Summary
Aquí, presentamos un protocolo para inducir hipertensión ocular y neurodegeneración glaucomatosa en los ojos del ratón por inyección intracameral de aceite de silicona y el procedimiento para la eliminación de aceite de silicona de la cámara anterior para devolver la presión intraocular elevada a Normal.
Abstract
La presión intraocular elevada (PIO) es un factor de riesgo bien documentado para el glaucoma. Aquí describimos un método novedoso y eficaz para inducir consistentemente la elevación estable de la PIO en ratones que imita la complicación postoperatoria del uso de aceite de silicona (SO) como agente de tamponade en cirugía vitreoretiniana humana. En este protocolo, SO se inyecta en la cámara anterior del ojo del ratón para bloquear la pupila y evitar la entrada de humor acuoso. La cámara posterior acumula humor acuoso y esto a su vez aumenta el IOP del segmento posterior. Una sola inyección de SO produce elevación de Pio fiable, suficiente y estable, que induce una significativa neurodegeneración glaucomatosa. Este modelo es una verdadera réplica del glaucoma secundario en la clínica oftalmológica. Para imitar aún más el entorno clínico, SO se puede extraer de la cámara anterior para reabrir la vía de drenaje y permitir la entrada de humor acuoso, que se drena a través de la malla trabecular (TM) en el ángulo de la cámara anterior. Debido a que la PIO vuelve rápidamente a la normalidad, el modelo se puede utilizar para probar el efecto de reducir la PIO en las células ganglionas de la retina glaucomatosa. Este método es sencillo, no requiere equipos especiales ni procedimientos de repetición, simula de cerca situaciones clínicas y puede ser aplicable a diversas especies animales. Sin embargo, pueden ser necesarias modificaciones menores.
Introduction
La pérdida progresiva de las células ganglionares de la retina (RGC) y sus axones es el sello distintivo del glaucoma, una enfermedad neurodegenerativa común en la retina1. Afectará a más de 100 millones de personas de 40 a 80 años para 20402. La PIO sigue siendo el único factor de riesgo modificable en el desarrollo y progresión del glaucoma. Con el fin de explorar la patogénesis, progresión, y tratamientos potenciales del glaucoma, es imperativo un modelo de hipertensión ocular experimental/glaucoma experimental confiable, reproducible e inducible que recanda las características clave de los pacientes humanos.
IOP depende de la entrada de humor acuoso a la cámara anterior desde el cuerpo ciliar en la cámara posterior y la salida a través de la malla trabecular (TM) en el ángulo de la cámara anterior. Al llegar a un estado estable, se mantiene el IOP. Cuando la entrada excede o es menor que la salida, el IOP sube o baja respectivamente. Al disminuir la salida acuosa, ya sea obiencándose el ángulo de la cámara anterior o dañando la TM, se han establecido varios modelos de glaucoma3,4,5,6,7,8,9,10. Estos modelos se asocian normalmente con daño irreversible en el tejido ocular, y el alto IOP en la cámara anterior también causa complicaciones no deseadas como edema corneal e inflamación intraocular, que hacen que la imagen de la retina y los ensayos de la función visual sean difíciles de realizar e interpretar.
Para desarrollar un modelo que supere estas deficiencias, nos centramos en el glaucoma secundario bien sudocumentado causado por el aceite de silicona (SO) que se produce como una complicación postoperatoria de la cirugía vitreoretiniana humana11,12. SO se utiliza como un tamponade en cirugías de retina debido a su alta tensión superficial. Sin embargo, SO puede oclusión físicamente la pupila porque es más ligera que los fluidos acuosos y vítreos, lo que impide el flujo acuoso en la cámara anterior. La obstrucción causa elevación de la PIO en la cámara posterior debido a la acumulación de humor acuoso. Esto nos motivó a desarrollar y caracterizar un novedoso modelo de ratón de hipertensión ocular basado en la inyección intracameral SO y el bloque pupilar13,con características clave del glaucoma secundario: bloque pupilar efectivo, elevación significativa de la PIO que puede volver a la normalidad después de la eliminación de SO, y neurodegeneración glaucomatosa.
Aquí presentamos un protocolo detallado para la hipertensión ocular inducida por SO en el ojo del ratón, incluyendo la inyección y extracción de SO y la medición de la PIO.
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Protocol
Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Stanford.
1. Inducción de hipertensión ocular por inyección intracameral de SO
- Prepare un micropipeta de vidrio para la inyección intracameral de SO tirando de un capilar de vidrio con un tirador de pipeta para generar una micropipeta. Corte una abertura en la punta de la micropipette y afila rinde aún más la punta con una máquina de biselado de micromolinillos para hacer un bisel de 35o 40o.
- Pulir los bordes del bisel y eliminar todos los residuos mediante el lavado con agua. Autoclave el micropipeta antes de su uso.
- Prepare la aguja de paracentesis para la entrada de la córnea. Para ello, coloque una aguja de 32 G en una jeringa de 5 ml en una cerradura Luer y acontezándola con cinta adhesiva. Doblar la punta del bisel de la aguja hacia arriba a 30o.
- Prepare primero el inyector SO uniendo y fijando una aguja de extremo contundente de 18 G en una jeringa de 10 ml. A continuación, coloque un tubo de plástico con la aguja de 18 G en un extremo y llene con SO según sea necesario a través del otro extremo.
- Fije la micropipeta esterilizada al tubo de plástico y empuje el émbolo de la jeringa para llenar toda la micropipeta con SO.
2. Inyección intracameral so para un ojo
- Coloque un ratón C57B6/J macho de 9 a 10 semanas de edad en una cámara de inducción con 3% de isoflurano mezclado con oxígeno a 2 L/min durante 3 min.
- Inyección intraperitoneal 2,2,2-tribromoetanol a 0,3 mg/g de peso corporal.
NOTA: A diferencia de la ketamina/xilazina, 2,2,2-tribromoetanol no causa dilatación obvia de la pupila. - Compruebe la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del bato y la falta de movimiento de los bigotes o la cola para determinar la fuerza anestésica.
- Coloque el ratón en posición lateral sobre una plataforma de cirugía. Para reducir su sensibilidad durante el procedimiento, aplique una gota de clorhidrato de proparacaína al 0,5% en la córnea antes de la inyección.
- Haga una incisión de entrada con la aguja de paracentesis de 32 G en el cuadrante superotemporal, a unos 0,5 mm del limbo.
- Túnel a través de las capas de la córnea durante aproximadamente 0,3 mm antes de perforar en la cámara anterior. Tenga cuidado de no tocar la lente o el iris.
- Retirar la aguja lentamente para liberar un poco de humor acuoso (alrededor de 1 x 2 l) de la cámara anterior a través del túnel (paracentesis).
- Espere 8 minutos para disminuir aún más el IOP. Esto se puede determinar midiendo el ojo de control contralateral.
- Inserte la micropipeta de vidrio precargada con SO a través del túnel corneal en la cámara anterior, con el bisel hacia abajo hasta la superficie del iris.
- Empuje el émbolo de la jeringa lentamente para inyectar SO en la cámara anterior hasta que la gota SO cubra la mayor parte de la superficie del iris, de 2,3 x 2,4 mm de diámetro.
- Deje el micropipeta en la cámara anterior durante 10 s más antes de retirarlo lentamente.
- Empuje suavemente el párpado superior para cerrar la incisión de la córnea para minimizar la fuga de SO.
- Aplique un ung mento antibiótico (bacitracina-neomicina-polimicina) en la superficie del ojo.
- A lo largo del procedimiento, con frecuencia humedezca la córnea con lágrimas artificiales.
- Mantenga el ratón en la almohadilla de calentamiento hasta que esté completamente recuperado de la anestesia.
3. Tan remoción
- Preparen el sistema de riego.
- Preparar la solución de riego de acuerdo con las instrucciones del fabricante y colocarla en la botella de riego. Elevar el frasco de solución de irrigación a 110-120 cm (81-88 mmHg) por encima de la plataforma de cirugía.
- Coloque un conjunto de administración IV en el frasco de solución de riego. Retire las burbujas de aire del tubo IV. Conecte una aguja de 33 G doblada a una cara de 20o hasta el tubo IV.
- Para preparar el sistema de drenaje, retire el émbolo de una jeringa de 1 ml. Fije una aguja de 33 G a la jeringa y doble la aguja a 20o.
- Retire EL de la cámara anterior.
- Inyección intraperitoneal 2,2,2-tribromoetanol (0,3 mg/g de peso corporal). Compruebe la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo para determinar la fuerza anestésica y la falta de movimiento de los bigotes o la cola.
- Coloque el ratón sobre una plataforma de cirugía y fíjelo en la posición lateral con cinta adhesiva. Aplicar una gota de 0.5% clorhidrato de proparacaína a la córnea para reducir su sensibilidad.
- Haga dos incisiones en el cuadrante temporal de la córnea entre las 2 y las 5 en el borde de la gota SO utilizando la aguja de paracentesis de 32 G prefabricada.
- Inserte una aguja de riego de 33 G conectada a una solución de riego a través de una incisión corneal, velocidad máxima.
- Inserte otra aguja de drenaje de 33 G unida a la jeringa sin un émbolo a través de la otra incisión corneal para permitir que la gota SO salga de la cámara anterior mientras regará con solución de riego.
- Retire la aguja de drenaje y, a continuación, la aguja de riego.
- Inyecte una burbuja de aire en la cámara anterior para mantener su profundidad normal y presione para cerrar la incisión corneal.
- Aplique pomada antibiótica en ambos ojos.
- Mantenga el ratón en la almohadilla de recuperación de calentamiento hasta que esté completamente recuperado de la anestesia.
4. Medición de la PIO una vez a la semana
- Coloque el ratón en una cámara de inducción perfundida con 3% de isoflurano mezclado con oxígeno a 2L/min durante 3 min.
- Inyección intraperitoneal y ketamina (0,01 mg de xilazina/g, 0,08 mg de ketamina/g).
- Mantenga la córnea húmeda aplicando lágrimas artificiales durante todo el procedimiento.
- Espere unos 15 minutos para permitir que la pupila se dilata por completo.
- Mida el IOP de ambos ojos usando un tonómetro de acuerdo con las instrucciones del producto. Lleve el tonómetro cerca del ojo del ratón. Mantenga la distancia desde la punta de la sonda hasta la córnea del ratón a unos 3 x 4 mm. Pulse el botón de medición 6x para generar una lectura. Se obtienen tres lecturas generadas por máquina de cada ojo para adquirir la PIO media.
- Sacrificar a los animales a las 8 semanas después de la inyección de SO y realizar inmunohistoquímica de la retina de montaje completo, conteo de RGC, secciones semidelgadas del nervio óptico (ON) y cuantificación de los axones supervivientes, que se han descrito antes de13.
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Representative Results
Poco después de la inyección podemos identificar fácilmente ratones que no producen hipertensión ocular estable debido a que las gotas SO son demasiado pequeñas (1,5 mm)13. Estos animales están excluidos de experimentos posteriores. Después de los procedimientos de inyección, más del 80% de los ratones inyectados en SO terminan con gotas de más de 1,6 mm. Medimos el IOP de estos ojos del ratón una vez a la semana durante 8 semanas después de una sola inyección de SO. El PIO del ojo que recibe SO se mantuvo alto, generalmente el doble de la PIO del ojo de control contralateral, lo que indica un bloqueo eficaz de la pupila(Figura 1). El edema en la córnea del ratón se puede controlar bajo un microscopio de disección ligera después de una inyección intracameral que normalmente tarda 2 o 3 días en recuperarse. La dilatación de la pupila toma tiempo, y uno debe esperar a la dilatación de la pupila antes de tomar la medición de IOP. Por lo tanto, tratamos de no medir la PIO demasiado pronto después de una inyección. Por la misma razón, no recomendamos medir el Pio con demasiada frecuencia. Con otro grupo de ratones, expulsamos el SO de la cámara anterior 2 semanas después de la inyección de SO, y esperábamos otra semana para permitir que la córnea se recuperara antes de medir la PIO, que devolvió establemente el IOP a la normalidad(Figura 1).
Para determinar los efectos de la hipertensión ocular inducida por la inyección de SO en los RGC, cuantificamos los somatas RGC supervivientes en las regiones periféricas de los montajes enteros de la retina por tinción RBPMS14,15 y los axones supervivientes en las secciones transversales de la ON semidelgadas por tinción PPD16 a las 8 semanas después de la inyección de SO. La muerte por Glaucomatous RGC y la degeneración del axón fueron dramáticas en la hipertensión ocular inducida por SO los ojos subdetectados (SOHU)(Figura 2). En la sección de discusión se proporcionan más detalles al respecto.
Figura 1: Mediciones de Pio en ojos SO y ojos de control contralateral, con o sin eliminación de SO. So - So injected eyes; CL - Ojos de control contralateral. Los datos se presentan como medias: S.E.M, n. 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Glaucomatous RGC soma y degeneración de axón en SOHU. (A) El panel superior representa la región periférica que muestra RGCs (RBPMS+, rojo) a las 8 semanas después de la inyección de RETINAs montadas en todo. Barra de escala de 20 m. El panel inferior muestra imágenes semifinas de secciones transversales de la ON teñidas con PPD a las 8 semanas después de la inyección de SO. Barra de escala a 10 m.(B) Datos de cuantificación de los RGC supervivientes en la retina periférica (n a 12) y los axones en el ON (n a 10) a las 8 semanas después de la inyección de SO en comparación con los ojos de control contralateral (CL). Los datos se presentan como medios : S.E.M. ****: P < 0.0001; El examen t del estudiante. RGC - célula ganglionera de la retina; ON - nervio óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí demostramos un procedimiento simple pero eficaz para inducir la elevación sostenida de la PIO en el ojo del ratón por inyección intracameral de SO. Este procedimiento puede ser aprendido rápidamente por cualquier persona con experiencia en microdisección bajo un microscopio. El principal riesgo potencial de falla es la fuga de SO de la incisión corneal. Sin embargo, una de las ventajas de usar SO es que debido a que la gota de aceite es visible y medible, podemos identificar fácilmente ratones que recibieron gotas demasiado pequeñas para inducir hipertensión ocular estable poco después de la inyección y excluirlas de experimentos posteriores. Hemos logrado rutinariamente una tasa de éxito del 80% y excluido alrededor del 20% de los ratones debido a una pequeña gota SO (1,5 mm)13. Sin embargo, un cirujano experimentado que puede hacer un túnel relativamente largo (0,3 mm) dentro de las capas de la córnea antes de penetrar la córnea en la cámara anterior con la punta biselada puede casi prevenir cualquier fuga de SO haciendo que la abertura interna del túnel corneal sea mucho más pequeña que la abertura externa. Por lo tanto, casi todos los ratones fueron inyectados con una gota SO de más de 1,8 mm. Además de la longitud del túnel, vale la pena enfatizar algunos otros puntos críticos. En primer lugar, es importante mantener el IOP bajo en el ojo inyectado para evitar empujar el SO fuera de la cámara anterior. Un error común es inyectar demasiado SO, lo que hace que las fugas sean más fáciles. Limitamos el volumen de SO en la cámara anterior para que casi, pero no totalmente, cubra la superficie del iris. El diámetro de esta gota SO es de 2,3 x 2,4 mm. En segundo lugar, la incisión del túnel corneal se hace lo más cerca posible del limbo para permitir que la incisión se acerque al iris pero no la lastime, de modo que el iris pueda tomar fácilmente la incisión. En tercer lugar, la velocidad de inyección debe ser lo más lenta posible para evitar el desbordamiento excesivo de SO en la cámara anterior. En cuarto lugar, el masaje del párpado superior después de la inyección ayuda a la incisión corneal a cerrarse y a veces ayuda a las sinechias anteriores del iris periférico a cerrar la incisión corneal, y por lo tanto para evitar fugas de aceite.
Hay un aumento en el IOP sólo en la parte posterior del ojo, pero no en la cámara anterior, por lo que es una característica única de este modelo. El bloqueo de pupilas evita la entrada de humor acuoso en la cámara anterior y, por lo tanto, aumenta la PIO solo en la parte posterior. La barrera física formada por el SO junto con el iris y la lente ocular grande pueden desconectar la cámara anterior del segmento posterior, lo que puede limitar la elevación de la PIO sólo en el segmento posterior, donde se acumula el material acuoso. Cuando la pupila del ratón es más grande que la gota SO después de la dilatación, las cámaras anterior y posterior se vuelven a conectar, lo que permite un rápido aumento de la PIO en la cámara anterior por inundación acuosa en ella. Por lo tanto, un tonómetro sólo puede detectar el aumento de IOP después de quitar el bloque pupilar, por lo que el verdadero PIO en el segmento posterior es sin duda subestimado. Por lo tanto, nombramos a este modelo el modelo de hipertensión ocular inducida por SO (SOHU), que refleja de forma más precisa y útil esta característica clave del modelo. Sería mejor poder medir el IOP en el segmento posterior directamente, pero hasta ahora no es posible. Esta singular patogénesis del modelo SOHU tiene dos características ventajosas: en primer lugar, los ojos experimentales tienen elementos oculares claros que permiten la evaluación in vivo de la función visual y morfología y en segundo lugar, la neurodegeneración glaucomatosa grave permite detectar cualquier beneficio de las pruebas de neuroprotección.
Inyección DE SO puede causar edema corneal temporalmente y recomendamos no realizar mediciones de PIO demasiado pronto o con demasiada frecuencia. No detectamos ninguna inflamación en la cámara anterior o córnea en los ojos SOHU, aunque nos encontramos con dos casos de neovascularización de córnea en los más de 100 ratones que recibieron inyecciones de SO.
Debido a que SO causa hipertensión ocular tanto en pacientes humanos como en ratones, es razonable postular que este modelo de glaucoma conceptualmente novedoso y prácticamente significativo se puede adaptar para animales más grandes que son más adecuados para aplicaciones preclínicas. La caracterización de los déficits en la función neuronal y la morfología de este modelo sin duda animará a otros investigadores a aprovecharlo para perseguir cuestiones importantes con respecto al glaucoma y, aún más ampliamente, las enfermedades que inducen RGC y ON Degeneración.
En resumen, se trata de un modelo sencillo de glaucoma animal que no requiere equipo especial o lesiones repetidas y puede ser aplicable a otras especies animales. Intrigantemente, la elevación IOP del modelo SOHU se puede revertir eliminando el aceite de la cámara anterior, por lo que es útil para el cribado del tratamiento neuroprotector combinado con terapias de reducción de IOP.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por las subvenciones DE NIH EY024932, EY023295 y EY028106 a YH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
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