Summary
Ici, nous présentons un protocole pour induire l'hypertension oculaire et la neurodégénérescence glaucomatous dans les yeux de souris par injection intracamérale d'huile de silicone et la procédure pour l'enlèvement d'huile de silicone de la chambre antérieure pour retourner la pression intraoculaire élevée à Normal.
Abstract
La pression intraoculaire élevée (IOP) est un facteur de risque bien documenté pour le glaucome. Ici nous décrivons une méthode nouvelle et efficace pour induire uniformément l'élévation stable d'IOP chez les souris qui imite la complication postopératoire d'utiliser l'huile de silicone (SO) comme agent de tamponade dans la chirurgie vitréoretinal humaine. Dans ce protocole, SO est injecté dans la chambre antérieure de l'œil de la souris pour bloquer la pupille et prévenir l'afflux d'humour aqueuse. La chambre postérieure accumule l'humour aqueuse et ceci augmente à son tour l'IOP du segment postérieur. Une seule injection de SO produit une élévation IOP fiable, suffisante et stable, ce qui induit une neurodégénérescence glaucomatous significative. Ce modèle est une véritable réplique du glaucome secondaire dans la clinique de l'œil. Pour imiter davantage le cadre clinique, SO peut être retiré de la chambre antérieure pour rouvrir la voie de drainage et permettre l'entrée de l'humour aqueux, qui est drainé par le maillage trabeculaire (TM) à l'angle de la chambre antérieure. Parce que L'IOP revient rapidement à la normale, le modèle peut être utilisé pour tester l'effet de l'abaissement de l'IOP sur les cellules ganglionnaires rétiniennes glaucomatous. Cette méthode est simple, ne nécessite pas d'équipement spécial ou de procédures répétées, simule de près des situations cliniques et peut s'appliquer à diverses espèces animales. Cependant, des modifications mineures peuvent être nécessaires.
Introduction
La perte progressive des cellules de ganglion rétinien (RGCs) et de leurs axones est la marque du glaucome, une maladie neurodégénérative commune dans la rétine1. Elle touchera plus de 100 millions de personnes âgées de 40 à 80 ans d'ici 20402. L'IOP demeure le seul facteur de risque modifiable dans le développement et la progression du glaucome. Afin d'explorer la pathogénie, la progression, et les traitements potentiels du glaucome, un modèle expérimental fiable, reproductible, et inductible d'hypertension oculaire/glaucome expérimental qui reproduit des dispositifs principaux des patients humains est impératif.
IOP dépend de l'entrée d'humour aqueuse à la chambre antérieure du corps ciliaire dans la chambre postérieure et l'écoulement par le maillage trabecular (TM) à l'angle de la chambre antérieure. En atteignant un état stable, IOP est maintenu. Lorsque l'afflux dépasse ou est inférieur à l'écoulement, iOP augmente ou diminue respectivement. En diminuant l'écoulement aqueux soit en occlouant l'angle de la chambre antérieure, soit en endommageant le TM, plusieurs modèles de glaucome ont été établis3,4,5,6,7,8,9,10. Ces modèles sont normalement associés aux dommages oculaires irréversibles de tissu, et le Haut IOP dans la chambre antérieure cause également des complications non désirées telles que l'oedème cornéen et l'inflammation intraoculaire, qui rendent l'imagerie rétinienne et les essais visuels de fonction difficiles à exécuter et à interpréter.
Pour développer un modèle qui surmonte ces lacunes, nous nous sommes concentrés sur le glaucome secondaire bien-documenté provoqué par l'huile de silicone (SO) qui se produit comme complication postopératoire de la chirurgie vitréorétine humaine11,12. SO est utilisé comme tamponnade dans les chirurgies rétiniennes en raison de sa haute tension de surface. Cependant, SO peut obstruer physiquement la pupille parce qu'elle est plus légère que les fluides aqueux et vitreux, ce qui empêche l'écoulement aqueux dans la chambre antérieure. L'obstruction provoque l'élévation d'IOP dans la chambre postérieure due à l'accumulation aqueuse d'humour. Ceci nous a motivés pour développer et caractériser un modèle de souris oculaire nouvelle d'hypertension basée sur l'injection intracamérale de SO et le bloc pupillaire13,avec des dispositifs principaux du glaucome secondaire : bloc pupillaire efficace, élévation significative d'IOP qui peut revenir à la normale après le déplacement de SO, et neurodegeneration glaucomatous.
Ici nous présentons un protocole détaillé pour l'hypertension oculaire SO-induite dans l'oeil de souris, y compris l'injection et le déplacement de SO et la mesure d'IOP.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université Stanford.
1. Induction d'hypertension oculaire par injection intracamérale de SO
- Préparer une micropipette en verre pour l'injection intracamérale SO en tirant un capillaire en verre avec un puller pipette pour générer une micropipette. Couper une ouverture à l'extrémité de la micropipette et aiguiser davantage la pointe à l'aide d'une machine à beveling microgrinder pour faire un bevel de 35 à 40 degrés.
- Polir les bords du bevel et enlever tous les débris en les lavant à l'eau. Autoclave la micropipette avant utilisation.
- Préparer l'aiguille paracentesis pour l'entrée cornéenne. Pour ce faire, attachez une aiguille de 32 G à une seringue de 5 ml sur une serrure Luer, et fixez-la avec du ruban adhésif. Pliez l'extrémité du bevel d'aiguille vers le haut à 30 degrés.
- Préparer l'injecteur SO en attachant et en fixant une aiguille émoussée de 18 G sur une seringue de 10 ml d'abord. Puis attachez un tube en plastique avec l'aiguille de 18 G sur une extrémité et remplissez avec SO au besoin à travers l'autre extrémité.
- Fixez la micropipette stérilisée au tube en plastique et poussez le piston de seringue pour remplir la micropipette entière avec SO.
2. Injection intracamérale SO pour un œil
- Placer une souris C57B6/J mâle de 9 à 10 semaines dans une chambre d'induction avec 3 % d'isoflurane mélangé à de l'oxygène à 2 L/min pendant 3 min.
- Injectez intraperitoneally 2,2,2-tribromoethanol à 0.3 mg/g de poids corporel.
REMARQUE : Contrairement à la kétamine/xylazine, le 2,2,2-tribromoethanol ne cause pas de dilatation évidente de la pupille. - Vérifiez l'absence de réponse à une pincée d'orteil et le manque de mouvement des moustaches ou de la queue pour déterminer la force anesthésique.
- Placez la souris en position latérale sur une plate-forme de chirurgie. Pour réduire sa sensibilité pendant la procédure, appliquer une goutte d'hydrochlorure de proparacaïne de 0,5% à la cornée avant l'injection.
- Faire une incision d'entrée avec l'aiguille de paracentesis de 32 G au quadrant superotemporal, environ 0.5 mm du limbus.
- Tunnel à travers les couches de la cornée pendant environ 0,3 mm avant de percer dans la chambre antérieure. Veillez à ne pas toucher la lentille ou l'iris.
- Retirez l'aiguille lentement pour libérer un peu d'humour aqueux (environ 1/2 l) de la chambre antérieure à travers le tunnel (paracentesis).
- Attendez 8 min pour diminuer davantage l'IOP. Ceci peut être déterminé en mesurant l'œil contralatéral et de contrôle.
- Insérez la micropipette en verre préchargée avec SO à travers le tunnel cornéen dans la chambre antérieure, avec le biseau faisant face à la surface de l'iris.
- Poussez le piston de seringue lentement pour injecter SO dans la chambre antérieure jusqu'à ce que la gouttelette SO couvre la majeure partie de la surface de l'iris, de 2,3 à 2,4 mm de diamètre.
- Laisser la micropipette dans la chambre antérieure pendant 10 s de plus avant de la retirer lentement.
- Poussez doucement la paupière supérieure pour fermer l'incision de cornée pour minimiser les fuites SO.
- Appliquer de l'onguent antibiotique (bacitracin-néomycine-polymyxine) à la surface des yeux.
- Tout au long de la procédure, humidifier fréquemment la cornée avec des larmes artificielles.
- Gardez la souris sur le coussin chauffant jusqu'à ce qu'elle soit complètement récupérée de l'anesthésie.
3. So suppression
- Préparer le système d'irrigation.
- Préparer la solution d'irrigation selon les instructions du fabricant et la placer dans la bouteille d'irrigation. Élever la bouteille de solution d'irrigation à 110 à 120 cm (81 à 88 mmHg) au-dessus de la plate-forme de chirurgie.
- Fixez un ensemble d'administration IV à la bouteille de solution d'irrigation. Retirez les bulles d'air du tube IV. Connectez une aiguille de 33 G pliée à 20 degrés face jusqu'à la tubulure IV.
- Pour préparer le système de drainage, retirer le piston d'une seringue de 1 ml. Fixez une aiguille de 33 G à la seringue et pliez l'aiguille à 20 degrés.
- Retirer SO de la chambre antérieure.
- Injectez par voie intrapéritone 2,2,2-tribromoéthanol (0,3 mg/g de poids corporel). Vérifiez l'absence de réponse à la pince de l'orteil pour déterminer la force anesthésique et le manque de mouvement des moustaches ou de la queue.
- Placez la souris sur une plate-forme de chirurgie et fixez-la en position latérale avec du ruban adhésif. Appliquer une goutte d'hydrochlorure de proparacaïne de 0,5 % sur la cornée pour réduire sa sensibilité.
- Faire deux incisions dans le quadrant temporel de la cornée entre 2 et 5 heures au bord de la gouttelette SO à l'aide de l'aiguille préfabriquée de 32 G paracentesis.
- Insérez une aiguille d'irrigation de 33 G reliée à la solution d'irrigation par une incision cornéenne, vitesse maximale.
- Insérez une autre aiguille de drainage de 33 G attachée à la seringue sans piston à travers l'autre incision cornéenne pour permettre à la gouttelette SO de sortir de la chambre antérieure tout en irriguant avec la solution d'irrigation.
- Retirez l'aiguille de drainage, puis l'aiguille d'irrigation.
- Injecter une bulle d'air dans la chambre antérieure pour maintenir sa profondeur normale et presser pour fermer l'incision cornéenne.
- Appliquer une pommade antibiotique sur les deux yeux.
- Gardez la souris sur le coussin chauffant jusqu'à ce qu'elle soit complètement récupérée de l'anesthésie.
4. Mesure IOP une fois par semaine
- Placer la souris dans une chambre d'induction perfusée avec 3% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène à 2L/min pendant 3 min.
- Injecter intrapéritonement de la xylazine et de la kétamine (0,01 mg xylazine/g, 0,08 mg de kétamine/g).
- Gardez la cornée humide en appliquant des larmes artificielles tout au long de la procédure.
- Attendez environ 15 min pour permettre à la pupille de se dilater complètement.
- Mesurez l'IOP des deux yeux à l'aide d'un tonomètre selon les instructions du produit. Apportez le tonomètre près de l'œil de la souris. Gardez la distance entre la pointe de la sonde et la cornée de la souris à environ 3 x 4 mm. Appuyez sur le bouton de mesure 6x pour générer une lecture. Trois lectures générées par la machine sont obtenues de chaque œil pour acquérir la moyenne IOP.
- Sacrifiez les animaux à 8 semaines après l'injection de SO et exécutez l'immunohistochimie de la rétine de monture entière, du comptage de RGC, des sections semi-minces de nerf optique (ON), et de la quantification des axones survivants, qui ont été décrits avant13.
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Representative Results
Peu de temps après l'injection, nous pouvons facilement identifier les souris qui ne produisent pas d'hypertension oculaire stable en raison des gouttelettes SO étant trop petites (1,5 mm)13. Ces animaux sont exclus des expériences ultérieures. Après les procédures d'injection, plus de 80% des souris injectées SO se retrouvent avec des gouttelettes de plus de 1,6 mm. Nous avons mesuré l'IOP de ces yeux de souris une fois par semaine pendant 8 semaines après une seule injection de SO. L'IOP de l'œil recevant SO est resté élevé, généralement le double de l'IOP de l'œil de contrôle contralatéral, indiquant le blocage efficace de la pupille (Figure 1). L'œdème dans la cornée de souris peut être vérifié sous un microscope de dissection légère après une injection intracamérale qui prend normalement 2/3 jours pour la récupération. La dilatation de la pupille prend du temps, et il faut attendre la dilatation de la pupille avant de prendre la mesure IOP. Ainsi, nous essayons de ne pas mesurer l'IOP trop tôt après une injection. Pour la même raison, nous ne recommandons pas de mesurer trop souvent l'IOP. Avec un autre groupe de souris, nous avons vidé l'OSE de la chambre antérieure 2 semaines après l'injection SO, et nous avons attendu une autre semaine pour permettre à la cornée de récupérer avant de mesurer IOP, qui a stabilisé retourné l'IOP à la normale (Figure 1).
Pour déterminer les effets de l'hypertension oculaire induite par l'injection de SO sur des RGCs, nous avons quantifié les somatas survivants de RGC dans les régions périphériques des wholemounts rétiniens par RBPMS tacher14,15 et les axones survivants dans les sections transversales semi-minces de l'ON par la coloration PPD16 à 8 semaines après l'injection de SO. La mort glaucomatous de RGC et la dégénérescence d'axone étaient dramatiques dans les yeux sous-détectés sous-détectés d'hypertension SO-induits (SOHU) (figure 2). Plus de détails à ce sujet sont fournis dans la section de discussion.
Figure 1 : Mesures de l'IOP dans les yeux SO et les yeux de contrôle contralatéral, avec ou sans suppression de SO. SO - SO yeux injectés; CL - yeux de contrôle contralatéral. Les données sont présentées comme des moyens : S.E.M, n 12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Soma et dégénérescence glaucomatous de RGC dans SOHU. (A) Panneau supérieur dépeint la région périphérique montrant des RGC (RBPMSMD, rouge) à 8 semaines après l'injection de rétines entièrement montées. Barre d'échelle de 20 m. Le panneau inférieur représente des images semi-minces de sections transversales de l'ON tachées de PPD à 8 semaines après l'injection de SO. Barre d'échelle de 10 m. (B) Données de quantification des RGC survivants dans la rétine périphérique (n - 12) et les axones dans l'ON (n - 10) à 8 semaines après l'injection so par rapport aux yeux de contrôle contralatéral (CL). Les données sont présentées comme des moyens : P 'lt; 0.0001; Test t apparié de l'étudiant. RGC - cellule de ganglion rétinien; ON nerf optique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici nous démontrons une procédure simple mais efficace pour induire l'élévation soutenue d'IOP dans l'oeil de souris par injection intracamérale de SO. Cette procédure peut être apprise rapidement par toute personne ayant de l'expérience en microdissection au microscope. Le principal risque potentiel d'échec est la fuite de SO de l'incision cornéenne. Cependant, l'un des avantages de l'utilisation de SO est que parce que la gouttelette d'huile est visible et mesurable, nous pouvons facilement identifier les souris qui ont reçu des gouttelettes trop petites pour induire une hypertension oculaire stable peu de temps après l'injection et les exclure des expériences ultérieures. Nous avons régulièrement atteint un taux de réussite de 80% et exclu environ 20% des souris en raison d'une petite gouttelette SO (1,5 mm)13. Cependant, un chirurgien expérimenté qui peut faire un tunnel relativement long (0,3 mm) dans les couches de la cornée avant de pénétrer la cornée dans la chambre antérieure avec la pointe biseautée peut presque empêcher toute fuite SO en rendant l'ouverture intérieure du tunnel cornéen beaucoup plus petit que l'ouverture extérieure. Par conséquent, presque toutes les souris ont été injectées avec une gouttelette SO de plus de 1,8 mm. En plus de la longueur du tunnel, d'autres points critiques méritent d'être soulignés. Tout d'abord, il est important de garder l'IOP bas dans l'œil injecté pour éviter de pousser l'SO hors de la chambre antérieure. Une erreur commune est d'injecter trop de SO, ce qui rend les fuites plus faciles. Nous limitons le volume de SO dans la chambre antérieure de sorte qu'il couvre presque, mais pas entièrement, la surface de l'iris. Le diamètre de cette gouttelette SO est de 2,3 à 2,4 mm. Deuxièmement, l'incision du tunnel cornéen est faite aussi près que possible du limbe pour permettre à l'incision de s'approcher de l'iris, mais pas de le blesser, de sorte que l'iris peut facilement prendre l'incision. Troisièmement, la vitesse d'injection doit être aussi lente que possible pour éviter un débordement excessif de SO dans la chambre antérieure. Quatrièmement, le massage supérieur des paupières après l'injection aide l'incision cornéenne à se fermer et aide parfois la synechiae antérieure de l'iris périphérique à fermer l'incision cornéenne, et donc à éviter les fuites d'huile.
Il ya une augmentation de l'IOP que dans la partie postérieure de l'œil, mais pas dans la chambre antérieure, ce qui en fait une caractéristique unique de ce modèle. Le blocage des pupilles empêche l'entrée d'humour aqueuse dans la chambre antérieure et augmente donc IOP seulement dans la partie postérieure. La barrière physique formée par l'OSE avec l'iris et la grande lentille oculaire peut déconnecter la chambre antérieure du segment postérieur, ce qui peut limiter l'élévation de l'IOP seulement dans le segment postérieur, où le matériau aqueux s'accumule. Lorsque la pupille de souris est plus grande que la gouttelette SO après la dilatation, les chambres antérieures et postérieures sont reconnectées, permettant une augmentation rapide de l'IOP dans la chambre antérieure par une inondation aqueuse en elle. Par conséquent, un tonomètre ne peut détecter l'augmentation de la PIO après avoir enlevé le bloc pupillaire, de sorte que le vrai PIO dans le segment postérieur est sans aucun doute sous-estimé. Par conséquent, nous avons nommé ce modèle le modèle sous-détecté sous-détecté par l'hypertension oculaire so-induite (SOHU), qui reflète plus précisément et utilement cette caractéristique clé du modèle. Il serait préférable de pouvoir mesurer directement l'IOP dans le segment postérieur, mais jusqu'à présent, ce n'est pas possible. Cette pathogénie unique du modèle SOHU a deux caractéristiques avantageuses : premièrement, les yeux expérimentaux ont des éléments oculaires clairs qui permettent l'évaluation in vivo de la fonction visuelle et de la morphologie et deuxièmement, la neurodégénérescence glaucontous sévère permet de détecter tout avantage de tester les neuroprotecteurs.
So injection peut causer un oedème cornéen temporairement et nous recommandons de ne pas effectuer de mesures IOP trop tôt ou trop souvent. Nous n'avons détecté aucune inflammation dans la chambre antérieure ou la cornée dans les yeux de SOHU, bien que nous ayons rencontré deux cas de néovascularisation de cornée dans les plus de 100 souris recevant des injections de SO.
Puisque SO cause l'hypertension oculaire dans les patients humains et les souris, il est raisonnable de postuler que ce modèle conceptuelment nouveau et pratiquement significatif de glaucome peut être adapté pour de plus grands animaux qui sont plus appropriés pour des applications précliniques. La caractérisation des déficits dans la fonction neuronale et la morphologie de ce modèle encouragera certainement d'autres chercheurs à en profiter pour poursuivre des questions importantes concernant le glaucome et, plus largement, les maladies qui induisons RGC et ON Dégénérescence.
En résumé, il s'agit d'un modèle simple de glaucome animal qui ne nécessite pas d'équipement spécial ou de blessures répétées et qui peut s'appliquer à d'autres espèces animales. Intriguant, l'élévation d'IOP du modèle de SOHU peut être renversée en enlevant l'huile de la chambre antérieure, ainsi il est utile pour le criblage du traitement neuroprotective combiné avec des thérapies d'abaissement d'IOP.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par les subventions des NIH EY024932, EY023295, et EY028106 à YH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
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