Summary
여기서, 우리는 실리콘 오일의 내카메라 주입에 의해 마우스 눈에 안구 고혈압 과 녹내장 신경 변성을 유도하는 프로토콜을 제시하고 전방 챔버에서 실리콘 오일 제거를위한 절차는 높은 안구 압력을 반환 정상적인.
Abstract
높은 안구 내 압력 (IOP)은 녹내장에 대한 잘 문서화 된 위험 요소입니다. 여기에서 우리는 인간 vitreoretinal 수술에 있는 탐포네이드 에이전트로 실리콘 기름 (SO)를 사용하는 수술 후 합병증을 모방하는 마우스에 있는 안정한 IOP 고도를 일관되게 유도하기 위한 참신하고 효과적인 방법을 기술합니다. 이 프로토콜에서, SO는 동공을 차단하고 수성 유머의 유입을 방지하기 위해 마우스 눈의 전방 챔버에 주입된다. 후방 챔버는 수성 유머를 축적하고 이것은 차례로 후방 세그먼트의 IOP를 증가시킨다. 단일 SO 주사는 신뢰할 수 있는 생산, 충분 한, 그리고 안정적인 IOP 상승, 중요 한 녹 내장 신경 변성을 유도. 이 모형은 안과 진료소에 있는 이차 녹내장의 참된 복제입니다. 임상 적 설정을 더 모방하기 위해, SO는 배수 경로를 재개하고 전방 챔버의 각도로 trabecular 메쉬 워크 (TM)를 통해 배수되는 수성 유머의 유입을 허용하기 위해 전방 챔버에서 제거 될 수 있습니다. IOP는 빨리 정상으로 돌아오기 때문에, 모형은 녹내장 망막 신경절 세포에 IOP를 낮추는 효력을 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 간단하고, 특수 장비 또는 반복 절차가 필요하지 않으며, 임상 상황을 면밀히 시뮬레이션하며 다양한 동물 종에 적용 될 수 있습니다. 그러나 사소한 수정이 필요할 수 있습니다.
Introduction
망막 신경절 세포 (RGCs)와 그들의 축세포의 점진적 인 손실은 녹내장의 특징이며,망막1의일반적인 신경 퇴행성 질환입니다. 2040년2월까지40~80세 의 1억 명 이상이 영향을 미칠 것입니다. IOP는 녹내장의 발달과 진행에 있는 유일한 변경 가능한 위험 요소입니다. 녹내장의 병인, 진행 및 잠재적 인 치료법을 탐구하기 위해서는 인간 환자의 주요 특징을 복제하는 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 유도 할 수없는 실험용 안구 고혈압 / 녹내장 모델이 필수적입니다.
IOP는 후방 챔버내의 섬모 체로부터 전방 챔버로 수성 유머 유입에 의존하고 전방 챔버의 각도에서 근방 메쉬워크(TM)를 통해 유출된다. 정상 상태에 도달하면 IOP가 유지됩니다. 유입이 유출을 초과하거나 적으면 IOP는 각각 상승 또는 하락합니다. 전방 챔버의 각도를 폐색하거나 TM을 손상시킴으로써 수성 유출을 감소시킴으로써, 여러 녹내장 모델이3,4,5,6,7,8,9,10으로확립되었다. 이 모형은 일반적으로 돌이킬 수 없는 안구 조직 손상과 연관되고, 전방 약실에 있는 높은 IOP는 또한 망막 화상 진찰 및 시각 기능 시험을 능력을 발휘하고 해석하는 어렵게 만드는 각막 부종 및 안구 염증과 같은 원치 않는 합병증을 일으키는 원인이 됩니다.
이러한 단점을 극복하는 모델을 개발하기 위해, 우리는 인간 유리체 수술 의 수술 후 합병증으로 발생하는 실리콘 오일 (SO)에 의한 잘 문서화 된 이차 녹내장에 초점을맞추었다 11,12. SO는 높은 표면 장력 때문에 망막 수술에서 탐폰으로 사용됩니다. 그러나 SO는 수성 및 유리체 유체보다 가볍기 때문에 동공을 물리적으로 막을 수 있으며, 이는 전방 챔버로의 수성 흐름을 방지합니다. 방해는 수성 유머 축적으로 인해 후방 챔버에서 IOP 상승을 일으킵니다. 이것은 우리가 개발하고 이차 녹내장의 주요 특징과 함께, 방관 SO 주입 및 동공 블록(13)에기초한 새로운 안구 고혈압 마우스 모델을 개발하고 특성화하도록 동기를 부여: 효과적인 동공 블록, SO 제거 후 정상으로 돌아갈 수있는 중요한 IOP 고도, 및 녹내장 신경 변성.
여기에서 우리는 마우스 눈에서 SO 유도된 안구 고혈압을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다, SO 주입 및 제거 및 IOP 측정을 포함하여.
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Protocol
모든 절차는 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. SO의 카메라 내 주입에 의한 안구 고혈압 유도
- 피펫 풀러로 유리 모세관을 당겨 마이크로파이펫을 생성하여 카메라 내 SO 주입을 위한 유리 마이크로파이펫을 준비한다. 마이크로파이펫 끝의 개구부를 절단하고 마이크로그라인더 베벨링 기계로 팁을 더욱 선명하게 하여 35°-40° 경사를 만듭니다.
- 경사의 가장자리를 연마하고 물로 세척하여 모든 파편을 제거합니다. 사용하기 전에 마이크로 파이펫을 오토클레이브하십시오.
- 각막 항목에 대한 paracentesis 바늘을 준비합니다. 이렇게 하려면 32G 바늘을 Luer 잠금 장치5mL 주사기에 부착하고 테이프로 더 고정하십시오. 바늘 베벨 팁을 30°에서 위로 구부립니다.
- SO 인젝터를 먼저 10 mL 주사기에 무딘 말단 18 G 바늘을 부착하고 고정시킴으로써 준비한다. 그런 다음 한쪽 끝에 18G 바늘이있는 플라스틱 튜브를 부착하고 다른 쪽 끝을 통해 필요에 따라 SO로 채웁니다.
- 멸균 된 마이크로 파이펫을 플라스틱 튜브에 부착하고 주사기 플런저를 밀어 전체 마이크로 파이펫을 SO로 채웁니다.
2. 한쪽 눈을 위한 카메라 내 SO 주사
- 9-10주 된 수컷 C57B6/J 마우스를 3% 이소플루란과 산소를 3분 동안 2L/min으로 혼합한 유도 챔버에 넣습니다.
- 복강 내 주입 2,2,2-트리브로모에탄올 0.3 mg/g 체중.
참고: 케타민/자일라진과 는 달리, 2,2,2-트리브로모에탄올은 명백한 동공 팽창을 일으키지 않습니다. - 발가락 핀치에 대한 반응의 부족과 마취 강도를 결정하기 위해 수염이나 꼬리의 움직임이 부족한지 확인하십시오.
- 수술 플랫폼의 측면 위치에 마우스를 놓습니다. 절차 중 감도를 줄이려면 주사 전에 각막에 0.5 % 프로 파라카인 염산염 한 방울을 바르십시오.
- 팔다리에서 약 0.5 mm 떨어진 초시간 사분면에서 32 G 파라센티스 바늘로 엔트리 절개를 합니다.
- 전방 챔버로 관통하기 전에 약 0.3 mm에 대한 각막의 층을 통해 터널. 렌즈나 홍채를 만지지 않도록 주의하십시오.
- 터널 (paracentesis)를 통해 전방 챔버에서 일부 수성 유머 (약 1-2 μL)를 해제하기 위해 천천히 바늘을 철회.
- IOP를 더 줄이려면 ~ 8분 간 기다립니다. 이것은 반대측, 대조군 눈을 측정하여 결정될 수 있다.
- 각막 터널을 통해 SO로 미리 로드된 유리 마이크로파이펫을 전방 챔버에 삽입하고 경사를 홍채 표면을 향하게 합니다.
- SO 방울이 홍채 표면의 대부분을 덮을 때까지 전방 챔버에 SO를 주입하기 위해 주사기 플런저를 천천히 밀어 직경 ~ ~ 2.2.4 mm.
- 마이크로파이펫을 앞쪽 챔버에 10초 더 두고 천천히 인출하십시오.
- 윗눈꺼풀을 부드럽게 밀어 각막 절개를 닫아 SO 누출을 최소화합니다.
- 눈 표면에 항생제 연고 (바시트라신 - 네오 마이신 - 폴리 마이신)를 적용하십시오.
- 절차 전반에 걸쳐, 자주 인공 눈물로 각막을 적시다.
- 마취에서 완전히 회복 될 때까지 가열 패드에 마우스를 유지합니다.
3. SO 제거
- 관개 시스템을 준비합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 관개 용액을 준비하고 관개 병에 놓습니다. 관개 용액 병을 수술 플랫폼 위의 110-120 cm (81−88 mmHg)로 상승시킵니다.
- 관개 용액 병에 IV 투여 세트를 부착합니다. IV 튜브에서 기포를 제거합니다. 구부러진 33G 바늘을 IV 튜브까지 20° 면에 연결합니다.
- 배수 시스템을 준비하려면 1mL 주사기에서 플런저를 제거하십시오. 33G 바늘을 주사기에 부착하고 바늘을 20°로 구부립니다.
- 전방 챔버에서 SO를 제거하십시오.
- 복강 내 주사 2,2,2 트리브로모에탄올 (0.3 mg/g 체중). 발가락 핀치에 대한 반응이 부족한지 확인하여 마취 강도와 수염 또는 꼬리의 움직임 부족을 확인하십시오.
- 수술 플랫폼에 마우스를 놓고 테이프로 측면 위치에 고정합니다. 감도를 줄이기 위해 각막에 0.5 % 프로 파라카인 염산염 1 방울을 적용하십시오.
- 미리 만들어진 32 G 파라센티스 바늘을 사용하여 SO 액적의 가장자리에서 ~ 2시에서 5시 사이에 각막의 측두엽에서 두 개의 절개를 합니다.
- 하나의 각막 절개, 최대 속도를 통해 관개 용액에 연결된 33G 관개 바늘을 삽입하십시오.
- 다른 각막 절개를 통해 플런저없이 주사기에 부착 된 다른 33G 배수 바늘을 삽입하여 SO 방울이 관개 용액으로 관개하는 동안 전방 챔버를 빠져 나갈 수 있도록합니다.
- 배수 바늘을 철회 한 다음 관개 바늘을 철회하십시오.
- 기포를 전방 챔버에 주입하여 정상적인 깊이를 유지하고 각막 절개를 닫습니다.
- 양쪽 눈에 항생제 연고를 바르고 있습니다.
- 가열 복구 패드에 마우스를 완전히 마취에서 회복 될 때까지 유지합니다.
4. 일주일에 한 번 IOP 측정
- 3% 이소플루란과 산소를 혼합하여 3분 동안 3분 동안 산소와 함께 주입된 유도 챔버에 마우스를 놓습니다.
- 복강 내 자일라진과 케타민 (0.01 mg 자일라진 / g, 0.08 mg 케타민 / g)을 주입합니다.
- 시술 내내 인공 눈물을 바르고 각막을 촉촉하게 유지하십시오.
- 15분 정도 기다려 동공이 완전히 팽창할 수 있도록 합니다.
- 제품 지침에 따라 토노미터를 사용하여 두 눈의 IOP를 측정합니다. 마우스 눈 근처에 토노미터를 가져옵니다. 프로브 끝에서 마우스 각막까지의 거리를 약 3-4 mm로 유지합니다. 측정 버튼을 6x 누르면 하나의 판독값을 생성합니다. 평균 IOP를 획득하기 위해 각 눈으로부터 3개의 기계 생성 판독값을 얻습니다.
- SO 주사 후 8주에 동물을 희생시키고 전체 마운트 망막, RGC 카운팅, 시신경(ON) 반박성 절편 및 생존 축색의 정량화를 수행하며, 이는13일이전에 설명되었다.
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Representative Results
곧 주입 후 우리는 SO 방울이 너무 작기 때문에 안정적인 안구 고혈압을 생성하지 않는 마우스를 쉽게 식별 할 수 있습니다 (≤1.5 mm)13. 이들 동물은 후속 실험에서 제외된다. 주사 절차에 따라, SO 주입 마우스의 80% 이상은 1.6 mm 보다 큰 작은 물방울로 끝납니다. 우리는 단 하나 SO 주입 후에 8 주 동안 이 마우스 눈의 IOP를 일주일에 한 번 측정했습니다. SO를 수신하는 눈의 IOP는 높게 남아 있었고, 일반적으로 효과적인 동공 차단을 나타내는 반대측 제어 눈의 IOP를 두 배로하였다(도 1). 마우스 각막에 있는 부종은 일반적으로 복구를 위해 2-3 일이 걸리는 내부 카메라 주입 후에 가벼운 해부 현미경의 밑에 검사될 수 있습니다. 동공 팽창은 시간이 걸리고, 하나는 IOP 측정을 복용하기 전에 동공 팽창을 기다려야합니다. 따라서, 우리는 주사 후 너무 빨리 IOP를 측정하지 않으려고. 같은 이유로 IOP를 너무 자주 측정하지 않는 것이 좋습니다. 마우스의 또 다른 그룹으로, 우리는 SO 주입 후 2 주 전방 챔버에서 SO를 플러시, 우리는 안정적으로 정상으로 IOP를 반환 IOP를 측정하기 전에 각막이 회복 할 수 있도록 또 다른 주를 기다렸다(그림 1).
RGCs에 SO 주입에 의해 유도된 안구 고혈압의 효과를 확인하기 위해, 우리는 RBPMS 염색14,15 및 ON 세미틴 단면에서 살아남은 축아를 SO 주입 후 8주 후에8주에 PPD 염색하여 망막 전체 마운트의 말초 영역에서 생존한 RGC 소마타를 정량화하였다. 녹내장 RGC 사망 및 축사 변성은 SO-유도 안구 고혈압 하에서 극적검출된 눈(SOHU)(그림2)이었다. 이에 대한 자세한 내용은 토론 섹션에 제공됩니다.
그림 1: SO 제거 유무에 관계없이 SO 눈과 반대측 제어 눈의 IOP 측정. 그래서 = 그래서 주입 눈; CL = 반대 측제어 눈. 데이터는 ± S.E.M, n =12를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SOHU에서 녹내장 RGC 소종 및 축세포 변성. (A)상부 패널은 전체 장착 망막의 SO 주입 후 8주에서 RGCs(RBPMS+, 적색)를 나타내는 주변 영역을 묘사한다. 스케일 바 = 20 μm. 하부 패널은 SO 주입 후 8주 동안 PPD로 염색된 ON의 단면의 반얇은 이미지를 묘사한다. 스케일 바 = 10 μm.(B)SO 주입 후 8주 후 의 외측 조절(CL) 눈과 비교하여 주변 망막(n=12) 및 ON(n=10)에서의 축삭에서 생존한 RGCs의 정량화 데이터. 데이터는 ±S.E.M. ****: P & 0.0001; 학생의 페어링 된 t 테스트. RGC = 망막 신경절 세포; ON = 시신경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 SO의 사내 주입에 의하여 마우스 눈에서 지속적인 IOP 고도를 유도하기 위한 간단하고 효과적인 절차를 보여줍니다. 이 절차는 현미경의 밑에 현미경 절제술에 있는 경험이 있는 누군가에 의해 빨리 배울 수 있습니다. 실패의 주요 잠재적인 위험은 각막 절개에서 SO의 누설입니다. 그러나 SO를 사용하는 장점 중 하나는 오일 액적이 눈에 보이고 측정 가능하기 때문에 주사 직후 안정된 안구 고혈압을 유발하고 후속 실험에서 제외하기에는 너무 작은 방울을 받은 마우스를 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다. 우리는 일상적으로 80%의 성공률을 달성하고 작은 SO 액적 (≤1.5 mm)13때문에 마우스의 대략 20%를 제외했습니다. 그러나, 경사진 끝으로 전방 챔버로 각막을 관통하기 전에 각막의 층 내에서 상대적으로 긴 터널 (0.3 mm)을 만들 수있는 경험이 풍부한 외과 의사는 거의 외부 개구부보다 훨씬 작은 각막 터널의 내부 개방을함으로써 SO 누출을 방지 할 수 있습니다. 따라서 거의 모든 마우스를 1.8 mm보다 큰 SO 액적으로 주입하였다. 터널의 길이 외에도 다른 중요한 점은 강조할 가치가 있습니다. 첫째, 전방 챔버에서 SO를 밀어내는 것을 피하기 위해 주입된 눈에서 IOP를 낮게 유지하는 것이 중요하다. 한 가지 일반적인 실수는 너무 많은 SO를 주입하는 것입니다, 이는 누출을 쉽게. 우리는 전방 챔버에서 SO의 부피를 제한하여 홍채 표면을 거의 커버하지는 않지만 거의 모든 것을 덮습니다. 이 SO 액적의 직경은 ~ 2.3-2.4 mm입니다. 둘째, 각막 터널 절개는 개시가 홍채에 가까워지지 않도록 가능한 한 팔다리에 가깝게 만들어지지만 홍채가 쉽게 절개를 할 수 있도록 합니다. 셋째, 사출 속도는 전방 챔버로 SO의 과도한 오버 플로우를 방지하기 위해 가능한 한 느려야한다. 넷째, 주사 후 위 눈꺼풀 마사지는 각막 절개를 닫는 데 도움이 때로는 각막 절개를 닫을 말초 홍채의 전방 합성을 지원, 따라서 오일 누출을 방지하기 위해.
눈의 후방 부분에서만 IOP가 증가하지만 전방 챔버에서는 증가하지 않아이 모델의 독특한 특징이됩니다. 동공 차단은 전방 챔버로 수성 유머 유입을 방지하고 따라서 후방 부분에서만 IOP를 증가시킵니다. SO에 의해 형성된 물리적 장벽은 홍채 및 대형 안구 렌즈와 함께 후방 세그먼트로부터 전방 챔버를 분리할 수 있으며, 이는 수성 물질이 축적되는 후방 세그먼트에서만 IOP 고도를 제한할 수 있습니다. 마우스 동공이 팽창 후 SO 액적보다 크면 전방 및 후방 챔버가 다시 연결되어 수성 홍수에 의해 전방 챔버에서 IOP가 빠르게 증가합니다. 따라서, 토노미터는 동공 블록을 제거한 후에만 증가된 IOP를 검출할 수 있으므로 후방 세그먼트의 진정한 IOP는 의심할 여지 없이 과소평가됩니다. 따라서 이 모델의 이름을 SO-유도 안구 고혈압 언더 검출 모델(SOHU)으로 명명했는데, 이 모델은 모델의 이 주요 특징을 보다 정확하고 유용하게 반영합니다. 후방 세그먼트에서 IOP를 직접 측정할 수 있는 것이 가장 좋지만, 지금까지는 불가능합니다. SOHU 모델의 이 독특한 병인은 두 가지 장점이 있습니다: 첫째, 실험적인 눈은 시각 기능 및 형태에 대한 생체 내 평가를 허용하는 명확한 안구 요소를 가지고 있으며, 둘째, 중증 녹내장 신경 변성 신경 보호제를 검사하는 이점을 감지할 수 있습니다.
SO 주사는 각막 부종을 일시적으로 일으킬 수 있으며 너무 일찍 또는 너무 자주 IOP 측정을 수행하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 SO 주사를 수신하는 100 개 이상의 마우스에서 각막 신생물의 두 인스턴스를 발생하지만, SOHU 눈에 전방 챔버 또는 각막에 염증을 감지하지 않았다.
SO는 인간 환자와 마우스 둘 다에 있는 안구 고혈압을 일으키는 원인이 되기 때문에, 이 개념적으로 참되고 실질적으로 중요한 녹내장 모형이 전임상 신청에 더 적합한 더 큰 동물을 위해 적응될 수 있다는 것을 추정하는 것이 합리적입니다. 이 모형의 신경 기능 그리고 형태학에 있는 적자의 특성은 확실히 녹내장에 관하여 중요한 질문을 추구하기 위하여 그것을 이용하는 그밖 조사자를 격려할 것입니다 그리고, 더 넓게, RGC와 ON을 유도하는 질병 변성.
요약하자면, 이것은 특별한 장비 나 반복 부상을 필요로하지 않고 다른 동물 종에 적용 할 수있는 간단한 동물 녹내장 모델입니다. 흥미롭게도, SOHU 모델의 IOP 고도는 전방 챔버로부터 오일을 제거함으로써 반전될 수 있으므로 IOP 하강 요법과 결합된 신경 보호 치료를 스크리닝하는 데 유용하다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 EY024932, EY023295, EY028106에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
References
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