Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Måle mikrobiell mutasjon priser med svingninger analysen

Published: November 28, 2019 doi: 10.3791/60406
Automatic Translation
1, 2,3, 3, 1, 4, 3
1School of Biological Sciences, The University of Manchester, 2School of Science, University of Waikato, 3School of Natural Sciences, The University of Manchester, 4Department of Mathematics, Université du Québec à Montréal

Summary

Her er en protokoll presentert for å utføre en svingninger analysen og anslå mikrobiell mutasjon rate bruker fenotypiske markører. Denne protokollen vil gjøre det mulig for forskere å analysen mutasjoner i ulike mikrober og miljøer, bestemme hvordan genotype og økologisk sammenheng påvirker spontane mutasjon priser.

Abstract

Svingninger analysene er mye brukt for å estimere mutasjon priser i mikrober vokser i flytende miljøer. Mange kulturer er hver inokulert med noen få tusen celler, hver følsom for en selektiv markør som kan være analyseres phenotypically. Disse parallelle kulturer vokser for mange generasjoner i fravær av fenotypiske markør. Et delsett av kulturer brukes til å anslå det totale antall celler i fare for mutasjoner (dvs. Befolkningsstørrelsen på slutten av vekstperioden, eller Nt). De resterende kulturer er belagt på selektiv agar. Fordelingen av observerte resistente mutanter blant parallelle kulturer brukes deretter til å anslå forventet antall mutational hendelser, m, ved hjelp av en matematisk modell. Dividere m ved Nt gir estimatet av mutasjon rate per knute poeng per generasjon. Analysen har tre kritiske aspekter: den valgte fenotypiske markør, det valgte volumet av parallelle kulturer, og sikre at overflaten på selektiv agar er helt tørt før inkubasjons. Analysen er relativt billig og trenger bare standard laboratorieutstyr. Det er også mindre arbeidskrevende enn alternative tilnærminger, for eksempel akkumulering av mutasjon og enkelt celleanalyser. Analysen fungerer på organismer som går gjennom mange generasjoner raskt og det avhenger av antagelser om fitness effekter av markører og celle død. Men nylig utviklede verktøy og teoretiske studier betyr at disse problemene nå kan rettes analytisk. Analysen gjør at mutasjon rate estimering av ulike fenotypiske markører i celler med ulike genotyper vokser isolert eller i et fellesskap. Ved å gjennomføre flere analyser parallelt kan analysene brukes til å studere hvordan kroppens miljøforhold påvirker den spontane mutasjon raten, noe som er avgjørende for å forstå resistens mot antimikrobielle, kreft, aldring og evolusjon.

Introduction

I 1901 innførte den nederlandske botaniker Hugo de Vries betegnelsen mutasjon1. Twenty-seks år senere, da Hermann Joseph Muller oppdaget mutagent handling av røntgenstråler2, var mutasjoner allerede oppfattet som en av drivkreftene i evolusjon. Imidlertid var innholdet av mutasjoner ikke klart. For å besvare det fundamentale spørsmålet om mutasjoner oppstår spontant (dvs. en spontan mutasjon) eller som svar på valg (dvs. en indusert mutasjon), en metode var nødvendig for å observere mutational hendelser. En slik metode vil måle forventet antall mutasjoner per celle divisjon eller det som allerede var kjent som en mutasjon rate3,4.

Figure 1
Figur 1: skjematisk illustrasjon av hvordan du utfører svingningene analysen med en mikrobiell belastning i en 96 dyp brønn plate. (A) vaksinere og acclimate celler i 50 ml rør som inneholder fem forskjellige miljøer (' rød ', ' blå ', ' grønn ', ' lilla ' og ' oransje ' analyser). (B) forberede parallelle kulturer med et lite antall følsomme celler i en 96 dyp brønn plate. Den "røde" analysen har 20 parallelle kulturer, mens den "blå", "grønn", "lilla", og "oransje" analysene alle har 19 parallelle kulturer. Plasseringen av parallelle kulturer på 96 dyp brønn plate er tilfeldig. Tilfeldiggjøring kan gjøres med utfyllende LayoutGenerator. R skript eller av et annet verktøy. Oppsettet øverst til høyre er et tilfeldig resultat. (C) ruge den 96 dyp brønn plate og la cellene til å dele og spontant mutere. Seks kulturer fra dype brønner a1, B1, C1, E1, F1 og G1 viser hvordan antall mutanter svinger: 4, 0, 2, 2, 1, og 4 røde celler etter tredje celle divisjon, henholdsvis. Antall mutanter skiller seg ikke bare på grunn av ulike antall spontane mutasjoner (0, 1, eller 2 som vist ved den første røde cellen), men også fordi det er viktig når under en kultur syklus en motstand mutasjon spontant framgår (celle divisjon 1, 2, eller 3). (D) etter inkubasjons av 96 dyp brønn plate antall mutanter bestemmes av plating 81 parallelle kulturer. På oppsettet er disse sirkler uten uthevet kanter. Hele parallelle kulturen er belagt på en brønn av en 6 brønn plate som inneholder en selektiv agar. (E) de resterende 15 kulturene er fortynnet og belagt på ikke-selektiv agar å bestemme gjennomsnittlig antall celler (Nt). På layout disse er merket som Ntwells og har uthevet kanter. For hver analysen Nt er i gjennomsnitt over tre parallelle kulturer. Nederst til høyre er en Petri parabolen inneholder en ikke-selektiv agar plate med 25 CFUs av en utvannet kultur dyrket i en dyp brønn D1 (del av en "grønn" analysen). (F) etter inkubasjons av de selektive 6 brønn platene ble antallet observerte mutanter telt, og det forventede antallet mutational hendelser, m, ble estimert ved hjelp av et estimat for maksimal sannsynlighet. (G) å vite både antall mutasjoner, m, og antall celler per analyse, Nt, mutasjon raten ble anslått som m/Nt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Salvador Luria og Max Delbrück i 1943 ga en genial løsning på dette problemet med svingninger analysen5 (se figur 1). Analysen starter med flere populasjoner (navngitte parallelle kulturer) som er initiert med et lite antall mikrobielle celler (figur 1a, B). Etter vekst i et godartet, ikke-selektiv miljø (figur 1C), parallelle kulturer er overført på plater som inneholder en selektiv markør (phages, antibiotika, etc.), der bare celler med en motstand mutasjon overlever og kan produsere en koloni (figur 1D). Den største forventningen var at hvis motstanden mutasjoner er indusert, antall celler som bærer en mutasjon bør fordeles mellom ulike populasjoner med gjennomsnittet lik variansen. Hva Luria og Delbrück funnet med svingninger analysen er at antall mutanter svingt drastisk og at variansen i antall mutanter blant ulike populasjoner var betydelig større enn gjennomsnittet. Luria og Delbrück viste dermed at mutasjoner er spontane. De viste at mutasjoner spontant dukker opp når DNA er kopiert, og antall mutanter avhenger av når mutasjonen oppstår under veksten av befolkningen. Se figur 1C, hvor seks populasjoner, hver startet med en mikrobiell celle (i blått), opplever ingen, 1 eller 2 enkelt mutasjoner. Populasjoner a1, E1, og F1 opplevde en enkelt mutasjon (første røde celle), men fordi en enkelt mutasjon spontant fremkommer på ulike tidspunkt under en kultur syklus, befolkninger endte opp med et helt annet antall observerte mutanter (fire, to og en, henholdsvis). På den annen side, bestander C1 og G1 endte opp med det samme antall observerte mutanter som E1 og a1, til tross opplever to mutational hendelser snarere enn én. Svingningene i observert mutanter blant populasjoner ikke bare ga analysen navnet, men viste også at en mutant frekvens (dvs. andelen av muterte celler) er en utilstrekkelig indikator på mutasjon rate.

Det overordnede målet for svingningene analysen er å estimere den spontane mutasjon rate av en bestemt genotype av bakterier eller andre encellede organisme vokser i et bestemt flytende miljø. Svingningene analysen er fortsatt den mest hensiktsmessige verktøy for å studere miljømessige avhengigheten av mikrobiell mutasjon priser og gir rask og rimelig mutasjon rate estimering. Alternative tilnærminger til mutasjon rate estimering, for eksempel maksimal dybde sekvensering6, befolkning sekvensering7, mutasjon akkumulering eksperimenter8, eller sammenligne Genova sekvenser av et avkom til de av foreldrene9 er mye mer arbeidskrevende, og dermed dårlig egnet til potensielt oppdage miljømessige avhengigheter. Men dynamiske aspekter ved en mutasjon generasjon og reparasjon er i stor grad utilgjengelige for en svingninger analysen eller til noen av metodene for assaying en mutasjon rate nevnt ovenfor. For å studere hvordan antall mutasjoner endres i tid, rom, eller blant individuelle celler i en populasjon, tilnærminger én celle11,12 er nødvendig, som i tillegg til å være mer arbeidskrevende enn svingninger analyser, krever høyt spesialiserte ferdigheter og utstyr.

I praksis er en svingninger analysen teller celler få en fenotypiske markør på grunn av en mutasjon som oppstår i et miljø som mangler valg for at markøren. Den meta-analyse av hundrevis av publiserte analyser10 viser at minst 39 forskjellige fenotypiske markører har blitt brukt siden analysen er starten i 1943. Svingningene analysen kan brukes til å sammenligne gjennomsnitt og miljømessige avhengighet av mutasjon priser blant laboratorium, klinisk, nonmutator, og Mutator stammer vokser i ettergivende miljøer. Analysen gjør det mulig for mutasjon rate estimering i celler med ulik genetisk bakgrunn vokser i enten minimal eller rike miljøer. Analysen er egnet ikke bare for populasjoner som vokser som en monokultur, men kan også brukes til å studere virkningene av celle-celle interaksjoner på mutasjon priser11. Når belastningen av interesse er cocultured med en annen belastning, og en nøytral markør brukes til å skille stammene, mutasjon priser kan analyseres for to stammer i samme rør samtidig.

Svingninger analyser har avdekket at den spontane mutasjon rate avhenger av både en celle genotype og dets miljø12 og er en egenskap som selv utvikler seg13. Når mutasjon rate av en bestemt genotype endringer med miljøet, er det beskrevet som mutasjon-rate plastisitet11. Plastic mutasjon priser har vært mest grundig adressert for stress-indusert mutagenese (SIM)14. I tillegg, ved hjelp av svingninger analyser, har det nylig blitt vist at tettheten som en befolkning av celler vokser (vanligvis en satsvis kultur ved bæreevne) er nært forbundet med mutasjon priser på tvers av bakterier og encellede Landplantenes. Mutasjon rate per Genova per generasjon avtar i tett populasjoner med så mye som 23-fold10,11. Denne tettheten-assosiert mutasjon rate plastisitet (DAMP) kan avhenge av en quorum-sensing system15 og opptre uavhengig av SIM16.

Her er en detaljert protokoll presentert for svingninger analysen brukes til å studere Escherichia coli stamme K-12 å få motstand mot antibiotika Rifampicin i en glukose minimal mediemiljø. Imidlertid bør denne protokollen sees på som en grunnleggende mal som kan utnyttes til å studere en rekke mikrober ved å endre kultur forholdene og fenotypiske markører for mutasjon. Protokollen har utviklet seg fra oppstarten5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 gjennom bruk på et bredt spekter av mikrober og selv kreftceller30 og har blitt modifisert for å øke gjennomstrømningen, som var avgjørende for riktig testing miljømessige avhengigheter av mikrobiell mutasjon priser10,11,16. Protokollen som beskrives her dekker ikke all metodisk og analytiske spørsmål av svingningene analysen som allerede har vært godt diskutert i litteraturen, spesielt fitness effekter av resistente mutasjoner31, fenotypiske forsinkelse32, celle død33, og egnetheten av ulike algoritmer tilgjengelig for å anslå mutasjon priser26,34. Dette kan være viktig, for eksempel når den miljømessige avhengigheten av fitness effekter kan gi opphav til feilaktig variasjon i mutasjon rate anslag35. Vi registrerer imidlertid at de analytiske verktøyene vi bruker her kan håndtere variasjonen i mutant kondisjon og celle død. Som adressert i notater og diskusjon, er det også anbefalt at flere fenotypiske markører som er usannsynlig å ha samme miljømessig avhengige fitness effekter bli vurdert. Denne protokollen vil gjøre det mulig for folk å rutinemessig analysen miljømessige avhengigheter av mutasjon priser i mangfoldet av mikrobielle stammer og miljøer. Assaying mutasjoner i ulike miljøer har ennå ikke blitt grundig testet og når befolkningstettheten er vurdert, kan svingninger analyser gi et mer presist anslag for mutasjon rate10. Denne protokollen vil muliggjøre flere svingninger analyser skal utføres, som er nødvendig for å forstå mekanismene underbygger mutasjon priser, som igjen er avgjørende for å forstå evolusjon, kreft, aldring, og resistens resistens.

Protocol

1. dag 1: inoculation og acclimation av kulturer

  1. Vaksinere 3 mL flytende lysogeny buljong (LB, se supplerende tabell 1) med en skrape av is fra E. coli MG1655 glyserol (18% glyserol,-80 ° c). Rist LB kulturen ved 120 RPM for ~ 7 h ved 37 ° c.
    Merk: I dette eksperimentet, E. coli K12 MG1655 vokser i lb brukes, men denne analysen kan utføres med noen E. coli stamme eller andre culturable mikrobielle arter. Inkubasjons temperatur, inkubasjons tider, og nærings nivå av vekst mediene kan alle være gjenstand for variasjon av arter eller belastning.
  2. Fortynne kulturen 2 000-fold ved hjelp av saltvann løsning. Tilsett 100 μL av den fortynnede oppløsningen i 3 50 mL skrulokk koniske bunn polymer rør (50 mL rør) med 10 mL flytende Davis minimal medium (DM, se supplerende tabell 1), som inneholder 80 mg/l, 125 mg/l eller 250 mg/l av glukose. Dette er det samme medium (dvs. miljø) hvor mutasjon rate vil bli anslått. Rist kulturene på 120 RPM over natten ved 37 ° c.
    Merk: Valget av Media er gjenstand for variasjon av arter, belastning, eller forskning spørsmål.

2. dag 2: generering av mutanter i parallelle kulturer

  1. Først forberede miljøer der bakteriene vil bli kultivert. Forbered alltid 10% mer enn nødvendig (dvs. tjue 1 ml kulturer krever 22 mL). Forbered 22 mL 1) DM med 80 mg/L av glukose, 2) DM med 125 mg/L av glukose, 3) DM med 250 mg/L av glukose, 4) DM med 80 mg/l glukose, og 5) DM med 250 mg/L av glukose i 5 50 mL rør. Label dem som GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B, og GLC-250B, henholdsvis.
  2. Forbered inocula for miljøene. Kontroller at inokulum for 1 mL av miljøet inneholder 1000 − 5000 celler. Gjør dette ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Mål den optiske tettheten (OD) av overnight kulturer (fra trinn 1,2) ved 600 NM.
    2. Fortynne hver overnatting kultur for å nå en endelig tetthet på 1000-5000 celler per mL DM med glukose. I våre hender, hvis OD målt i 2.2.1 er 0,3, betyr det å lage en 100-fold fortynning (i saltoppløsning) av natten kulturen, og deretter legge 11μl av denne løsningen til 22 mL miljø.
  3. Forbered parallelle kulturer.
    Merk:     denne protokollen er skrevet for 1 96 dyp brønn plate, utføre fem svingninger analyser (maksimalt rimelig antall på 1 96 brønn plate), ved hjelp av tre miljøer. Med erfaring, flere dype-brønn plater kan kjøres parallelt.
    1. Lag en tilfeldig layout av parallelle kulturer for 1 96 dyp brønn plate. Tilleggs R-skriptet LayoutGenerator. R (se oppsettet i figur 1B) kan brukes til dette. Plasser hver parallell kultur på 96 dyp brønn plate i henhold til oppsettet.
      Merk: Kjører LayoutGenerator. R vil sikre at den første analysen har 20 parallelle kulturer, og at den andre, tredje, fjerde og femte analysene har 19 parallelle kulturer hver.
    2. Transfer 1 mL inokulert Media i hver brønn av en 96 dyp brønn plate i henhold til randomisert layout.
    3. Fest lokket på den dype brønn platen med tapen. Ikke fest lokket tett, fordi kultur veksten er følsom for mengden lufting.
    4. Veie hele platen med lokket og tapen og rist platen ved 250 RPM for 24 timer ved 37 ° c. Plasser 2 L destillert vann i inkubator for å stabilisere mengden av fordampning blant eksperimentelle sett.
  4. Bestem inokulum størrelse ved plating 10 μL av hver av de inokulert mediene på den ikke-selektive Tetrazolium (TA) agar plate (se supplerende tabell 1). Bruk en steril L-formet spre til agar overflaten er tørr. Ruge TA agar plater lokket ned over natten ved 37 ° c.
    Merk: TA agar er en rik agar som inneholder sukker L-arabinose og vannløselige fargestoff 2, 3, 5-triphenyltetrazolium klorid, som er fargeløs i sin oksidert form. Når bakteriene reduserer fargestoffet, blir det rødt på grunn av dannelsen av formazan. Kolonier på TA agar som ikke kan bruke L-arabinose er mørk rød. Andre stammer, for eksempel MG1655, er rosa. Bruk av TA agar snarere enn standard LB agar anbefales fordi fargede bakterie kolonier er lettere å få øye på, noe som gjør koloni telling mer pålitelig og raskere.
  5. Forbered selektiv TA agar som inneholder Rifampicin i 6 brønn plater. Pipetter 5 mL selektiv TA agar i hver brønn av de 6 brønn platene. Forbered antibiotika Rifampicin like før det er lagt til TA agar.
    Merk:     når Cycloserine brukes som en markør, bruk Davis minimal medium med 250 mg/L av glukose supplert med agar og L-arabinose og 2, 3, 5-triphenyltetrazolium klorid som en selektiv agar. Nemlig, tar TA agar ikke velger bare celler som er resistente mot Cycloserine, fordi tryptone og gjærekstrakt (både de essensielle komponentene av TA agar) inneholder aminosyren D-alanin. Denne aminosyren antagonizes den antimikrobielle effekten av Cycloserine og gjør at alle celler til å lage en koloni.
    1. La de selektive og gjenværende ikke-selektive platene være i mørket (f.eks. i en eske) ved romtemperatur.

3. dag 3: plating kulturer på selektiv og ikke-selektiv agar plater

  1. Count koloni forming enheter (CFU) på ikke-selektiv agar platene og bestemme størrelsen på inocula ved å multiplisere CFU av 100. Dette er et forhold mellom et volum av parallell kulturen (1 mL = 1 000 μL) og det belagte volumet (10 μL).
    Merk: Hvis ikke-selektive plater lagres nedkjølt i CFU kan telles senere.
  2. Etter 24 h av inkubasjons, veie hele den dype brønnen plate for å bestemme mengden av fordampning. Dette vil trolig være rundt 10%.
  3. Beregn gjennomsnittlig volum av en parallell kultur etter 24 h av inkubasjons (V[24h]) i mikroliter ved hjelp av et start volum V[0h] = 1 000 μL og plate vekt omdannes til mikroliter, der tettheten av vekst mediet måles i mg/μL. Denne studien bruker en tetthet på 1 mg/μL:
  4. Overfør de tre tilfeldig valgte kulturer per analysen (15 totalt, fremhevet med en svart sirkel i oppsettet i figur 1B) i merket mikrosentrifugen rør. La dem på benken som skal brukes senere (se trinn 3,6) for å bestemme den endelige Befolkningsstørrelsen (eller Nt).
  5. Plate de resterende 81 parallelle kulturer fra den dype brønn plate på selektiv TA agar som inneholder Rifampicin. Pipetter en hel parallell kultur fra 96 dyp brønn plate til en brønn av en 6-brønn plate. Sørg for at enhver 6 brønn plate inneholder parallelle kulturer fra mer enn én svingninger analysen.
    1. Fjern dekslene fra de selektive agar platene, og la avdekket i sterile forhold. Tørk ut all væsken på overflaten av selektiv TA agar.
      Merk: Den agar er helt tørt er kritisk. Imidlertid, ikke overdry det selektiv TA agar, fordi den må ikke være innrømmet å sprekk.
  6. Mens selektiv TA agar platene tørker, noe som kan ta opptil flere timer, bestemme Nt av de 15 kulturene utarbeidet i trinn 3,4 ved hjelp av KOLONI forming enheter (CFU).
    1. Bestem CFU ved å fortynne kulturene fra de mikrosentrifugen rørene. Bruk 5 10-virvlingen for fortynning, miksing og 900 μL av saltvannsoppløsning med 100 μL av kulturen på hvert trinn. Plate 40 μL av siste fortynning (med en fortynnings faktor på 105) på de ikke-selektive ta agar og ruge platene lokket ned over natten ved 37 ° c.
      Merk: Fortynning serien i 96 brønn plater kan utføres med en flerkanals pipette, som kan øke hastigheten på dette trinnet.
  7. Når alle brønnene på en 6 brønn plate er fri for Kultur væsken, Legg lokket på igjen og Plasser de 6 brønn platen med lokket ned på benken til alle de 6 brønn platene er tørre. Når alle er tørre, ruge platene lokket ned ved 37 ° c for 44-48 h.
    Merk: For andre markører (Nalidixic yre, Cycloserine, hygromycin B eller 5-FOA) ruge platene i 68-72 timer. Sørg for at fuktigheten i inkubator er høy. Det er viktig at selektiv agar platene ikke tørker ut i løpet av inkubasjonsperioden.

4. dag 4: fastsettelse av antall celler i kulturer

  1. Telle CFU på ikke-selektiv agar platene. Anslå antall levedyktige celler i kulturen ved å multiplisere CFU med fortynning faktor (105) og forholdet mellom det beregnede gjennomsnittet volum V[24h] i mikroliter (se trinn 3,3) og belagt volum (40 μL):
  2. Nt av en bestemt genotype vokser i et bestemt miljø er gjennomsnittet av disse verdiene fra de tre kulturene.

5. dag 5: estimering av mutasjon rate

  1. Count antall kolonier motstandsdyktig mot antibiotika på selektiv TA agar plater (dvs. antall resistente celler som oppsto gjennom spontan mutasjon i dyp brønn plate på dager 2 − 3). Ta opp fordelingen mellom parallelle kulturer av det observerte antall mutanter for en bestemt analysen (f. eks, 16 eller 17 verdier, inkludert null teller).
    Merk:     hvis selektiv platene oppbevares nedkjølt, kolonier motstandsdyktig mot antibiotika kan telles senere.
    1. Bruk hver fordeling til å estimere antall mutational hendelser, m, ved hjelp av R-package flan36.
      Merk: Det er også R-pakken rSalvador med tilsvarende funksjonalitet29.
    2. Lagre fordelingen av observerte mutanter for en analyse i en tekstfil som en enkelt kolonne.
  2. Bruk Shinyflan programvare (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) til å anslå m som beskrevet nedenfor.
    1. I kategorien hypotese testing la verdier som standard (dvs. Ukjent fitness krysset, estimering metode = Maksimal sannsynlighet (ml), fordeling av mutant Lifetime = eksponentiell (LD-modell), Winsor parameter = 1 024, mutasjon nummer og fitness = 1, Confidence Level = 0,95, antall klasse og maksimal verdi = 100).
    2. Klikk Bla gjennom og velg tekstfilen med fordelingen av observerte mutanter. Prøv først med tilleggs data filen.
    3. Når du har lastet opp filen, klikker du på Utfør test. På høyre side under resultatet av testen, under den ene sample ml-test (ld-modell), Finn mutasjon Number. Dette er m, forventet antall mutational hendelser.
    4. Under 95 prosent tillit intervall for mutasjon Number finne øvre og nedre grense på m.
  3. Når m og Nt (bestemmes av CFU) er tilgjengelige, anslå mutasjon rate av en bestemt genotype i et bestemt miljø som . Dividere øvre og nedre grense på m av Nt på samme måte for å generere tillit intervaller på mutasjon rate (NB dette tar ikke hensyn til usikkerheten i Nt).
    Merk: Resultatene er presentert som mutasjon rate per rpoB geometrisk per generasjon. Mutasjon rate per base pair er generert ved å dele mutasjon rate per rpoB geometrisk sted ved 79, som er vår nåværende kunnskap om hvor mange punkt mutasjoner innenfor en rpoB Gene konferere motstand mot Rifampicin37. Multiplisere mutasjon rate per nukleotid av størrelsen på kromosom (E. coli K-12 MG1655 = 4 639 675 BP), gir mutasjon rate per Genova.
  4. Gjenta trinn 5.1 − 5.3 med de resterende fire svingningene i analysene.

Representative Results

Resultatene ble samlet med den rapporterte protokollen i fire forskjellige uker av tre ulike individuelle forskere, der hver uke en 96 dyp brønn plate ble brukt til å generere fem mutasjon rate anslag. Tilsammen 3 96 dype brønn plater generert 15 mutasjon rate anslag (± 95% sikkerhet intervall, CI) i E. coli k-12 MG1655 (figur 2A, som brukes i protokollen), mens 1 96 Deep Well plate ble brukt til fem anslag (± 95% CI) av E. coli k-12 BW25113 ΔmutT mutant (figur 2B). I figur 2 er median presisjon med interquartile utvalg på m 17,5% (1,00% − 28.9%, n = 20). Presisjon er en koeffisient for variasjonen av forventet antall mutational hendelser (m) beregnet som σm / m x 100% (der σ er beregnet som vist tidligere38). Rådata for figur 2 er tilgjengelig i tilleggsdata filen "Krasovec_etal_JoVE_data. csv". Tilleggs data filen ledsages av et R-skript for å generere figur 2. Se også tilleggs tabell 2 for mer informasjon om bakteriestammer og supplerende tabell 3, der kolonnene i datafilen er forklart. Data punkter ervervet med Rifampicin og Nalidixic syre ble tidligere publisert i Krašovec et al.10 og har samme IDer her som da først publisert.

I figur 2A MG1655 mutasjon utbredelsen av tre forskjellige fenotypiske markører, Cycloserine, Rifampicin, og Nalidixic acid presenteres. Her ble mutasjon ratene vurdert i Davis minimal medium med 80, 125, og 250 mg/L av glukose, som forklart i protokollen. I ett tilfelle ble det brukt 1 000 mg/L av glukose (figur 1B). I praksis kan enhver innledende glukose konsentrasjon brukes. Som forventet var mutasjon ratene høyere for Cycloserine motstand, lavest for Nalidixic yre motstand, og frekvensen av Rifampicin-motstanden var i midten. Dette er i samsvar med de kjente mål størrelsene for disse tre motstander, der den største er for Cycloserine og den minste for Nalidixic yre. Diskusjonen og Figur 3 gi detaljer om hvordan du kan utnytte målet størrelser, volumer av parallelle kulturer, og nivået av næringsstoffer i miljøet for å optimalisere måling av mikrobiell mutasjon priser med svingninger analysen.

Svingningene analysen viser tydelig hvilken belastning er en konstituerende Mutator og som har normal mutasjon priser. Den ΔmutT stamme hadde en ca 50x høyere mutasjon rate til Nalidixic syre resistens (figur 2B) som MG1655 (figur 2A). Men for å bestemme mutasjon rate av en bestemt genotype i ulike miljøer, gjør minst fem replikerer per genotype per miljø ved hjelp av bare én fenotypiske markør anbefales. Hvis du vil ha en detaljert oversikt over de statistiske metodene som tidligere ble brukt til å analysere denne typen eksperiment, kan du se tilleggsinformasjonen i Krašovec et al.10.

Figure 2
Figur 2: representativ figur av mutasjon priser anslått av svingninger analysen i Escherichia coli populasjoner. (A) mutasjon rate som bestemmes av rapporterte protokollen i vill type MG1655 (sirkler). Figuren viser mutasjon priser i nærvær av Rifampicin (lyseblå sirkler), Nalidixic syre (røde sirkler), og Cycloserine (mørkeblå sirkler) motstand. For Nalidixic yre ble større kultur volumer på 10 mL brukt (se tilleggs data fil). Data for Rifampicin og Nalidixic yre er omformet fra figur 2a i Krašovec et al.10. (B) mutasjon rate til Nalidixic syre resistens i Keio39 ΔmutT mutant (rød trekanter). Legg merke til logaritmisk skala på mutasjon rate aksen. Feilfelt = 95% sikkerhets intervaller beregnet som forklart i protokollen. Data er omformet fra Figur 4a i Krašovec et al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: et flytdiagram for feilsøking av svingninger analysen. Flytskjemaet skal følges fra toppen, adressering de tre spørsmålene i den gule diamanter i sin tur, justere protokollen i henhold til innholdet i den resulterende grønne boksene, og implementere protokollen som angitt i den røde ovaler. Se de tre første avsnittene av diskusjonen for mer informasjon om hvordan du feilsøker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende tabell 1: formler for mediene som brukes i protokollen. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).

Tilleggs tabell 2: bakteriestammer. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).

Tilleggs tabell 3: detaljert beskrivelse av kolonnene i den rå datafilen Krasovec_etal_JoVE_data. csv. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).

Tilleggs data filer. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene.

Discussion

Enhver beregning av en mutasjon rate behov for å maksimere presisjonen oppnådd for å sikre repeterbarhet og reproduserbarhet i og mellom studier34. For en svingninger analysen, er det tre kritiske hensyn. De to første er satt i protokollen gitt, men vil trenge feilsøking (se Figur 3) hvis protokollen er tilpasset for å fungere med ulike belastninger eller miljøer. Først er å velge riktig fenotypiske markør. For bakterier, det anbefales å anslå priser på en av to markør Loci, rpoB eller gyrA, overdragelse motstand mot antibiotika Rifampicin og Nalidixic syre, henholdsvis. Målstørrelsen for mutasjoner i antibiotikaresistens ved disse to Loci er forskjellig. Det er 79 og 20 unike mutasjoner overdragelse motstand mot Rifampicin37 og nalidixic acid40 hhv. I praksis betyr dette at i gjennomsnitt, Rifampicin resistente mutanter er mer hyppig observert. Så, det første spørsmålet (Q1 i Figur 3) som må besvares er om belastningen er en Mutator. Når konstituerende mutators er studert, hvor mange observerte mutant kolonier er forventet, er det bedre å bruke en markør med en mindre Målstørrelse (f. eks, Nalidixic syre). Se figur 2B, hvor mutasjon priser på konstituerende Mutator E. coli K-12 BW25113 ΔmutT ble anslått ved hjelp Nalidixic syre som en markør. Når du arbeider med nonmutator bakterielle stammer som har en vill type (dvs. normal) mutasjon rate, Rifampicin er et bedre valg (se figur 2a). Hvis en eller annen grunn mer observert mutanter er nødvendig, er en relevant markør motstand mot en Cycloserine. For denne markøren, kan motstanden mutasjoner dukke opp i mer enn ti gener41, noe som betyr at målstørrelsen er enda større enn for Rifampicin. Når du studerer gjær og Archaea det anbefales å anslå mutasjon priser i 25S ribosomal proteiner og URA3, overdragelse motstand mot hygromycin B og 5-fluoro-orotinsyre acid (5-FOA), henholdsvis.

Den andre kritiske betraktning er volumet av parallelle kulturer. Hvilket volum som skal brukes, avhenger av det faktiske antallet observerte mutanter. Det forventede antallet observerte mutanter er påvirket av målstørrelsen for den valgte fenotypiske markør, belastningen evne til å reparere og unngå mutasjoner (gjennomsnittlig mutasjon rate), og bæreevne av miljøet, som er påvirket både av Media som brukes og kultur volum. Hvis ingen parallelle kulturer inneholder mutant kolonier motstandsdyktig mot Rifampicin, så Cycloserine bør brukes eller antall belagte celler bør økes. Dette kan oppnås ved å legge mer glukose til en minimal medium eller ved voksende celler i et rikere (eller fullstendig) miljø. Men i mange tilfeller er en slik økning i befolkningstettheten forbundet med en reduksjon i mutasjon rente, noe som resulterer i begrenset, om noen, økning i antall muterte kolonier observert10. Hvis øke næringsstoffene ikke er en løsning, og deretter øke antall celler ved å øke volumet av hver parallell kultur er et alternativ. Når miljøet omfatter minimale salter med sukker som den eneste kilden til karbon og energi (det vil si svaret på Q2 i Figur 3 er "minimalt medium"), skal volumene mellom 0,5 og 1,5 ml brukes. Hvis miljøet er rikt, bør volumene av parallelle kulturer være mellom 0.35 − 1 mL. Det siste spørsmålet gjelder median antall resistente kolonier. Hvis for få mutant kolonier er observert (dvs. svaret på Q3 i Figur 3 er 0) og miljøet er ikke å bli modifisert, så volumet av parallelle kulturer bør økes eller antibiotika med en større Målstørrelse (f. eks, Cycloserine) bør brukes. På den annen side, hvis mange muterte kolonier er observert på alle selektive plater (mer enn ~ 150 per plate, se Figur 3), så antall belagte celler bør reduseres, noe som vanligvis betyr å bruke et lavere volum eller bytte til en antibiotika med en mindre Målstørrelse (f. eks, Nalidixic acid).

Når volumet er valgt, er det best at alle parallelle kulturer på 1 96 dyp brønn plate har samme volum. Det gir mer presis bestemmelse av det faktiske volumet av parallelle kulturer fra vekten av platen. Når mutasjon priser på en bestemt genotype sammenlignes mellom ulike miljøer, er det igjen best å bruke samme volum av parallelle kulturer i alle miljøer. Hvis Nalidixic syre brukes for å estimere vill type (dvs. normal) mutasjon priser eller en annen fenotypiske markør brukes som har en enda mindre Målstørrelse enn Nalidixic syre, volumet må økes enda mer. Ett alternativ er å gjøre parallelle kulturer i 50 mL rør med volumer på opp til 15 mL. For eksempel ble 10 mL parallelle kulturer fremstilt i 50 mL rør ved estimering av E. coli K-12 MG1655 mutasjon rate til Nalidixic syre (se figur 2A). Den parallelle 10 mL kulturer ble deretter belagt på selektiv TA agar og helles i store 150 mm plater i stedet for standard 90 mm Petri retter. Ulempen med å forberede parallelle kulturer i 50 mL rør er at gjennomstrømningen er betydelig lavere sammenlignet med assaying mutasjon priser i en 96 dyp brønn plate. En løsning er å redusere antall parallelle kulturer. Men dette vil påvirke presisjonen for anslaget av m, som avhenger av forventet antall mutational hendelser og antall parallelle kulturer26. Å få en fordeling av observerte mutanter med 14 − 17 parallelle kulturer (som ble gjort i figur 2), er en god balanse mellom en solid gjennomstrømning og en akseptabel presisjon nivå26 av 20%. Et median presisjonsnivå på 17,5 er lik median presisjon med et interquartile område på 16,4% (5,7% − 38.9%, n = 580) beregnet fra et mye større datasett10. Derfor er det anbefalt at når du forbereder parallelle kulturer i 96 dype brønn plater eller 50 mL rør fordelingen av observerte mutanter oppnås med minst 14 parallelle kulturer. Når mutasjon priser er anslått i ulike miljøer er det anbefalt å teste presisjon nivåer ved å gjøre et multiplate eksperiment, der alle 96 parallelle kulturer på en plate dyrkes i samme miljø. I tillegg, når du forbereder parallelle kulturer, er det avgjørende at inocula inneholder et lavt antall celler, fordi det reduserer sjansene for eventuelle resistente celler som er tilstede i inokulum. Eksisterende resistente mutanter er ikke ønsket i inokulum, fordi de vil øke i antall og lage en plen på selektive plater og estimering av mutasjon rate vil ikke være mulig. For eksempel, i de fleste nonmutator E. coli populasjoner, mutasjon rate til Rifampicin motstand er i rekkefølgen av ~ 10-8. For å unngå vaksinere av kulturen med en eksisterende, motstandsdyktig mutant, må man derfor vaksinere med færre enn 108 celler (f.eks. 103− 104 celler). Den siste kritiske trinnet er å sikre at før selektiv agar platene er inkubert, overflaten på selektiv agar er helt tørt. Spredere kan ikke brukes hvis 6-brønn plater brukes, og det opprinnelige volumet av en parallell kultur er for eksempel 1 mL. Platene må etterlates avdekket i sterile forhold for å la overflaten væsken tørke ut. Tiden dette tar kan være svært variabel, avhengig av omgivelsesforhold og tilstanden til platene. Denne gangen bør minimeres, men kan være opptil flere timer.

Svingningene analysen har iboende begrensninger. Det analyser fenotypiske markører for mutasjon bare i en liten undergruppe av Genova. Analysen krever derfor store populasjoner som går gjennom et tilstrekkelig antall generasjoner for å observere nok mutasjoner å anslå en sats i det hele tatt. Dette betyr at svingninger analysene kan bare brukes på organismer som er i stand til å gå gjennom et stort antall generasjoner raskt, som bakterier, Baker gjær42, eller væske-kultur pattedyrceller30. Også mutasjoner er sjeldne hendelser som forekommer i de spesifikke biokjemiske omstendighetene i en bestemt celle. Det faktum at svingninger analysene ser over store bestander av celler over tid betyr at disse omstendighetene kan avvike betydelig. Ved hjelp av denne analysen, er det dermed vanskelig å studere progresjon av mutasjon utbredelsen av en bestemt befolkning fra lag fasen til tidlig og sent eksponentiell fase og til slutt til en stasjonær fase. Enhver differensiering av mutasjon priser blant enkeltceller i befolkningen er helt skjult fra svingninger analysen. Dynamikk i enkelt celle mutasjon kan bli studert med en enkelt-molekyl sporing av DNA-reparasjon protein MutS43 eller ved å telle prioriteringer av akkumulerte MutL proteiner44. Nylige fremskritt i høy gjennomstrømming sekvensering har også gjort det mulig å direkte anslå mutasjon priser fra foreldre-avkom trios9,45 og multigeneration stamtavler46. Slike metodisk fremskritt er i ferd med å tillate direkte telling av mutasjoner som forekommer i en enkelt generasjon. Imidlertid, denne direkte adgang nødvendig dyr og begrunne-av-det-kunst teknologiene like fluorescens mikroskopi, materialer, eller hele-Genova sekvensering. På den annen side er svingningene analysen relativt billig og bare standard laboratorieutstyr er nødvendig. Å gjøre flere svingninger analyser vil også lette generering av romanen hypoteser som kan testes med mer direkte enkelt celle tilnærminger.

Det er en langvarig interesse for studiet av mutasjoner, så svingninger analysen vil trolig forbli en mye brukt metode. Antall sitater av banebrytende papiret av Luria og Delbrück5 i de siste 4 årene (2015-2018) har alle vært blant de fem beste for sitater av dette papiret. Men på grunn av en stor mengde presis manuelt arbeid som trengs for riktig gjennomføring av en svingninger analysen, de fleste studier bare gjennomføre en håndfull svingninger analyser. Dette er imidlertid utilstrekkelig for å avdekke de miljømessige avhengighetene i mutasjon rate. Ved å strømlinjeforme svingninger analyser ved hjelp av multiwell plater, som forklart i denne utredningen, dagens maksimale gjennomstrømning mulig er 11 dype brønn plater (55 svingninger analyser) parallelt, som beskrevet her. Kjører to sett med svingninger analyser forskjøvet med en dag i parallell, gjør det mulig å gjennomføre opp til 110 analyser per uke. Et annet skritt endring i gjennomstrømming kan likevel være mulig ved å automatisere ulike trinn av svingningene analysene fra rent manuelle protokollen gitt. Også for å studere miljømessige avhengigheter av mutasjon rate, befolkningstetthet må tas i betraktning. Forrige resultater10 viser at når kjente faktorer som påvirker mutasjon rate er utgjorde, kontrollerende for befolkningstetthet kan redusere variasjon i mutasjon-rate anslag med mer enn 90%. For å kontrollere tettheten, anbefaler vi at Nt (brukes for å estimere mutasjon rate) bestemmes uavhengig av metoden som brukes for å bestemme befolkningstetthet. I bakterier, kan Nt bestemmes av CFU og tetthet, for eksempel, med en ATP-basert luminescence analysen10.

Høy gjennomstrømming og kontrollerende tetthet er både viktig når man studerer hvordan kroppens økologiske kontekst påvirker spontan mutasjon rate. Å vite eksistensen av mutasjon rate plastisitet er viktig, men forståelsen dens årsaker og effekter er viktige utfordringer som må oppfylles hvis mutasjon rate plastisitet er å bli innlemmet i en bredere biologisk sammenheng. Svingningene analysen er et flott verktøy som kan brukes til å teste mange hypoteser, fordi resultatene er innhentet raskt, og analysene er rimelig i forhold til andre metoder. Scenen er satt, for eksempel, for å studere miljømessige avhengigheter av mutasjon rate i bakterielle lokalsamfunn og microbiomes. Tilpasning av svingninger analysen til cocultures kan teste hypotesen at stammer påvirke hverandres mutasjon priser via små molekyler. Gjøre tusenvis av svingninger analyser med cocultures kan avgjøre om belastninger varierer både i deres evne til å endre hverandres mutasjon priser og i sin mottakelighet for å få sin mutasjon rate endret av andre. Kanskje variasjon blant stammer i mottakelighet for mutasjon rate manipulasjon er knyttet til spesifikke genetiske varianten. Dette kan forvandle våre synspunkter på hvordan evolusjon fungerer i komplekse samfunn, ikke minst i eksempler på stor betydning som hvordan antimikrobielle motstanden framgår.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

RK ble støttet av BB/M020975/1 og University of Manchester School of Biological Sciences. HR ble støttet av BB/J014478/1. GG ble støttet av BBSRC doktorgrads trening partnerskap BB/M011208/1. DRG ble støttet av UKRI Award nummer MR/R024936/1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge tubes Starlab International GmbH S1615-5550
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich T8877-10g
6-well plates Greiner Bio-One REF 657102
90 mm Petri Dishes Triple Vented ThermoFisher Scientific REF 120189
96 deep-well plate (Masterblock 2 mL) Greiner Bio-One REF 780270
Ammonium sulfate Fisher Chemical A/6440/53
Bacto Agar Becton, Dickinson and Company REF 214010
Bacto yeast extract Becton, Dickinson and Company REF 212750
Cycloserine Sigma-Aldrich 1158005-250MG Only for assaying an alternative phenotypic marker
D-Glucose anhydrous Fisher Chemical G/0500/61
50 mL Centrifuge Tube Corning REF 430828
L-(+)-Arabinose Sigma-Aldrich A3256-500g
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Chemical M/1050/53
Nalidixic acid Sigma-Aldrich N8878-5G Only for assaying an alternative phenotypic marker
Potassium phosphate dibasic trihydrate Sigma-Aldrich P5504-500g
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662-500g
Rifampicin EMD Millipore Corp, USA 557303-1GM
Sodium chloride Fisher Chemical S/3160/60
Spectophotometer Jenway 6320D
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625-25g
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804-500g
Tryptone Fisher Chemical 1278-7099

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Vries, H. Die mutationstheorie. Versuche und beobachtungen über die entstehung von arten im pflanzenreich. 1, Leipzig, Veit. (1901).
  2. Muller, H. J. Artificial transmutation of the gene. Science. 66 (1699), (1927).
  3. Muller, H. J. The measurement of gene mutation rate in Drosophila, its high variability, and its dependence upon temperature. Genetics. 13 (4), 279-357 (1928).
  4. Sturtevant, A. H. Essays on evolution. I. On the effects of selection on mutation rate. The Quarterly Review of Biology. 12 (4), 464-467 (1937).
  5. Luria, S. E., Delbrück, M. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics. 28 (6), 491-511 (1943).
  6. Jee, J., et al. Rates and mechanisms of bacterial mutagenesis from maximum-depth sequencing. Nature. 534 (7609), 693-696 (2016).
  7. Fusco, D., Gralka, M., Kayser, J., Anderson, A., Hallatschek, O. Excess of mutational jackpot events in expanding populations revealed by spatial Luria-Delbrück experiments. Nature Communications. 7, (2016).
  8. Halligan, D. L., Keightley, P. D. Spontaneous mutation accumulation studies in evolutionary genetics. Annual Review of Ecology Evolution and Systematics. 40 (1), 151-172 (2009).
  9. Jónsson, H., et al. Parental influence on human germline de novo mutations in 1,548 trios from Iceland. Nature. 549, (2017).
  10. Krašovec, R., et al. Spontaneous mutation rate is a plastic trait associated with population density across domains of life. PLoS Biology. 15 (8), (2017).
  11. Krašovec, R., et al. Mutation rate plasticity in rifampicin resistance depends on Escherichia coli cell-cell interactions. Nature Communications. 5, 3742 (2014).
  12. Massey, R. C., Buckling, A. Environmental regulation of mutation rates at specific sites. Trends in Microbiology. 10 (12), 580-584 (2002).
  13. Lynch, M., et al. Genetic drift, selection and the evolution of the mutation rate. Nature Review Genetics. 17 (11), 704-714 (2016).
  14. Foster, P. L. Stress-induced mutagenesis in bacteria. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 42 (5), 373-397 (2007).
  15. Krašovec, R., et al. Where antibiotic resistance mutations meet quorum-sensing. Microbial Cell. 1 (7), 250-252 (2014).
  16. Krašovec, R., et al. Opposing effects of final population density and stress on Escherichia coli mutation rate. The ISME Journal-Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 12, 2981-2987 (2018).
  17. Lea, D., Coulson, C. The distribution of the numbers of mutants in bacterial populations. Journal of Genetics. 49 (3), 264-285 (1949).
  18. Armitage, P. The statistical theory of bacterial populations subject to mutation. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological. 14 (1), 1-40 (1952).
  19. Koch, A. L. Mutation and growth rates from Luria-Delbrück fluctuation tests). Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 95 (2-3), 129-143 (1982).
  20. Cairns, J., Overbaugh, J., Miller, S. The origin of mutants. Nature. 335 (6186), 142-145 (1988).
  21. Stewart, F. M., Gordon, D. M., Levin, B. R. Fluctuation analysis: the probability distribution of the number of mutants under different conditions. Genetics. 124 (1), 175-185 (1990).
  22. Drake, J. W. A constant rate of spontaneous mutation in DNA-based microbes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (16), 7160-7164 (1991).
  23. Ma, W. T., Sandri, G. V., Sarkar, S. Analysis of the Luria-Delbrück distribution using discrete convolution powers. Journal of Applied Probability. 29 (2), 255-267 (1992).
  24. Shapiro, J. A. Adaptive mutation - Who's really in the garden. Science. 268 (5209), 373-374 (1995).
  25. Matic, I., et al. Highly variable mutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli. Science. 277 (5333), 1833-1834 (1997).
  26. Rosche, W. A., Foster, P. L. Determining mutation rates in bacterial populations. Methods. 20 (1), 4-17 (2000).
  27. Rosenberg, S. M. Evolving responsively: Adaptive mutation. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 504-515 (2001).
  28. Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends in Genetics. 26 (8), 345-352 (2010).
  29. Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbrück protocol. Mutation Research. 781, 7-13 (2015).
  30. Boesen, J. J. B., Niericker, M. J., Dieteren, N., Simons, J. How variable is a spontaneous mutation-rate in cultured-mammalian-cells. Mutation Research. 307 (1), 121-129 (1994).
  31. Melnyk, A. H., Wong, A., Kassen, R. The fitness costs of antibiotic resistance mutations. Evolutionary Applications. 8 (3), 273-283 (2015).
  32. Sun, L., et al. Effective polyploidy causes phenotypic delay and influences bacterial evolvability. PLoS Biology. 16 (2), (2018).
  33. Frenoy, A., Bonhoeffer, S. Death and population dynamics affect mutation rate estimates and evolvability under stress in bacteria. PLoS Biology. 16 (5), (2018).
  34. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods in Enzymology. , 195-213 (2006).
  35. Wrande, M., Roth, J. R., Hughes, D. Accumulation of mutants in "aging" bacterial colonies is due to growth under selection, not stress-induced mutagenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11863-11868 (2008).
  36. Adrien, M., Rémy, D., Stéphane, D., Bernard, Y. flan: An R package for inference on mutation models. The R Journal. 9. 334, (2017).
  37. Garibyan, L., et al. Use of the rpoB gene to determine the specificity of base substitution mutations on the Escherichia coli chromosome. DNA Repair. 2 (5), 593-608 (2003).
  38. Stewart, F. M. Fluctuation tests: how reliable are the estimates of mutation rates? Genetics. 137 (4), 1139-1146 (1994).
  39. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2 (1), (2006).
  40. Yamagishi, J. -I., Yoshida, H., Yamayoshi, M., Nakamura, S. Nalidixic acid-resistant mutations of the gyrB gene of Escherichia coli. Molecular and General Genetics MGG. 204 (3), 367-373 (1986).
  41. Chen, J., et al. Identification of novel mutations associated with cycloserine resistance in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (12), 3272-3276 (2017).
  42. Lang, G. I., Murray, A. W. Estimating the per-base-pair mutation rate in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 178 (1), 67-82 (2008).
  43. Uphoff, S., et al. Stochastic activation of a DNA damage response causes cell-to-cell mutation rate variation. Science. 351 (6277), 1094-1097 (2016).
  44. Robert, L., et al. Mutation dynamics and fitness effects followed in single cells. Science. 359 (6381), 1283-1286 (2018).
  45. Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father/'s age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
  46. Narasimhan, V. M., et al. Estimating the human mutation rate from autozygous segments reveals population differences in human mutational processes. Nature Communications. 8 (1), 303 (2017).

Tags

Genetikk spontane mutasjoner mutasjon rate plastisitet stress-indusert mutagenese Luria-Delbrück distribusjon maksimal sannsynlighet vurdering celle-celle interaksjoner antimikrobielle motstand bakterier
Måle mikrobiell mutasjon priser med svingninger analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krašovec, R., Richards, H.,… More

Krašovec, R., Richards, H., Gomez, G., Gifford, D. R., Mazoyer, A., Knight, C. G. Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay. J. Vis. Exp. (153), e60406, doi:10.3791/60406 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter