Summary
مطلوب تطوير نماذج murine مع جينات محدده تحور في مرضي سرطان الراس والرقبة لفهم الأورام. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول للتحول في المختبر من خلايا اللسان الاوليه murine باستخدام نظام الفيروسات المرتبطة adeno-كاس 9 لتوليد murine الخلايا HNC خطوط مع التعديلات الجينية محدده.
Abstract
استخدام الخلايا الظهاريه العادية الاوليه يجعل من الممكن التكرار الحث علي التغييرات الجينية اللازمة للتحول الخلوي من خلال إدخال طفرات محدده في الجينات المثبطة والجينات القمعية الورم ، وذلك باستخدام متفاوت المسافات التنظيمية المتداخلة تقنيه تحرير الجينوم القائمة علي الجينات القصيرة (CRISPR) في الفئران. هذه التكنولوجيا تسمح لنا لمحاكاة بدقه التغيرات الجينية التي تحدث في السرطانات البشرية باستخدام الفئران. من خلال تحويل وراثيا الخلايا الاوليه murine ، يمكننا دراسة أفضل لتطوير السرطان ، والتقدم ، والعلاج ، والتشخيص. في هذه الدراسة ، استخدمنا Cre-المحرض كاس 9 اللسان الماوس الخلايا الظهاريه لتمكين الجينوم التحرير باستخدام الفيروسات المرتبطة adeno (AAV) في المختبر. علي وجه التحديد ، عن طريق تغيير KRAS ، p53 ، و APC في الخلايا الظهاريه اللسان العادية ، ونحن ولدت الراس والرقبة murine السرطان (HNC) خط الخلية في المختبر ، والذي هو توموريغينيك في الفئران المتزامنة. تصف الطريقة المعروضة هنا بالتفصيل كيفيه توليد الخطوط الخلوية HNC مع التعديلات الجينية محدده ويشرح ملاءمتها للتنبؤ تطور الورم في الفئران المتزامنة. ونحن نتصور ان هذه الطريقة الواعدة ستكون مفيده لدراسة البيولوجيا السرطانية والعلاج من HNC.
Introduction
HNC هو الخبيثة الشائعة في جميع انحاء العالم1. نمذجة نشاه الأورام HNC حاليا في نقطه تحول العلمية2. في حين تم التعرف علي العديد من الطفرات الجينية في hnc2،3،4 (مثل ، TP53 ، PIK3CA ، NOTCH1 ، FAT1 ، وراس) التوليفات محدده من التعديلات الجينية المطلوبة في الحفل للحث علي hnc تبقي غير واضحة.
وقد ساعد الاستخدام الحالي للخطوط الخلوية HNC البشرية بشكل كبير لتوضيح أليات المرتبطة بالتسبب والعلاج3. ومع ذلك ، فان دراسة خطوط الخلايا البشرية في أنظمه الجينات المناعية لها حدودها ، لان هذه الانظمه لا تعالج عمليه الأورام المجهرية ، ودور طفرات جينيه محدده ، واستجابات العلاج في بيئة ميكرومناعيه. التالي ، فان تطوير وإنشاء خطوط خلايا murine مع التعديلات الجينية المحددة هي ذات اهميه أساسيه لدراسة كيفيه مساهمه الجينات المختلفة في عمليه التحول واختبار العلاجات الجديدة القائمة علي جزيء في الفئران المناعية.
وقد تاثرت دراسات وظائف الجينات في البحوث الطبية الحيوية بشكل كبير بالتقدم في تكنولوجيات تحرير الحمض النووي ، من خلال إدخال فواصل مزدوجة الحبل (DSBs) ، علي سبيل المثال5. هذه التكنولوجيات ، بما في ذلك استخدام الزنك الاصبع السبابة ، النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب ، وتكرار الفاصلة التنظيمية متباعدة المتداخلة (CRISPR/كاس 9) ، تسمح للتلاعب من اي جين الفائدة في موضعها. وتتالف أحدث أنظمه CRISPR/كاس 9 من دليل RNA (gRNA) الذي يوجه النيوداز كاس 9 لتوليد DSB في موقع معين في الجينوم. وقد اكتسب هذا النظام اعترافا واسع النطاق في تعديل الجينات الذاتية في اي خليه أو الانسجه المستهدفة ، حتى في الكائنات الأكثر صعوبة لعلاج التقليدية5. لديها مزايا متعددة علي الانظمه الأخرى نظرا لبساطتها ، والسرعة ، والكفاءة.
في مجال الأورام ، حققت تقنيه CRISPR/كاس 9 الحاجة إلى تقليد الخلايا السرطانية بشكل فعال. لإنشاء هذا النظام في hnc ، ونحن التلاعب القوية kras ورمي واثنين من الجينات المثبطة الأورام الهامه ، APC و p536. وفقا لقاعده بيانات الجني7، وهذا المزيج هو نادر في hnc. الطفرات RAS (HRAS ، NRAS ، و KRAS) موجودة في فقط ~ 7 ٪ من جميع السكان HNC. هذه الأورام تميل إلى ان تكون مقاومه للعلاج8،9.
ويتحقق تسليم كاس 9 والgrna من خلال المحولات الفيروسية باستخدام الطائرات بالطائرة أو اللينتيفيروسيس. المؤتلف AAV غالبا ما يكون الأسلوب المفضل لتقديم الجينات إلى الخلايا المستهدفة نظرا لارتفاع titer ، استجابه مناعية خفيفه ، والقدرة علي نقل مجموعه واسعه من الخلايا ، والسلامة العامة. باستخدام نظام AAV ، تم إنشاء خطوط خلايا الماوس المختلفة الانسجه الخاصة ، وخطوط الخلايا الجديدة لا تزال قيد التطوير10،11،12. ومع ذلك ، فان نظام التحرير الجيني الفعال الذي يمكن ان يولد خلايا نماذج خطوط الخلية التي لا يزال يتعين تطويرها. في هذه الدراسة ، سعينا لتطوير نظام القائم علي كاس 9 في المختبر لتحويل خلايا اللسان الاوليه murine إلى حاله الأورام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول فريدة من نوعها CRISPR/كاس 9 التحول وخط الخلايا السرطانية التي أنشئت لفهم أفضل بيولوجيا HNC الناجمة عن تنوع التغييرات الجينوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة علي هذه الدراسة من قبل جامعه بن غوريون في لجنه رعاية واستخدام الماشية في النقب. تمت الموافقة علي التجارب الحيوانية من قبل IACUC (80-12-2015 و IL. 29-05-2018 (ه)). وكانت جميع جوانب اختبار الحيوانية ، والإسكان ، والظروف البيئية المستخدمة في هذه الدراسة في الامتثال للدليل لرعاية واستخدام المختبر الحيوانية13.
1. adeno-إنتاج الفيروسات المرتبطة
- اليوم الأول: ثقافة الخلية
- البذور 4 × 106 خلايا HEK293T في لوحه 14.5 سم في 15 مل من dmem. اعداد 10 لوحات للتحويل مع بوليثيلينمين (PEI) (1 ميكروغرام/μL).
- اليوم الثاني: الانتقال من خلايا HEK293T باستخدام PEI
- أزاله الوسائط وأعاده التغذية مع DMEM الدافئة 1 ح قبل التحويل.
- الكواشف العابرة الدافئة و DMEM.
- استخدام 10 ميكروغرام من البلازميد من الفائدة التي تحتوي علي aav itr (aav pCM109 EFS cre sg APC sg kras sg P53-kras HDR) ، 10 ميكروغرام من aav 2/9n كابسيد البلازميد (مع الجينات rep من AAV2 والجينات الغطاء من AAV9 ، و 10 ميكروغرام من البلازميد المساعد (paddelta F5 المساعد) لكل لوحه (انظر جدول المواد).
ملاحظه: جيل جديد من المساعد البلازميد-pAdDeltaF614،15،16 التي يمكن أيضا ان تستخدم لإنتاج aav هو متاح. - اخلط البلازميدات في 1 مل من DMEM عادي لكل لوحه. ثم أضافه 90 μl من بوليثيلينيماين (مجموع البلازميد: تركيز PEI = 1:3) إلى مزيج البلازميد ودوامه لفتره وجيزة.
- احتضان مزيج الحمض النووي PEI-plasmid لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
- أضافه القطرات المختلطة علي راس الخلايا HEK293T ونقل لوحات إلى الحاضنة ثقافة الخلية في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 ل 24 ساعة.
- اليوم الثالث: تغيير متوسط بعد التحويل
- أزاله المتوسطة تماما وأضافه 15 مل من DMEM الطازجة.
- اليوم الخامس: حصاد الفيروس
- اعداد حمام الثلج الجاف/الايثانول.
- جمع الخلايا مع مكشطه الخلية ونقلها إلى أنابيب 50 mL (2 لوحات لكل أنبوب 50 mL).
- تدور أنابيب في 800 x g لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- تخلص من الديدان الفائقة من جميع الأنابيب. أضافه 0.5 mL من العازلة تحلل (150 mM كلوريد الصوديوم ، 50 mM تريس-HCl ، pH = 8.5) لكل لوحه (اي ، 5 مل ل 10 لوحات) إلى الأنبوب الأول فقط. أعاده تعليق الخلايا ونقل الحجم الكلي إلى الأنبوب التالي والاستمرار حتى الأنبوب الأخير.
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 mL الطازجة. غسل الأنابيب مع نفس الحجم من تحلل العازلة (0.5 مل لكل لوحه) باستخدام نفس طريقه النقل كما هو موضح في الخطوة 1.4.4.
- موضوع تعليق الخلية إلى ثلاث جولات من ~ 10 دقيقه تجميد/ذوبان دورات بين الجليد الجاف/الايثانول حمام وحمام مياه 37 درجه مئوية. دوامه لفتره وجيزة بعد كل ذوبان.
- إذا تم اجراء التنقية في نفس اليوم ، قم بتعيين المخزن المؤقت لتاخيرمن والشطف (انظر الجدول 1 للوصفة) في RT.
- أضافه 50 وحدات من البنبوناز لكل لوحه واحتضان في 37 درجه مئوية ل 1.5 h.
ملاحظه: يستخدم البنبوناز لهضم الأحماض النووية المتبقية من الخلايا المنتجة المضيفة والحمض النووي البلازميد الموجود في تعليق الخلية. - تدور الأنابيب في 3,000 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c.
- جمع ماده طافي في حقنه باستخدام ابره الصلب 18 G ودفع الحل من خلال فلتر 0.45 μm في أنبوب 15 مل للحصول علي lysate الخام.
- يخزن الليمات الخام عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لبضعة أسابيع حتى التنقية أو الاستمرار في التنقية.
2. AAV تنقيه
- اليوم الخامس أو الأحدث
- وضع المخزن المؤقت تاخيرمن والتملص في RT.
- غسل الاعمده اللونية مع 10 مل من المخزن المؤقت تاخيرمن.
- أضافه 0.5 mL لكل صفيحه من الهيبارين-اجنشا إلى العمود17 ثم قم باضافه المخزن المؤقت تاخيرمن (4x حجم الهيبارين-اجنشا). خلط الحلول عن طريق عكس العمود والسماح لرواسب الاغاروزها.
- Elute تاخيرمن العازلة من العمود بواسطة الجاذبية.
ملاحظه: ترك بعض تاخيرمن المخزن المؤقت لمنع اجنشا من التجفيف. - تحميل محلله الخام علي العمود واحتضان لمده 2 ح في 4 درجه مئوية مع الانفعالات المستمرة. جعل العمود في وضع تستقيم والسماح لل الاغاروزها إلى الرواسب.
- Elute الخام محلله بالجاذبية.
- غسل العمود مع تاخيرمن العازلة (4x حجم الهيبارين-اجنشا).
- وضع فلتر بروتين الطرد المركزي 100 دهت تحت العمود و الوت الفيروس باستخدام العازلة الشطف (3x حجم الهيبارين-اجنشا) في فلتر.
ملاحظه: يجب ان لا يتجاوز المخزن المؤقت التملص 15 مل. - الطرد المركزي فلتر في 3,000 x g لمده ~ 30 دقيقه حتى اقل من 1 مل يترك في الفلتر.
- ملء فلتر مع تلفزيوني وأجهزه الطرد المركزي في 3,000 x g ل ~ 30 دقيقه حتى يتم ترك اقل من 1 مل في فلتر. كرر هذه الخطوة 2x لأزاله جميع الأملاح.
- التركيز علي حل الفيروس في تصفيه بواسطة طرد في 3,000 x g للوصول إلى وحده تخزين صغيره قدر الإمكان (اقل من 200 μl).
- يستنشق محلول الفيروس مع ابره وحقنه ودفع الحل من خلال فلتر 0.22 μm في أنبوب.
- جعل الارصفه من الجزيئات الفيروسية المركزة للتخزين.
ملاحظه: يجب ان يكون قسامات ~ 20 μl للتخزين علي المدى القصير في 4 درجه مئوية و ~ 5 μl للتخزين علي المدى الطويل في-80 درجه مئوية. - تحديد الفيروسية عيار وكفاءه المحولات الفيروسية كما هو موضح سابقا14،18،19،20.
3-عزل الخلايا الاوليه وثقافتها
- اليوم الأول
- موت ببطء ذكر أو انثي B6 يبلغ من العمر 6 أسابيع ؛ 129-Gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-كاس 9 *,-EGFP) Fezh/J من قبل CO2 خنق أو اي بروتوكول آخر وافق iacuc.
ملاحظه: هذه الفئران CRISPR/كاس 9 المطرقة لديها Cre للالطبيعيه الاعتماد علي التعبير من كاس 9 نوكليوداز و egfp إخراج المروج CAG. المنبع Lox-Stop-Lox (LSL) تسلسل الموجودة في الجينوم من هذه الفئران منع التعبير عن كاس 9 و EGFP في غياب Cre للالطبيعيه. عند استخدامها في تركيبه مع دليل واحد RNAs (sgRNAs) ومصدر Cre ، فانها تسمح بتحرير جينات الماوس واحد أو متعددة في الجسم البشري أو السابق المجري14. - تشريح اللسان من الفئران رحيم باستخدام مقص الجراحية.
- فك النسيج يدويا عن طريق فرم نسيج اللسان في أجزاء صغيره جدا باستخدام مشرط. جمع شظايا الانسجه في أنبوب 15 مل تحتوي علي 4.5 مل من متوسط RPMI عادي (مع المصل خارج).
- يضاف مزيج الانزيم الثلاثي (200 μl) (انظر الجدول 1 للوصفة) إلى شظايا الانسجه.
- احتضان مزيج الانسجه والانزيمات في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه والاستفادة من أنبوب كل 10 دقيقه لتعزيز التفكك الانزيمي للانسجه.
- أضافه 5 ٪ مصل الأبقار الجنينية (التي تحتوي علي HBSS/التلفزيونية إلى مزيج الانسجه والانزيمات لوقف عمل الانزيم.
- تصفيه تعليق الخلية أعلاه من خلال شبكه النايلون 70 μm معقمه لفصل الخلايا المشتتة وشظايا الانسجه أكبر.
- غسل تعليق الخلية المصفاة من قبل طرد ل 300 x g لمده 5 دقيقه في hbss/تلفزيوني في RT.
- أعاده تعليق بيليه في الثقافة المتوسطة (10 ٪ في RPMI/DMEM) وتنمو في الاطباق الثقافية 60 مم حتى تتشكل مستعمرات الخلايا المتميزة.
- يتم الاحتفاظ بمجاميع الخلايا الثقافية فوق الفلتر في طبق ثقافة 60 ملم يحتوي علي 3 مل من وسائل الاعلام الكاملة (10% من الوحدات في RPMI/DMEM) حتى تتشكل مستعمرات الخلايا.
- مجهريا فحص الخلايا الاساسيه لوجود التلوث الليفي بعد أسبوع واحد من الثقافة. علاج الخلايا الاساسيه التي تم تطويرها من المجاميع وتعليق الخلية مع 0.25 تريبسين 0.02% الحل أدتا في 37 درجه مئوية لمده 1 دقيقه لأزاله الليفية.
ملاحظه: عاده ما تنتج الثقافة الاساسيه من مجاميع الخلايا المزيد من المستعمرات مقارنه بالمعلقات أحاديه الخلية. الخلايا من هذه المستعمرات توفير أفضل كفاءه المحولة مع محول AAV.
- موت ببطء ذكر أو انثي B6 يبلغ من العمر 6 أسابيع ؛ 129-Gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-كاس 9 *,-EGFP) Fezh/J من قبل CO2 خنق أو اي بروتوكول آخر وافق iacuc.
4. AAV محول الخلايا الاوليه
- اليوم العاشر
- البذور 2 × 105 الخلايا الاوليه في بئر في 6 لوحات جيدا في 2 مل من وسائل الاعلام الكاملة (10 ٪ في RPMI/dmem).
- في اليوم التالي ، transduce الخلايا مع 1012 الجينوم الفيروسي/مل(10 8 وحدات نقل/مل) واحتضان الخلايا في وسائل الاعلام التي تحتوي علي الجسيمات الفيروسية ل 48 h في 37 درجه مئوية.
- أزاله وسائل الاعلام التي تحتوي علي الجسيمات الفيروسية وإطعام الخلايا AAV-محول مع وسائل الاعلام الكاملة.
ملاحظه: سيتم فقط الخلايا التي خضعت لمحول التعبير عن GFP والبدء في التكاثر. الخلايا التي لم تخضع لعمليه التوصيل ستموت في نهاية المطاف في غضون أسبوعين. - بعد 2 أسابيع من التوسع الثقافي ، بذور الخلايا للتحقق من صحة والتجارب الحيوية في الجسم الحيوي.
ملاحظه: تم استخراج الجينات الجينية من الخلايا المحولة للخلايا والخلايا الاساسيه العادية من الفئران كاس 9 للتحقق من صحة الجينوم معينه التحرير باستخدام البروتوكولات القياسية. وأجريت عمليه تسلسل الحمض النووي المستخرج وتحليل البيانات المتسلسلة (الجدول 2) باستخدام اختبار تسلسل الجيل التالي القائم علي التقاط التهجين (مثلا ، منصة MSK-IMPACT) علي النحو الموصوف سابقا في21.
5. التحقق من تحويل الخلايا الطبيعية إلى الخلايا المولدة باستخدام المناعي والتنقيط الغربية
- مناعي
- البذور 2 × 105 خلايا علي 12 مم الزجاج coverslips ووضعها في حاضنه بين عشيه وضحيها.
- إصلاح الخلايا في 4 ٪ بارافورمالدهيد في الاذاعه التلفزيونية (pH = 7.4) وعمليه لوضع العلامات المناعي.
- احتضان الخلايا الثابتة مع أول الأجسام المضادة الاوليه في 1 ٪ بوسني أو 1 ٪ مصل في PBST في غرفه ترطيب لمده 1 ساعة في RT أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. الأجسام المضادة الرئيسية المستخدمة هي الأرنب الأحادي المضادة لل KRT 14 ، الأرنب الأحادي المضادة لل-الكترونيه-cملتصقون ، و كاس 9 الماوس ماب.
- أزاله حل الأجسام المضادة الاساسيه من الشفتين عن طريق غسل الخلايا 3x لمده 5 دقائق مع 1x تلفزيوني.
- احتضان الخلايا مع Cy3 حمار مكافحه الأرنب مفتش و/أو Cy3 الماعز مكافحه الماوس مفتش الأجسام المضادة الثانوية في الجيش الصربي البوسني 5 ٪ في PBST ل 1 ح في RT في الظلام.
- أزاله حل الأجسام المضادة الثانوية من الشفتين وغسل الخلايا 3x كما هو موضح في الخطوة 5.1.4.
- جبل الشفتين مع قطره من المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي علي DAPI (DAPI فلوروماونت).
- يخزن في الظلام عند درجه حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم تصوير الشرائح باستخدام المجهر الفلوري.
- غربيه يلطخ
- البذور 1 × 106 الخلايا المحولة في طبق الثقافة 100 ملم ووضعها في حاضنه بين عشيه وضحيها.
- غسل وكشط الخلايا المحولة إلى 200 ميكرولتر الجليد الباردة تلفزيوني.
- الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي علي تعليق الخلية لمده 10 دقيقه في 2,000 x g في 4 درجه مئوية إلى بيليه الخلايا.
- يستنشق ماده طافي وlyse الخلايا باستخدام تحلل العازلة (انظر الجدول 1) التي تحتوي علي الفوسفاتيز المثبط الكوكتيلات ومثبط الانزيم البروتيني لمده 10 دقيقه في 4 ° c. الطرد المركزي لست] لمده 10 دقيقه في 10,000 x g و 4 درجه مئوية وجمع لست] مسح.
- استخدم طقم فحص برادفورد متاح تجاريا لتحديد تركيز البروتين بعد بروتوكول الشركة المصنعة. استخدام العازلة عينه 4x (500 mM تريس الأس الهيدروجيني = 6.8 ، 40 ٪ الجلسرين ، 8 ٪ SDS ، 20 ٪ H2O ، 0.02 ٪ بروموفينول الأزرق) لضبط عينات البروتين إلى 0.5 أو 1 ميكروغرام/Μl. يغلي عند 96 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
ملاحظه: يمكن تخزين العينات في-80 درجه مئوية أو حتى يتم اجراء تحليل لطخه الغربية. - منفصلة كميات متساوية من مجموع محلله (30 ميكروغرام) بنسبه 10 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل-بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS-صفحه). تاكد من ان الصبغة تصل إلى الجزء السفلي من الهلام. نقل البروتين إلى غشاء النايلون عن طريق شبه الجافة التنقيط في 25 فولت لمده 30 دقيقه.
- اسكب 5% من الجيش البوسني الصربي في تريس-المحلول الملحي المخزن (TBS)-0.1% توين (TWEEN) علي الغشاء لتغطيته تماما. كتله الغشاء لمده 1 ساعة في RT. احتضان mebrane مع الأجسام المضادة الاوليه (المضادة--Cre ، المضادة--كاس 9 ، المضادة--GFP ، المضادة--β catenin ، مكافحه p53 ، المضادة--فوسفس--كيرك ، والمضادة--β.
- بعد الحضانة ، وغسل الاغشيه لمده 10 دقيقه مع 1x TBST التاكد من ان الحل يغطي الغشاء تماما. أداء هذا الغسيل 3x ، ومن ثم أضافه البيروكسيديز الفجل (الأس)-الأجسام المضادة الثانوية مترافق (المخفف 1:10000 في 5 ٪ بوسنيا TBST) إلى الغشاء. احتضان لمده 1 ساعة في RT.
- بعد الحضانة ، وغسل الاغشيه لمده 10 دقيقه مع 1x TBST التاكد من ان الحل يغطي الغشاء تماما. اجراء التصوير الكيميائي التلالؤ (انظر جدول المواد) لفضح العصابات ، والتقاط الصور وفقا لذلك.
- التحقق من الإمكانات المولدة للخلايا المتحولة في الفئران المناعية
ملاحظه: تم الحفاظ علي الفئران ومعالجتها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعه بن غوريون في النقب. موافقه. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (إيماءه. SCID) و C57BL/6 وقد استخدمت الفئران للدراسات في الجسم المجري. وقد تم إسكان الفئران في خزانات تدفق الهواء المصفاة مع 12 ساعة ضوء/الظلام دوره وكانت تغذي الغذاء والماء الإعلان libitum.- استخدام 6-8 العمر الأسبوع الإناث إيماءه. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (إيماءه. SCID) و C57BL/6 الفئران للدراسة.
- [ترسنزيز] ال [اف-كاس 9] يحول خلايا. إيقاف التريسينزيشن باستخدام DMEM يسخن في 37 درجه مئوية وجمع في أنبوب 50 mL.
- الطرد المركزي أنبوب في 800 x g لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في المتوسطة dmem دون المنفذة. تنفيذ طرد مره أخرى وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1x تلفزيوني.
ملاحظه: لا تحتفظ الخلايا في 1x تلفزيوني لفتره طويلة جدا. دائما الحفاظ علي تعليق الخلية علي الجليد لمنع تكتل الخلايا. - استخدام عداد الخلية التلقائي لحساب الخلايا وتمييع الخلايا إلى التركيز المطلوب (2.5 x 107 خلايا/مل) باستخدام 1X تلفزيوني. توليد الأورام من خلال حقن تحت الجلد من كاس 9 الخلية تحولت تعليق في الجناح الأيمن من كل إيماءه. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (إيماءه. SCID) الماوس (2 × 106 خلايا/الماوس). لتوليد نموذج الانسيابية في الفئران المتزامنة, حقن 0.5 × 106 الخلايا الاوليه أو كاس 9 تحويل الخلايا في اللسان C57BL/6 الفئران المناعية.
- موت ببطء الماشية 2 أسابيع بعد الحقن بواسطة CO2 خنق ، وتشريح الأورام من الفئران الرحيمة لتحليل المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام نظام AAV لتحويل خلايا كاس 9 العادية
ويقدم الشكل 1 خريطة مفصله لناقلات البلازما المستخدمة في هذه الدراسة. ويبين الشكل 2 تصميم وعمل النظام القائم علي كاس 9. ولإنتاج جزيئات فيروسية ، تم تحويل الخلايا HEK293T إلى ناقلات الجينات الناقلة للمركبات وناقلات التعبئة الفيروسية الأخرى باستخدام طريقه التحويل من جزيرة برنس ادوارد. وبعد التحويل ، تم جمع الخلايا المحتوية علي الفيروس ومعالجتها ، وباستخدام عمليه تنقيه الهيبارين ، تم تنقيه الجزيئات الفيروسية وتركيزها (الشكل 2ا). وقد استخدمت هذه الجزيئات الفيروسية المنقية للتحول في المختبر من الخلايا الاوليه المعزولة من كاس 9 الفئران للتحقق من فعاليه. في نظامنا ، يتم تقديم كاسيت التعبير عبر الجينات AAV من خلال أعاده دمج المتماثلة في قالب استهداف كاس 9 Rosa26 التابعة Cre داخل خلايا الماوس التي تحمل المروج CAG في كل مكان (pCAG) ، كاسيت LoxP-Stop-LoxP (LSL) ، وهو جين النيوداز كاس 9 ، الببتيد P2A الذاتي ، والجينات مراسل (EGFP) يحيط بها اثنين من الاسلحه المتماثلة14. النشاط Cre للالطبيعيه من الخلايا محوله لل LSL ويدفع كاس 9 والتعبير GFP (الشكل 2ب). كاس 9 النشاط النيوداز يدخل كسر مزدوجة تقطعت بهم السبل في المواقع المستهدفة من الفائدة ، وتوجيهها من خلال gRNAs ، ويساعد في تحرير الجينات. نظام aav المستخدمة في هذه الدراسة يساعد في تقديم grnas تعدد الإرسال (sgrnas ل kras ، p53 ، APC) وأيضا في التعبير عن krasG12D اليل من خلال العلاج الموجهة التماثل (HDR) في الخلايا محوله.
الشكل 1: خريطة المتجات لل aav عبر الجينات البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة. هذا النظام AAV لديه العمود الفقري AAV الذي يعبر عن Cre للالطبيعيه وثلاثه U6 يحركها sgRNAs استهداف KRAS, p53, و APC. كما انه يحتوي علي المانحة الإصلاح الموجهة KRAS G12D (HDR). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصميم وعمل نظام كاس 9 في تحويل الخلايا الطبيعية. (ا) الخطوط العريضة لإنتاج وتنقيه جزيئات AAV من HEK293T بعد نقلها مع الجينات الناقلة aav والبلازميدات التعبئة والتغليف. (ب) الانتقال الفيروسي للخلايا الاوليه بجزيئات aav واليه التي يمكن بها تعبير كاس 9 المعتمد علي cre من تحرير crispr وتحويل الخلايا الاوليه إلى الخلايا المولدة للورم. ناقل aav واحد دمج grnas لثلاثه جينات مختلفه مع المطرقة من kras G12D اليل من خلال HDR مع كاسيت التعبير cre للالطبيعيه تم تسليمها إلى cre-تعتمد كاس 9 الماوس الخلايا الاساسيه. Cre للالطبيعيه النشاط في الخلايا محوله يؤدي إلى استئصال الكاسيت LoxP-Stop-LoxP ويدفع كاس 9 والتعبير GFP. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
التحقق من صحة نظام AAV-كاس 9 في المختبر في الخلايا الليفية الجنينية الفئران المعزولة
وقد استخدمت الخلايا الليفية الاوليه الماوس الجنينية (MEF) حصرا لدراسة عواقب الاستئصال الجيني في النمو الخلوي وانتشار22. للتحقق من كفاءه نظام كاس 9 في تحويل الخلايا الطبيعية ، ونحن محوله الخلايا MEF معزولة من الاجنه الفاره كاس 9 (E14) مع AAV. عزلت ال [MEF] خلايا كان بما ان يوصف سابقا23,24. وقد استخدمت MEFs من الاجنه الفارهة كاس 9 التي تبلغ من العمر 14 يوما لأنها سهله الاستزراع والنقل في المختبر. وباختصار ، لتحويل MEFs عبر محول AAV ، تم اعتبار MEFs الابتدائية في تقارب 30 ٪ علي استعداد لمحول الوقود. قبل ساعة واحده من المحول ، تم تغيير وسائط الثقافة MEF. تم أذابه AAV المنقي علي الجليد وتم شفط وسائل الاعلام الثقافية MEF. الفيروسية ماده طافي مع عيار متفاوتة من 106-1014 الفيروسية الجينوم/مل أضيفت إلى كل بئر وحضنت بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية. تمت أزاله ماده طافي الفيروسية بعد 48 h ، استبدلت مع 2 مل من المتوسطة الثقافة MEF ، ثم حضنت في 37 درجه مئوية حتى التعبير gfp ، حوالي 5 أيام بعد النقل. GFP-التعبير عن MEFs كانت تحت المثقف والتحقق من صحتها. لاحظ ان لهذا المتجه وجدنا ان 1012 الجينوم الفيروسي/مل (مايعادل 10 10 وحداتمحوله/مل) يمكن ان تتحول بكفاءة الخلايا الاوليه MEF إلى Mefs المولد (الشكل 3ا). وقد عبرت الخلايا المحولة عن Cre ، كاس 9 ، و GFP (الشكل 3ب ، ج). للوصول إلى الإمكانيات المولدة للخلايا التي تحولت من AAV ، تم حقن 0.5 x 106 خلايا (الاوليه/aav-محول mef) في اللسان ، والشفة ، والجلد في الفئران إيماءه-scid. الخلايا المتحولة شكلت الأورام في هذه الفئران ، مقارنه مع MEF الاساسيه ، التي لم تشكل الأورام (الشكل 3مد-F).
الشكل 3: التحقق والتحويل المختبري للخلايا الاوليه MEF باستخدام نظام AAV-كاس 9. (ا) مخطط للتحول في المختبر من الخلايا الليفية من الاجنه التي تم جمعها من كاس 9 الفئران باستخدام جزيئات aav. (ب) الصورة المناعية التمثيلية للخلايا الاوليه MEF و aav-محول mef التي تظهر التعبير عن Gfp و Cre و كاس 9. وقد استخدمت DAPI لوصمه عار النواة. (ج) البقع الغربية تظهر Cre ، كاس 9 ، gfp ، و β-actin في الخلايا الليفية الطبيعية الجنينية والخلايا الليفية المحررة وراثيا. (د) صوره تمثيليه لورم اللسان التي وضعت في الماوس إيماءه-scid بعد حقنه مع الخلايا الليفية المتحولة. (ه) صوره تمثيليه لورم الشفة التي شكلت في الماوس إيماءه-scid بعد حقنه مع الخلايا الليفية المتحولة. (و) صوره تمثيليه لورم الجناح التي وضعت في الماوس إيماءه-scid بعد حقنه مع الخلايا الليفية المتحولة. الأسهم تشير إلى ورم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
في المختبر جيل من اللسان المولد العصبية الظهاريه خط الخلية من الخلايا الظهاريه اللسان الابتدائية باستخدام نظام AAV-كاس 9
بعد التحقق من خاصيه تحويل نظام AAV باستخدام خلايا MEF ، قمنا بعزل الخلايا الظهاريه اللسان الاساسيه من الفئران كاس 9 ومثقف لهم في المختبر. تم توصيل خلايا اللسان الاساسيه مع الجسيمات الفيروسية AAV(10 10 كفو/ مل) ، وبعد أسبوع واحد بدات الخلايا للتعبير عن gfp. وأكدت التحول التوتوريجيني من الخلايا الظهاريه اللسان الابتدائية (الشكل 4ا) باستخدام المناعي والغربية التنقيط (الشكل 4ب ، ج). وقد عززت الخلايا المحولة المعرض KRT 14, E-الملتصقون, والتعبير GFP (الشكل 4ب). وأكد التحول المولد للخلايا الظهاريه اللسان الاوليه من قبل التعبير عن GFP (اي التعبير Cre-تعتمد علي كاس 9 و GFP) (الشكل 4ج). التعبير من KRT14 و [ا-كتثبين] يؤكد هم ظهاره خليه صفه. وأكد التحقق من صحة البروتين المعززة β-catenin ، فوسفوكو-رك ، وانخفاض التعبير p53 (الشكل 4ج) ، مما يدل علي التنظيم الفعال لل APC و p53 ودمج kras متحولة في خلايا اللسان ، مما يجعلها توتوريغينيك. وأكد التحليل الجيني عن طريق التسلسل العميق للحمض النووي المعزول عن الخلايا المتحولة التحرير الجيني الفعال والتحول الإطاري لجينات TP53 و APC بواسطة نظام AAV-كاس 9 (الجدول 2). وتم تقييم الخاصية المولدة لخط الخلية اللسانية المتحولة AAV عن طريق حقنها في اللسان من الفئران نوع البرية المناعية C57BL/6. الخلايا اللسان تحولت ، المعينة باسم KRAS الخلايا الظهاريه متحولة من اللسان (KRAS موت بت) ، شكل الأورام بكفاءة في C57BL/6 الفئران (الشكل 4د). وقد تم تقييم الأورام بالفم والفكين من قبل الطبيب الشرعي الشفوي والوجهي عن طريق الهيوسين الروتينية واليوزين (H & E) تلطيخ وبواسطة مناعي. أظهرت الأورام شكل خليه المغزل مع اتيبيا النووية البارزة: غشاء الجنب ، فرط اللونية ، نوى العملاقة ، والعديد من النوولي ، ومعدل الانقسام العالي مع الأرقام ميتوتيك غير نمطيه. ولوحظ أيضا غزو وأنجيوينفاسيون الاوعيه الدموية. ورافق هذه الميزات المورفولوجية محدوده جدا للتهاب المرتبطة الورم غير موجود. إيممونوهيستوتشيميكالي, وكانت خلايا الأورام السيتوبلاسميكاليه ايجابيه لل E-الملتصقون و KRT 14, كلا علامات الانسجه الظهاريه. KRT 14 هو نموذجي من ظهاره الحرشفية ، ودعم المنشا الحرشفي للخلايا السرطانية التالي تشخيص سرطان الخلايا الحرشفية (الشكل 4ه). التالي ، يوفر هذا النهج منهجيه متعددة لتحويل الخلايا الاوليه في المختبر مع تغيير الجينات المطلوبة. الاضافه إلى ذلك ، تسهل هذه المنهجية استخدام هذه الخطوط الخلايا المتقدمة في الجسم الخلوي في الفئران المتزامنة لفهم أفضل للورم في البيئة المجهرية الورم الحقيقي.
الشكل 4: التحول في المختبر من الخلايا الظهاريه اللسان الاوليه باستخدام نظام كاس 9. (ا) التمثيل التخطيطي للتحول في المختبر من الخلايا الظهاريه العادية التي تم الحصول عليها من اللسان من الفئران كاس 9. (ب) الصورة المناعية التمثيلية للخلايا الظهاريه اللسان المحولة للمركبات والتي تظهر التعبير عن KRT14 ، البريد الكتروني ، و gfp. (ج) لطخه الغربية التي تظهر كاس 9 ، β-catenin ، والحاملة فوسفوكو-كيرك مع p53 مستوي البروتين السفلي ، والتي تبين الخلايا الظهاريه المحررة وراثيا. (د) صوره تمثيليه لورم التي وضعت في اللسان من الفئران المناعية بعد حقن لهم الخلايا الظهاريه اللسان المتحولة (Kras موت بت). (ه) الصور التمثيلية لأقسام الانسجه السرطانية ل H & e ، البريد الملتصقين ، و krt 14 تلطيخ في 20x و 40x التكبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| خليه تحلل العازلة لحصاد الفيروسية | حجم |
| 150 mM NaCl | 876.6 mg |
| 50 مم تريس-HCl | 605.7 mg |
| استخدام HCl لضبط درجه الحموضة 8.5 | |
| الصف المياه الجزيئية | مكياج 100 مل |
| تاخيرمن المخزن المؤقت | |
| 1 مم MgCl2 | 9.52 ملغ |
| 2.5 mM KCl | 18.64 mg |
| مزيج جميع في تلفزيوني 1X وضبط درجه الحموضة إلى 7.2 | مكياج 100 مل |
| المخزن المؤقت الelution | |
| 0.5 M NaCl | 2.92 ح |
| مزيج جميع في تلفزيوني 1X وضبط درجه الحموضة إلى 7.2 | مكياج 100 مل |
| 10X الثلاثي انزيم الحل الأسهم: | |
| كولاجيناز | 1 ز النهائي كونج. [10 ملغ/مل] |
| هيالورونيداز | 100 ملغ [1 ملغ/مل] |
| الدناز | 20,000 الوحدات النهائية. [200 ملغم/مل] |
| الاذاعه التلفزيونية 1X | مكياج 100 مل |
| مزيج plasmid (للوحه واحده 14.5 سم) | |
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53-KRAS HDR | 10 ميكروغرام |
| Aav 2/9 استحداث قفيصه ناقلات | 10 ميكروغرام |
| باد دلتا F5 المساعد | 10 ميكروغرام |
| PEI (1 ميكروغرام/μl الأسهم) | 90 μl |
| DMEM | 1 مل |
الجدول 1: وصفات المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه الدراسة.
الجدول 2: بيانات تحليل المجين لخلايا كروس موت بت. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الجدول (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت عده طرق سابقا لتحويل الخلايا الاساسيه في الثقافة مع درجات متفاوتة من النجاح25,26,27,28. معظم هذه الطرق استخدام خلايا الخلية الليفية الماوس للتحول14،17،18،19 أو استخدام المسرطنة مثل 4-نيتروكوينولين-1-أكسيد (4-nqo)21،22 لتطوير نماذج خط الخلية murine. استخدام نماذج الماوس الضربة القاضية والمحورة وراثيا أيضا عززت إلى حد كبير فهمنا للمسارات الجزيئية المختلفة التي تحكم التنمية والتمايز من HNC. استخدام الخطوط الخلوية الظهاريه عن طريق الفم مع نمط وراثي فريد من شانه ان يكمل بالتاكيد هذه الدراسات ، واختباراتها البيوكيميائية اللاحقة من شانه ان يسهم في علاج وتشخيص HNC. ومع ذلك ، فقط عدد قليل من التقارير وصفت إنشاء الفئران الفم الظهاريه الخلايا28،29،30،31،32،33 وهذه الخطوط الخلوية ليست في استخدام واسع النطاق.
الحد الرئيسي لهذه الخطوط الخلوية الظهاريه الشفوية murine هو انها لا تتميز علي نطاق واسع علي المستوي الجزيئي ووجدت للتعبير عن أنماط الجينات غير المالوف. التالي ، فان الفهم الجزيئي المحدود لنماذج خطوط الخلايا الmurine هذه وعدم وجود منهجيه فعاله دفعتنا إلى تسخير الإمكانات الفريدة لتكنولوجيا تحرير الجينوم AAV-CRISPR في كاس 9 الفئران لإنشاء خطوط خلايا murine مع تعديلات جينيه محدده. في هذه الدراسة ، قمنا بإدخال وتطوير نظام AAV-كاس 9 في المختبر لتحويل الخلايا الاوليه murine إلى حاله توموريغينيك لتاكيد التعديلات الجينية التي تؤدي إلى خلايا سرطانيه. انشانا بنجاح الخلايا الظهاريه اللسان murine مع الطفرات الجينية محدده مع كفاءه عاليه باستخدام AAV-بوساطة الجينات الجسدية المستحثة CRISPR التحرير من قبل عده تركيبات sgRNA.
وتقدم هذه المنهجية نهجا تجريبيا جديدا لفهم أفضل لمسببات الخلية الذاتية لل HNC. بدءا من الخلايا الظهاريه اللسان الابتدائية murine ، تمكنا من تحويل هذه الخلايا إلى tumorigenicity عن طريق حذف مجموعه محدوده من الجينات وإدخال طفرة KRAS واحده. باستخدام هذه المنهجية ، أصبح من الممكن الآن التحقيق في ما إذا كانت الجينات الأخرى المعروفة بأنها متورطة في سرطانات أخرى يمكن ان تنتج الأورام الخبيثة التي تشبه بشكل وثيق HNC. وأكدت الخصائص المورفولوجية للأورام من KRAS موت بت الخلايا الحرشفية سرطان. ويرتبط التحليل المرضي للأورام السرطانية الخبيثة في الفئران المتزامنة بالسلوك البيولوجي العدواني لسرطان الراس والرقبة وداعما له. التالي ، قد يكون من الممكن ربط الأنماط الجينية للخلايا السرطانية بالخصائص السريرية والوراثية المحددة للأورام.
المزايا الرئيسية لهذه المنهجية هي القدرة علي تطوير خطوط الخلايا من الخلايا الاوليه من اي جهاز باستخدام طفرات جينيه محدده واستخدام كاس 9 ، مما يجعل النظام أكثر متانة واستقرارا. يجعل ال [كاس 9 سست] داخلية هو يمكن ان يستعمل أخرى مورثه ضربه قاضيه. والعيب الرئيسي في المنهجية الحالية هو الوقت اللازم لعزل وترسيخ الثقافة الاوليه وكذلك الدرجة العالية من الجزيئات الفيروسية اللازمة لنقل الخلايا الاوليه. ومع ذلك ، يمكن التغلب علي هذا عن طريق توحيد عمليه العزل لكل نوع خليه. ويمكن التخفيف من المشكلة التي تتطلب ارتفاع الفيروسية aav عيار لكفاءة التوصيل باستخدام أحدث جيل من استحداث قفيصه والبلازميدات المساعد للتغليف الفيروسي وعمليه تنقيه أفضل.
وفي المستقبل ، يمكن تصميم نظام AAV أفضل وأكثر كفاءه واستقراءه في الجسم المجري لجعل نماذج الأورام المعدلة وراثيا الخاصة بالأعضاء. وفي الختام ، فان إنشاء خطوط الخلايا الmurine بهذا النهج سيكون بمثابه أداه قيمه في المختبر القائم علي الثقافة الخلوية لاختبار عده فرضيات في سياق الأورام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والماجستير في المجلس الاستشاري لمعهد العلوم البيولوجية ، وقد تلقي ميناريني ريريش أموالا بحثيه من شركه بوما للتكنولوجيا الحيوية ، وداييتشي-سانكيو ، وتارغايمون ، إيمونوميديكس ، وميريني ريريش. الماجستير هو أيضا أحد مؤسسي السفر ميدندي الطبية, وفي السنوات الماضية 2, وقد حصلت علي المكافات مناريني Ricerche و ADC فارما. كل المؤلفين الآخرين ليس لديهم شيء للكشف عنه.
Acknowledgments
نود ان نشكر الدكتور دانيال Gitler لتزويدنا مع pAd دلتا 5 المساعد plasmid. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسه العلوم الاسرائيليه 700/16) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه العلوم الثنائية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (بالنسبة لي ، 2017323) ، وجمعيه السرطان الاسرائيليه (ICA ، 20170024) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه أبحاث السرطان الاسرائيليه (ICRF ، 17-1693-ركدا) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه #7895 الزمالة: زمالة ألون لي وزمالات BGU Kreitman إلى SJ و MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
