Summary
Qui, presentiamo un protocollo per indurre ipertensione oculare e neurodegenerazione glaucomatosa negli occhi del topo mediante iniezione intracamerale di olio di silicone e la procedura per la rimozione dell'olio di silicone dalla camera anteriore per restituire una pressione intraoculare elevata a Normale.
Abstract
L'elevata pressione intraoculare (IOP) è un fattore di rischio ben documentato per il glaucoma. Qui descriviamo un nuovo metodo efficace per indurre costantemente l'elevazione stabile dell'IOP nei topi che imita la complicazione post-operatoria dell'uso dell'olio di silicone (SO) come agente tamponamento nella chirurgia vitreoretinica umana. In questo protocollo, SO viene iniettato nella camera anteriore dell'occhio del mouse per bloccare la pupilla e prevenire l'afflusso di umorismo acquoso. La camera posteriore accumula umorismo acquoso e questo a sua volta aumenta l'IOP del segmento posteriore. Una singola iniezione di SO produce un'altitudine IOP affidabile, sufficiente e stabile, che induce una significativa neurodegenerazione glaucomatosa. Questo modello è una vera replica del glaucoma secondario nella clinica oculistica. Per imitare ulteriormente l'ambiente clinico, SO può essere rimosso dalla camera anteriore per riaprire il percorso di drenaggio e consentire l'afflusso di umorismo acquoso, che viene drenato attraverso la rete trabecolare (TM) all'angolo della camera anteriore. Poiché IOP torna rapidamente alla normalità, il modello può essere utilizzato per testare l'effetto dell'abbassamento di IOP sulle cellule gangliari della retina glaucomatous. Questo metodo è semplice, non richiede attrezzature speciali o procedure di ripetizione, simula da vicino situazioni cliniche e può essere applicabile a diverse specie animali. Tuttavia, potrebbero essere necessarie modifiche minori.
Introduction
La progressiva perdita di cellule gangliari retiniche (RGC) e dei loro assoni è il segno distintivo del glaucoma, una malattia neurodegenerativa comune nella retina1. Colpisce più di 100 milioni di individui di età superiore ai 40-80 anni entro il 20402. L'IOP rimane l'unico fattore di rischio modificabile nello sviluppo e nella progressione del glaucoma. Per esplorare la patogenesi, la progressione e i potenziali trattamenti del glaucoma, è imperativo un modello sperimentale affidabile, riproducibile e inducibile di ipertensione/glaucoma sperimentale.
IOP dipende dall'afflusso di umorismo acquoso alla camera anteriore dal corpo ciliario nella camera posteriore e dal deflusso attraverso la mesh trabecolare (TM) all'angolo della camera anteriore. Al raggiungimento di uno stato stabile, IOP viene mantenuto. Quando il flusso in ingresso supera o è inferiore al deflusso, IOP aumenta o scende rispettivamente. Diminuendo il deflusso acquoso sia occludendo l'angolo della camera anteriore o danneggiando la TM, diversi modelli di glaucoma sono stati stabiliti3,4,5,6,7,8,9,10. Questi modelli sono normalmente associati a danni irreversibili ai tessuti oculari, e l'alto IOP nella camera anteriore causa anche complicazioni indesiderate come l'edema corneale e l'infiammazione intraoculare, che rendono difficile eseguire e interpretare l'imaging retinico e i saggi delle funzioni visive.
Per sviluppare un modello che superi queste carenze, ci siamo concentrati sul glaucoma secondario ben dichiarato causato dall'olio di silicone (SO) che si verifica come una complicanza postoperatoria della chirurgia vitreoretinica umana11,12. SO è usato come tamponadio in interventi chirurgici alla retina a causa della sua alta tensione superficiale. Tuttavia, SO può fisicamente occludere la pupilla perché è più leggera dei fluidi acquosi e vitrei, che impedisce il flusso acquoso nella camera anteriore. L'ostruzione causa l'elevazione di IOP nella camera posteriore a causa dell'accumulo di umorismo acquoso. Questo ci ha motivati a sviluppare e caratterizzare un nuovo modello di topo di ipertensione oculare basato su iniezione intracamerale SO e blocco pupillare13, con caratteristiche chiave del glaucoma secondario: blocco pupillare efficace, significativa elevazione IOP che può tornare alla normalità dopo la rimozione di SO, e neurodegenerazione glaucomatous.
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'ipertensione oculare indotta da SO nell'occhio del topo, tra cui l'iniezione e la rimozione di SO e la misurazione IOP.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University.
1. Induzione dell'ipertensione oculare mediante iniezione intracamerale di SO
- Preparare una micropipetta di vetro per l'iniezione intracamerale SO tirando un capillare di vetro con un tiratore pipetta per generare una micropipetta. Tagliare un'apertura sulla punta della micropipetta e affilare ulteriormente la punta con una macchina a sferzatura microgrinder per fare una sferzata di 35-40 gradi.
- Polacco i bordi della svegliata e rimuovere tutti i detriti lavando con acqua. Autoclave la micropipetta prima dell'uso.
- Preparare l'ago della paracentesi per l'ingresso corneale. Per farlo, attaccare un ago da 32 G a una siringa da 5 mL su una serratura Luer e fissarlo ulteriormente con del nastro adesivo. Piegare la punta di smusso dell'ago a faccia in su a 30 gradi.
- Preparare l'iniettore SO attaccando e fissando un ago di estremità smussata 18 G su una siringa da 10 mL prima. Quindi collegare un tubo di plastica con l'ago 18 G su un'estremità e riempire con SO come necessario attraverso l'altra estremità.
- Attaccare la micropipetta sterilizzata al tubo di plastica e spingere lo stantuffo di siringa per riempire l'intera micropipetta con SO.
2. Iniezione SO intracamerale per un occhio
- Mettete un topo maschio C57B6/J di 9-10 settimane in una camera di induzione con il 3% di isoflurane mescolato con ossigeno a 2 L/min per 3 min.
- Intraperitonealmente iniettare 2,2,2-tribromoetanolo a 0,3 mg/g peso corporeo.
NOTA: A differenza della chetamina/xylazina, 2,2,2 tribromoetanolo non causa dilatazione della pupilla evidente. - Controllare la mancanza di risposta a un pizzico di punta e la mancanza di movimento dei baffi o della coda per determinare la forza anestetica.
- Posizionare il mouse in posizione laterale su una piattaforma chirurgica. Per ridurre la sua sensibilità durante la procedura, applicare una goccia di 0,5% di cloruro proparacaina alla cornea prima dell'iniezione.
- Fare un'incisione di ingresso con l'ago di paracentesi 32 G al quadrante superotemporale, a circa 0,5 mm dal limbo.
- Tunnel attraverso gli strati della cornea per circa 0,3 mm prima di piercing nella camera anteriore. Fare attenzione a non toccare l'obiettivo o l'iride.
- Ritirare lentamente l'ago per liberare un umore acquoso (circa 1/2 -L) dalla camera anteriore attraverso il tunnel (paracentesi).
- Attendere 8 min per diminuire ulteriormente l'IOP. Questo può essere determinato misurando l'occhio di controllo contraplaterale.
- Inserire la micropipetta di vetro precaricata con SO attraverso il tunnel corneale nella camera anteriore, con la svella rivolta verso la superficie dell'iride.
- Spingere lentamente lo stantuffo della siringa per iniettare SO nella camera anteriore fino a quando la goccia SO copre la maggior parte della superficie dell'iride, con un diametro di 2,2,4 mm.
- Lasciare la micropipetta nella camera anteriore per altri 10 s prima di ritirarla lentamente.
- Spingere delicatamente la palpebra superiore per chiudere l'incisione della cornea per ridurre al minimo la perdita di SO.
- Applicare unguento antibiotico (bacitracina-neomicina-polimyxin) sulla superficie dell'occhio.
- Durante la procedura, spesso inumidire la cornea con lacrime artificiali.
- Tenere il mouse sulla piastra di riscaldamento fino a quando completamente recuperato dall'anestesia.
3. Rimozione SO
- Preparare il sistema di irrigazione.
- Preparare la soluzione di irrigazione secondo le istruzioni del produttore e inserirla nella bottiglia di irrigazione. Eleva la bottiglia della soluzione di irrigazione a 110-120 cm (81-88 mmHg) sopra la piattaforma di chirurgia.
- Attaccare un set di somministrazione IV alla bottiglia della soluzione di irrigazione. Rimuovere le bolle d'aria dal tubo IV. Collegare un ago da 33 G piegato a 20 gradi faccia a faccia in su fino al tubo IV.
- Per preparare il sistema di drenaggio, rimuovere lo stantuffo da una siringa da 1 mL. Fissare un ago da 33 G alla siringa e piegare l'ago a 20 gradi.
- Rimuovere SO dalla camera anteriore.
- Intraperitonealmente iniettare 2,2,2-tribromoetanolo (0,3 mg/g di peso corporeo). Controllare la mancanza di risposta al pizzico della punta per determinare la forza anestetica e la mancanza di movimento dei baffi o della coda.
- Posizionare il mouse su una piattaforma chirurgica e fissarlo in posizione laterale con nastro adesivo. Applicare una goccia di 0,5% di cloruro proparacaina alla cornea per ridurne la sensibilità.
- Fare due incisioni nel quadrante temporale della cornea tra i 2 e le 5 dollari sul bordo della gocciolina SO utilizzando l'ago prefatto da 32 G paracentesi.
- Inserire un ago di irrigazione da 33 G collegato alla soluzione di irrigazione attraverso un'incisione corneale, velocità massima.
- Inserire un altro ago di drenaggio da 33 G attaccato alla siringa senza uno stantuffo attraverso l'altra incisione corneale per consentire alla goccia SO di uscire dalla camera anteriore durante l'irrigazione con soluzione di irrigazione.
- Ritirare l'ago di drenaggio, quindi l'ago di irrigazione.
- Iniettare una bolla d'aria nella camera anteriore per mantenere la profondità normale e premere per chiudere l'incisione corneale.
- Applicare unguento antibiotico su entrambi gli occhi.
- Tenere il mouse sul pad di recupero di riscaldamento fino a quando completamente recuperato dall'anestesia.
4. Misurazione IOP una volta alla settimana
- Posizionare il topo in una camera di induzione perfusa con 3% isoflurane mescolato con ossigeno a 2L/min per 3 min.
- Intraperitonealmente iniettare xillazina e ketamina (0,01 mg di xilolazina/g, 0,08 mg di ketamina/g).
- Mantenere la cornea umida applicando lacrime artificiali per tutta la procedura.
- Attendere circa 15 min per consentire alla pupilla di dilatarsi completamente.
- Misurare l'IOP di entrambi gli occhi utilizzando un tonometro secondo le istruzioni del prodotto. Portare il tonometro vicino all'occhio del mouse. Mantenere la distanza dalla punta della sonda alla cornea del topo a circa 3,4 mm. Premere il pulsante di misurazione 6x per generare una lettura. Da ogni occhio si ottengono tre letture generate dalla macchina per acquisire l'IOP medio.
- Sacrificare gli animali a 8 settimane dopo l'iniezione di SO ed eseguire l'immunosofia della retina a montaggio intero, il conteggio RGC, le sezioni semi-sottili nervo ottico (ON) e la quantificazione degli assoni sopravvissuti, che sono stati descritti prima delle13.
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Representative Results
Subito dopo l'iniezione possiamo facilmente identificare i topi che non producono ipertensione oculare stabile a causa delle goccioline SO troppo piccole (1,5 mm)13. Questi animali sono esclusi dai successivi esperimenti. Dopo le procedure di iniezione, più dell'80% dei topi so iniettati finisce con goccioline più grandi di 1,6 mm. Abbiamo misurato l'IOP di questi occhi del topo una volta alla settimana per 8 settimane dopo una singola iniezione SO. L'IOP dell'occhio che riceve SO è rimasto alto, generalmente il doppio dell'IOP dell'occhio di controllo contralaterale, indicando un efficace blocco della pupilla (Figura 1). L'edema nella cornea del topo può essere controllato al microscopio di dissezione leggera dopo un'iniezione intracamerale che normalmente richiede 2/3 giorni per il recupero. La dilatazione della pupilla richiede tempo e si deve attendere la dilatazione della pupilla prima di effettuare la misurazione dell'IOP. Pertanto, cerchiamo di non misurare l'IOP troppo presto dopo un'iniezione. Per lo stesso motivo, non si consiglia di misurare l'IOP troppo spesso. Con un altro gruppo di topi, abbiamo lavato il SO dalla camera anteriore 2 settimane dopo l'iniezione SO, e abbiamo aspettato per un'altra settimana per consentire alla cornea di recuperare prima di misurare IOP, che stabilmente ha restituito l'IOP alla normalità (Figura 1).
Per determinare gli effetti dell'ipertensione oculare indotta dall'iniezione SO su RGC, abbiamo quantificato il somata RGC sopravvissuto nelle regioni periferiche degli interi montani retinici da PARTE dell'RBPMS che stacca14,15 e gli assoni sopravvissuti nelle sezioni trasversali semisottili ON da PPD colorazione16 a 8 settimane dopo l'iniezione di SO. Glaucomatous RGC morte e degenerazione assone sono stati drammatici in ipertensione oculare indotta SO (SOHU) (Figura 2). Ulteriori dettagli su questo sono forniti nella sezione di discussione.
Figura 1: Misurazioni IOP negli occhi SO e negli occhi di controllo contralaterale, con o senza rimozione SO. SO - OCCHI iniettati SO; CL - occhi di controllo contralaterali. I dati sono presentati come mezzi: S.E.M, n - 12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Glaucomatous RGC soma e degenerazione assone in SOHU. (A ) Pannello superiore raffigura la regione periferica che mostra RGC (RBPMS, rosso) a 8 settimane dopo l'iniezione SO di retine intere montate. Barra di scala - 20 m. Il pannello inferiore raffigura immagini semi-sottili di sezioni trasversali dell'ON macchiate con PPD a 8 settimane dopo l'iniezione SO. Barra di scala (B) Dati quantificazione degli SCO sopravvissuti negli occhi della retina periferica (n - 12) e degli assoni negli occhi ON (n - 10) a 8 settimane dopo l'iniezione SO rispetto all'iniezione contralaterale (CL) occhi. I dati sono presentati come mezzi: S.E.M. : P < 0.0001; Test t accoppiato dello studente. RGC - cellula gangliaria retinica; ON - nervo ottico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui dimostriamo una procedura semplice ma efficace per indurre l'elevazione prolungata di IOP nell'occhio del mouse mediante iniezione intracamerale di SO. Questa procedura può essere appresa rapidamente da chiunque abbia esperienza nella microdissezione al microscopio. Il rischio potenziale primario di fallimento è la perdita di SO dall'incisione corneale. Tuttavia, uno dei vantaggi dell'utilizzo di SO è che, poiché la goccia d'olio è visibile e misurabile, possiamo facilmente identificare i topi che hanno ricevuto goccioline troppo piccole per indurre un'ipertensione oculare stabile subito dopo l'iniezione ed escluderli dai successivi esperimenti. Abbiamo regolarmente raggiunto un tasso di successo dell'80% ed escluso circa il 20% dei topi a causa di una piccola goccia SO (1,5 mm)13. Tuttavia, un chirurgo esperto che può fare un tunnel relativamente lungo (0,3 mm) all'interno degli strati della cornea prima di penetrare la cornea nella camera anteriore con la punta snella può quasi prevenire qualsiasi perdita di SO rendendo l'apertura interna del tunnel corneale molto più piccola dell'apertura esterna. Pertanto, quasi tutti i topi sono stati iniettati con una goccia SO più grande di 1,8 mm. Oltre alla lunghezza del tunnel, alcuni altri punti critici meritano di essere sottolineati. In primo luogo, è importante mantenere l'IOP basso nell'occhio iniettato per evitare di spingere il SO fuori dalla camera anteriore. Un errore comune è quello di iniettare troppo SO, che rende più facile la perdita. Limitiamo il volume di SO nella camera anteriore in modo che copra quasi, ma non del tutto, la superficie dell'iride. Il diametro di questa goccia SO è di 2,3,2,4, 4 di kis. In secondo luogo, l'incisione del tunnel corneale è fatta il più vicino possibile al limbo per consentire all'incisione di avvicinarsi all'iride ma non danneggiarla, in modo che l'iride possa facilmente prendere l'incisione. In terzo luogo, la velocità di iniezione dovrebbe essere il più lenta possibile per evitare un eccessivo overflow di SO nella camera anteriore. Quarto, il massaggio delle palpebre superiori dopo l'iniezione aiuta l'incisione corneale a chiudere e talvolta aiuta le sinechie anteriori dell'iride periferica a chiudere l'incisione corneale, e quindi per evitare perdite di olio.
C'è un aumento dell'IOP solo nella parte posteriore dell'occhio, ma non nella camera anteriore, rendendolo una caratteristica unica di questo modello. Il blocco delle pupille impedisce l'afflusso di umorismo acquoso nella camera anteriore e quindi aumenta l'IOP solo nella parte posteriore. La barriera fisica formata dalla SO insieme all'iride e alla grande lente oculare può scollegare la camera anteriore dal segmento posteriore, che può limitare l'elevazione IOP solo nel segmento posteriore, dove si accumula il materiale acquoso. Quando la pupilla del topo è più grande della goccia SO dopo la dilatazione, le camere anteriori e posteriori vengono riconnesse, consentendo un rapido aumento di IOP nella camera anteriore da un'inondazione aquess in esso. Pertanto, un tonometro può rilevare solo l'aumento di IOP dopo aver rimosso il blocco pupillare, quindi il vero IOP nel segmento posteriore è senza dubbio sottovalutato. Pertanto, abbiamo chiamato questo modello il modello SOHU (Ipertensione oculare indotta da SO), che riflette in modo più accurato e utile questa caratteristica chiave del modello. Sarebbe meglio essere in grado di misurare direttamente l'IOP nel segmento posteriore, ma finora non è possibile. Questa patogenesi unica del modello SOHU ha due caratteristiche vantaggiose: in primo luogo, gli occhi sperimentali hanno chiari elementi oculari che consentono in vivo la valutazione della funzione visiva e morfologia e secondo, la grave neurodegenerazione glausaba consente di rilevare qualsiasi vantaggio dei test sui neuroproprotettori.
L'iniezione di SO può causare temporaneamente l'edema corneale e si consiglia di non eseguire misurazioni IOP troppo presto o troppo spesso. Non abbiamo rilevato alcuna infiammazione nella camera anteriore o nella cornea negli occhi SOHU, anche se abbiamo incontrato due istanze di neovascolarizzazione della cornea negli oltre 100 topi che ricevono iniezioni DI SO.
Poiché SO causa ipertensione oculare sia nei pazienti umani che nei topi, è ragionevole postulare che questo modello di glaucoma concettualmente nuovo e praticamente significativo possa essere adattato per gli animali più grandi che sono più adatti per applicazioni precliniche. La caratterizzazione dei deficit nella funzione neurale e morfologia di questo modello incoraggerà certamente altri ricercatori ad approfittarne per perseguire importanti domande riguardanti il glaucoma e, ancor più in generale, le malattie che inducono RGC e ON Degenerazione.
In sintesi, si tratta di un modello di glaucoma animale semplice che non richiede attrezzature speciali o lesioni ripetute e può essere applicabile ad altre specie animali. Intrigantemente, l'elevazione IOP del modello SOHU può essere invertita rimuovendo l'olio dalla camera anteriore, quindi è utile per lo screening del trattamento neuroprotettivo combinato con le terapie di abbassamento IOP.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni NIH EY024932, EY023295 ed EY028106 a YH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
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