transfect 50-70% confluent celler med en blanding av 1 mikrogram pCCL-6HF-ubl eller pCCL-GFP, 1 mikrogram pVSVG og 1 μg av delta-Helper-vektorer, ved hjelp av en transfeksjoner reagens og protokoll for lentivirus produksjon. Etter 6 h av transfeksjoner, endre mediet til en ny en tilsvarende celler som skal transduced. Seed cellene skal transduced i en 6 brønn plate for å få en 10-20% samløpet dagen etter (dagen for å starte Transduction).
3. Dag 2:24 h etter transfeksjoner, gjenopprette mediet som inneholder lentiviral partikler og filter ved hjelp av 0,45 μm filtre. Om nødvendig, Legg friskt medium på dette punktet for å produsere en andre batch av lentiviruses. Ombytte det medium av celler å bli transduced (10-20% samløpet) av det ettall inneholder lentiviruses.
   Merk: Lentiviral medium kan oppbevares ved + 4 ° c i flere dager før Transduction eller lagres ved-80 ° c i månedsvis.
4. Ruge cellene med lentiviruses mellom 24 h til 72 h i en standard inkubator (37 ° c, 5% CO₂), og endre deretter mediet for frisk standard en. Hvis mulig, sjekk GFP uttrykk ved hjelp av en invertert fluorescerende mikroskop for å evaluere effektiviteten av Transduction: prosentandel av å uttrykke celler og relative nivå av uttrykket per celle. Hvis ingen fluorescens oppdages, venter du til flere 2-3 dager, ettersom uttrykket kan ta lengre tid, avhengig av celletypen som skal transduced.
5. Hvis GFP kontroll er positiv, dyrke alle cellene til å ha nok til å utføre et uttrykk kontroll av 6HF-ubl av immunofluorescence og Western Blot bruker anti-Flag antistoff.

2. dobbel rensing av modifiserte proteiner

Merk: buffer 1:6 M Guanidiniumklorid-HCl, 0,1 M na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8,0, 0,5% Triton X-100.
Buffer 2:50 mM NaH₂PO₄, 150 mm NaCl, 1% Tween20, 5% glyserol, pH 8,0.
Buffer 3:100 mM NH₄HCO₃, pH 8,0.

1. Cellelyse: Når du er klar, vask kultur retter minst en gang med fosfat-bufret saltvann (PBS) ved romtemperatur (RT) og gå videre til cellelyse eller, alternativt, blits fryse i flytende N₂ og lagre ved-80 ° c. For lyse Rings, tilsett 2 mL buffer 1 per 15 cm rett ved RT. Bruk en celle skraper for å gjenopprette alle lysater i 50 mL koniske sentrifugerør (siste volum ca 20 mL).
2. Sonikere lysater tre ganger for 30 s separert med en 1 min pause.
3. Sentrifuger sonikert lysater ved 15 000 x g i 15 min.
4. Overfør supernatanten til et nytt rør ved hjelp av en celle sil (40 μm).
5. Bestem prøver ' konsentrasjon og Juster, om nødvendig, for å oppnå samme mengde proteiner og samme volum. Bruk en total mengde protein mellom 50 og 100 mg (10 retter med 15 cm diameter for MiaPaCa-2 celler).
6. Tilsett ni^{2 +}-nTa perler, ved hjelp av 2 μL av perler per 1 mg protein.
7. Roter ved 30 RPM under 2,5 h ved RT.
8. Pellet perlene på 500 x g i 5 min.
9. Vask perlene med 1 mL buffer 1, overfører prøvene til en 1,5 mL mikrosentrifugen rør, deretter overføre rørene på isen. Utfør alle de neste trinnene på is eller ved 4 ° c.
10. Vask to ganger med 1 mL is-kald buffer 2 som inneholder 10 mM imidazole.
11. For å eluere bundne proteiner, tilsett 600 μL av buffer 2 som inneholder 250 mM imidazole og Roter for 2 t ved 4 ° c.
12. Pellet perlene av sentrifugering ved 500 x g for 1 min. overføre supernatanter til nye, pre-avkjølt, 1,5 ml rør og tilsett 50 μL av anti-flagg m2 antistoff bøyd perler.
13. Roter ved 30 RPM for 2,5 h ved 4 ° c, vask deretter 2 ganger med 500 μL av buffer 2, deretter 2 ganger med 500 μL av buffer 3.
14. For den endelige eluering legger du til 100 μL av buffer 3 som inneholder et flagg peptid ved 0,1 μg/μL og roterer ved 4 ° c for 1,5 h.
15. Sentrifuger på 500 x g for 1 min og Overfør supernatanter til nye pre-avkjølte rør.
16. Ta 10% (10 μL) å laste på SDS-side og utføre en sølv farging av gel å kontrollere rensing kvalitet. Hvis rensing ser bra ut, analysere 90% igjen av LC-MS/MS.

3. behandling av masse massespektrometri data for å generere profiler av UB/Ubls PTMs og å identifisere betydelige forskjeller mellom dem

Merk: resultater fra MS analyse inneholder mange opplysninger, inkludert det totale antall peptider samt topp området verdier (gjennomsnitt av topp 3 peptid område¹⁰) for hvert protein identifisert i hvert eksemplar. Disse dataene kan behandles enten ved hjelp av peptid Count tall eller topp område verdier, eller begge deler. For beregning med topp områder, fordi disse verdiene er vanligvis i området 10⁶, er det nødvendig å dele dem i denne rekkefølgen før du bruker de samme formlene som nedenfor. Resultatene oppnådd med begge metoder for telling bør vise en sterk korrelasjon som det vanligvis gjør. For hvert identifiserte protein bruker du følgende formler der:
v1 peptider verdier i ikke-behandlet ubiquitin prøve (f. eks UB-narkotika)
v2 peptider verdier i gemcitabin behandlet ubiquitin prøve (f. eks, UB + narkotika)
K1 peptider verdier i ikke-behandlet kontroll GFP prøve (f. eks, GFP-narkotika)
K2 peptider verdier i gemcitabin behandlet kontroll GFP prøve (f. eks, GFP + narkotika).

1. Normalisering: normalisere verdier mellom legemiddel behandlede celler og ubehandlede celler for Ubiquitin og GFP ved hjelp av følgende formler. Normalisert v = V og normalisert k = K.
   V1 = v1. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v1); V2 = v2. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v2)
   K1 = K1. (∑ K1 + ∑ K2)/(2. ∑ K1); K2 = K2. (∑ K1 + ∑ K2)/(2. ∑ K2)
2. Fjerning av bakgrunn: ved hjelp av følgende formler trekker du verdier i kontroll prøven (GFP) fra verdiene i det ubiquitin eksemplet for å få bestemte verdier (V ' 1 og V ' 2) for hvert identifiserte protein i begge betingelsene.
   V ' 1 = v1-K1 hvis v1-K1 ≥ 0; V ' 1 = 0 hvis v1-K1 < 0
   V ' 2 = v2-K2 hvis v2-K2 ≥ 0; V ' 2 = 0 hvis v2-K2 < 0
3. Variasjon (var) av ubiqitinering. For å få en poengsum (mellom-100 og + 100) for positive og negative variasjoner av PTMs indusert av et medikament, bruk følgende formel der forskjellen mellom bestemte verdier av behandlede og ubehandlede prøver er delt på summen av alle verdier, inkludert de i kontroll (for å straffe proteiner også identifisert i kontroll GFP), og multiplisere med 100.
   Var = (V'2-V ' 1)/(v1 + K1 + v2 + K2) * 100; -100 < var < 100;
   Variasjoner under-50 (undertrykkelse av PTM) eller over 50 (induksjon av PTM) betraktes vanligvis som signifikante.
4. Confidence (conf). Bruk følgende formel for å få en sikkerhets verdi mellom 0 og 100%,:
   Conf = ((v1 + v2)²/(1 + v1 + v2 + K1 + K2)²) * 100-100/(1 + V ' 1 + v ' 2); = 0 Hvis < 0
   Verdier over 50 er vanligvis ansett for å være sikre.
5. For å få en bedre fordeling av induksjon/undertrykkelse verdier og å vurdere både variasjon og tillit parametere, multiplisere var og conf verdier ved hjelp av følgende formel der V var og C conf
   = SI (v2 > 0;((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6);-((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6))
   Merk: som topp område verdier er vanligvis mer nøyaktig enn peptid telling, er det mulig å bruke spesifikk programvare som er dedikert til tolkningen av denne type data som Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), etter anbefalinger for bruk.

Representative Results

Transduction av kultur pattedyrceller for å lage GFP og 6HF-UB uttrykke celler
Å produsere lentiviruses som vil bli brukt senere til å overfører MiaPaCa-2 celler, 70% confluent HEK-293T celler er co-transfekterte med en lik mengde av de tre vektorer, pCCL-6HF-Ubiquitin eller GFP/delta-Helper/pvSvG. Etter 24 h av produksjonen, er mediet som inneholder lentiviral partikler utvinnes og filtrert. Det er mulig på dette punktet å kontrollere effektiviteten av transfeksjoner ved å sjekke den grønne fluorescens av GFP uttrykke 293T celler på en invertert mikroskop. Det bør være nær 100% av cellene. MiaPaCa-2 celler er inkubert med lentiviral supernatanten for 1 til 3 dager. Effekten av lentiviral Transduction kontrolleres først ved å se på GFP-fluorescens i GFP transduced-celler (figur 1A Upper panel). GFP uttrykks nivå kan variere fra en celle til en annen, men 100% av dem bør være fluorescerende. Når denne kontrollen er ferdig, vil uttrykket av Flag-ubiquitin må også styres. Dette gjøres ved å immunofluorescence farging ved hjelp av et anti-flagg-antistoff (vanligvis m2 monoklonale) (figur 1A nedre panel). Dette vil vise prosentandelen av transduced celler, som skal være 100% for å garantere et stabilt uttrykk over fremtidige passasjer av celle kulturen. For å kontrollere uttrykket nivå av eksogene Flag-ubiquitin, lysater fra transduced celler analyseres av SDS-side etterfulgt av Western Blot med anti-Flag antistoff (figur 1B). Begge cellelinjene kan fryses.

To trinn rensing og kontroll av SDS side og sølv farging
Når stabile uttrykker cellelinjer har blitt validert, både GFP og 6HF-ubiquitin celler forsterkes til nok materiale er innhentet for å fortsette med to-trinns rensing. Det anbefales å holde en sikkerhetskopi av disse cellelinjer som frosset lager i flytende nitrogen for å kunne tine dem når det trengs. 36 h før prosessering, halvparten av cellene (halvparten GFP og halv 6HF-Ubiquitin) behandles med 10 μM av Gemcitabin. Når du er klar, ubiquitinated proteiner er renset fra 6HF-ubiquitin og fra GFP kontroll celler, ved hjelp av to-trinns rensing protokollen (figur 2A). 10% av den endelige eluering brukes til å kontrollere mengden og integriteten av renset materiale ved SDS-side og sølv farging av gel (figur 2B). Molekylvekt markører band kan brukes til å anslå mengden av renset ubiquitinated proteiner. Alternativt kan en kjent mengde BSA eller annet protein lastes inn i en linje av gelen for å hjelpe kvantifisere av renset proteiner. Når denne bekreftelsen er gjort, er de resterende 90% av prøvene analysert av flytende kromatografi koplet til tandem masse massespektrometri å tillate identifisering og semi-kvantifisering av renset proteiner.

Identifisering av ubiquitinated proteiner etter bakgrunn (GFP prøver) subtraksjon
Data fra LC-MS/MS-analyse av prøvene gir navn og quantifications (topp områder og antall observerte peptider) for hvert identifiserte protein i GFP-og 6HF-UB-prøver. Proteinene som har den høyeste kvantifisering i ubiquitin prøve sammenlignet med GFP prøven er mest sannsynlig å være de virkelig ubiquitinated og anvende formlene beskrevet i metoder over tillater deres klassifisering ved å gi en tillit score fra 0 til 100% . Proteiner som identifiseres med en poengsum over 50%, betraktes som ubiquitinated (Figur 3a).

Dette trinnet som i utgangspunktet fjerner bakgrunns proteiner (GFP) fra ubiquitin prøver førte til identifisering av 364 proteiner signifikant ubiquitinated (Figur 3B)⁷. Merk her at proteiner identifisert med høyest poengsum er stort sett allerede kjent som hovedmål for ubiqitinering som beviser effekten av denne rensing metoden.

Da er det mulig å utføre et gen sett berikelse analyse (GSEA) av disse ubiquitinated proteiner for å markere de biologiske prosessene som de er involvert (Figur 3C), deres molekylære funksjoner, deres mobilnettet kupé, eller andre gen ontologi kategorisering. Det er interessant å sammenligne denne ubiquitinated proteom med full proteom av cellen når det er mulig. Faktisk avslører denne analysen det virkelige bidraget fra disse ubiquitinated proteinene i spesifikke prosesser som oversettelse eller proteinolyse for eksempel (fig.3C).

Hovedformålet med denne typen eksperiment er å identifisere endringer i ubiquitinated proteom indusert av en behandling for eksempel her gemcitabin. Ved å sammenligne ubiquitinome (ubiquitinated spesifikke proteom) i behandlede og ubehandlede celler ved hjelp av den spesifikke formelen gir en verdi fra-100 (undertrykkelse av ubiqitinering) til + 100 (induksjon av ubiqitinering). Vurderer bare verdiene nedenfor-50 eller over + 50 som betydelig, totalt 73 indusert ubiquitinations og 29 undertrykt ubiquitinations har blitt identifisert (Figur 4a). GSEA analyse av disse endringene av ubiqitinering avdekket spesifikke elementene i DNA-reparasjon prosesser eller celle syklus, og viktige variasjoner i oversettelse og RNA metabolske prosesser (Figur 4B). Dette resultatet er svært logisk siden gemcitabin er en base analog som blokkerer DNA-syntese og provoserer DNA skader.

For å gå videre, er det også interessant å bruke databaser for samspill proteiner for å utforske og validere potensielle samspill nettverk dannet av gemcitabin indusert endringer av ubiqitinering (figur 5). Dette førte til identifisering av funksjonelle samspill nettverk sterkt påvirket av økt eller redusert ubiqitinering av de involverte proteiner.

Til slutt, blant de endrede ubiqitinering, kan noen innebære proteiner av høyeste interesse, på grunn av deres kjente eller potensielle funksjoner i henhold til litteraturen. Derfor er et viktig skritt for å validere at det som er observert av masse massespektrometri er reell og troverdig. PCNA var en av de mest over-ubiquitinated protein ved gemcitabin behandling oppdaget av masse massespektrometri analyse (Figur 4A). For å verifisere at gemcitabin faktisk induserer ubiqitinering av PCNA, MiaPaCa-2 celler uttrykker 6HF-UB og GFP dyrkes, behandles eller ikke, og underlagt enten ni-NTA rensing i denaturering forhold eller til anti-Flag immunutfelling etterfulgt av Flag peptid eluering i native forhold, løst på SDS PAGE etterfulgt av Western Blot med tilsvarende antistoff. Resultatet vist i figur 6 bekreftet at faktisk PCNA er sterkt ubiquitinated som svar på gemcitabin behandling i MiaPaCa-2 celler.

Figur 1: etablering av stabile cellelinjer uttrykker 6His-Flag-ubl. (A) kontroll av GFP uttrykk i GFP transduced celler (øvre panel) og av 6His-Flag-Ubiquitin av immunofluorescence ved hjelp av anti-Flag (M2) antistoff som primær og alexa-567 anti-mus sekundære antistoff. DAPI ble brukt til å beis kjerner. Scale bar: 50 μm. (B) kontroll av 6His-Flag-Ubiquitin uttrykk i celle Lysater av Western Blot ved hjelp av anti-flagg antistoff (alternativt kan et anti-6His antistoff brukes) til venstre, og anti-Ubiquitin antistoff, til høyre, for å sammenligne uttrykket av 6His-Flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) med endogene Ubiquitin (Endo. Ubiq). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: totrinns rensing av ubiquitinated proteiner. (A) skjematisk fremstilling av prosedyren. (B) 10% av den endelige eluering ble utsatt for SDS Page etterfulgt av sølv farging av gelen for å anslå kvantitet og renhet (SAMMENLIGNET med GFP) av isolerte proteiner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: identifisering av ubiquitinated proteiner (tilpasset fra Bonacci et al. ⁷). (A) relativ mengde spesifikk (ubiquitin prøve) og ikke-spesifikke (GFP Sample) peptider for hvert identifiserte protein ble plottet i funksjon av deres trygge score. Som vist, blir andelen av ikke-spesifikke over ubiquitinated proteiner for viktig underscore på 50. Derfor er bare proteiner som er identifisert med en poengsum som er bedre enn 50, betraktet som betydelige. (B) tabellen viser de 20 beste ubiquitinated proteiner blant 364-totalt identifisert. (C) partisjonere ubiquitinated proteiner og totalt proteiner av MiaPaCa-2-celler i biologiske prosesser (verdier > 1,5% ble bare vurdert). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: gemcitabin induserte endringer av PTM profiler (tilpasset fra Bonacci et al. ⁷). (A) notering av de 20 proteinene med høyest økning (totalt 73) eller redusert (totalt 29) ubiqitinering ved gemcitabin behandling (conf: tillit; Ind: induksjon; Rep: undertrykkelse). (B) partisjonere gemcitabin indusert endrede ubiqitinering i biologiske prosesser og sammenlignet med ikke-behandlede. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: funksjonell interactomes av gemcitabin induserte endrede ubiqitinering. Potensielle interaksjoner mellom alle proteiner med gemcitabin indusert endring av ubiqitinering identifiseres ved hjelp av en protein-protein interaksjoner database (STRING: string-db.org). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: biokjemiske valideringer av interessante gemcitabin indusert endringer av ubiqitinering. For å validere økt ubiqitinering av PCNA etter gemcitabin behandling, lysater av celler uttrykker 6HF-Ubiquitin, behandlet eller ikke med gemcitabin, ble utsatt for nikkel pull-Down (ni-NTA) etterfulgt av anti-PCNA Western Blot. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi har utviklet en robust og pålitelig metodikk for å generere profiler av proteiner modifisert av de viktigste ubiquitin familiemedlemmene. Faktisk har vi brukt denne protokollen til å generere profiler av PTMs ved ubiquitin, og også av SUMO og Nedd8, og å oppdage endringer knyttet til en behandling⁷, som svar på over uttrykket eller knockdown av et bestemt gen (data ikke vist) og i celler som ervervet en resistent fenotype til ulike kjemoterapeutiske legemidler.

Det er bare noen få kritiske trinn under prosedyren at manipulator bør være forsiktig med. Ved pipettering av perler (ni-NTA eller anti-Flag kombinert), er det viktig å resuspend dem grundig, spesielt anti-Flag perler siden er suspendert i en viskøs glyserol basert buffer, og til å kutte litt enden av spissen for å øke den delen. En annen forholdsregel bør følges er å pipette langsomt for å unngå stabling av perler. Ytterligere kritiske skritt er eluering med imidazole og deretter med Flag peptid. En ren Hamilton sprøyten må brukes til å gjenopprette supernatanten etter eluering å unngå, så mye som mulig pipettering av perlene på hvilke uspesifisert proteiner gjenstår.

Avhengig av celle type og mengden av nødvendige endelige materialet for masse massespektrometri, kan Start materialet økes eller reduseres tilsvarende. Deretter ligger den eneste viktige justeringen i volumet av nikkel perler som det skal være av 2 μL per 1 mg proteiner i lysat. Det kan skje at mengden av renset proteiner er for lav. Uttrykks nivået for kodede UB/ubl skal kontrolleres, og hvis det er for lavt, kan celler transduced ved hjelp av samme lentiviruses. Alternativt er det mulig å øke mengden av Start materiale. Noen ganger er mengden ikke-spesifikk renset materiale i GFP eller foreldre celler for høyt. En løsning for å overvinne dette problemet er å øke volumet og antall vasker på både ni-NTA og Flag rensing trinn. Det er også mulig å øke konsentrasjonen av imidazole i vasker med guaniniumtiocyanat buffer, opp til 20 mM. Omvendt, er det ikke nødvendig å øke konsentrasjonen av Flag peptid i finalen eluering trinn som det ikke vil øke eluering. Det er mer viktig å bruke ferske peptid som over tid, selv om lagret på-20 ° c, effekten av peptid kan redusere.

Den viktigste begrensningen av denne protokollen er at det er bare egnet for kulturperler celler fordi de må være transduced å uttrykke ønsket merket ubl. Derfor har noen studie på vev eller tumor prøver skal utføres ved hjelp av alternative tilnærminger som diGly peptider elementene etter Trypsin fordøyelsen¹¹, immunutfelling med antistoffer som er spesifikke for UB/ubl av interesse⁵, eller bruk av Rør⁶. Alle disse alternative metoder er også egnet for deres anvendelse i kulturperler celler. De har fordelen av å bruke den endogene UB/Ubls maskiner. Det finnes imidlertid flere ulemper. Immunoprecipitations er vanskelig å bli utført med en lav bakgrunn, og som rør tilnærminger, proteiner som samhandler med modifiserte proteiner, og til og med selve spesial elementet, kan ikke elimineres, selv om praktiske forbedringer er innhentet ved hjelp av strengere betingelser. DiGly peptider berikelse er en meget kraftfull Technic, men kan tilsvare forskjellige typer PTMs. For eksempel, diGly berikelse fra en Trypsin fordøyd lysat vil identifisere hovedsakelig ubiquitinated proteiner, men også neddylated seg, som Nedd8 etterlater samme rest diGly signatur som ubiquitin gjør¹¹.

En annen begrensning av denne protokollen er at tilstedeværelsen av 6His-flagget koden kan endre normal funksjon UB/ubl og overuttrykte av seg selv kunne endre maskiner. Dette kan for eksempel hindre generering av polyubiquitin kjeder og favoriserer monoubiquitination. Men siden både mono multi og polyubiquitin kjeder har blitt identifisert ved hjelp av denne protokollen, ser det ut til at det ikke er tilfelle⁷. Tilstedeværelsen av koden på N-Terminus hindrer også dannelsen av lineære ubiqitinering, der ubiquitin andeler er koblet sammen via N-Terminal metionin av ubiquitin. Men selv om 6HF-udiquitin ikke kan ubiquitinated på sin første Met rester, har det fortsatt evnen til å avslutte denne typen kjeden.

Også, mens det er en betydelig fordel å bruke lentiviruses som muliggjør etablering av stabile celler linjer i en eller to uker, er det mulig at ikke alle celler ville uttrykke ønsket konstruere. Dette kan være ikke et reelt problem for rensing prosedyren så lenge nok celler uttrykker eksogene UB/ubl, men problemet kan komme med langsiktig kultur som over flere passasjer kan det være en klonal variasjon med berikelse i celler med mindre eller ingen Uttrykk. Denne ulempen, men kan lett omgås ved hjelp lentiviruses inneholder enten en motstand utvalg genet eller et fluorescerende protein som kan brukes i Flow flowcytometri å velge bare positive celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag