Summary
Le développement de modèles murins avec des gènes spécifiques mutés dans les patients atteints de cancer de la tête et du cou est nécessaire pour la compréhension de la néoplasie. Ici, nous présentons un protocole pour la transformation in vitro des cellules primaires de langue murine utilisant un système adeno-associé de virus-Cas9 pour produire des lignes de cellules murines de HNC avec des altérations génomiques spécifiques.
Abstract
L'utilisation de cellules épithéliales normales primaires permet d'induire de façon reproductible les altérations génomiques nécessaires à la transformation cellulaire en introduisant des mutations spécifiques dans les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs, en utilisant des courte répétition palindromic (CRISPR) à base de technologie d'édition du génome chez la souris. Cette technologie nous permet d'imiter avec précision les changements génétiques qui se produisent dans les cancers humains à l'aide de souris. En transformant génétiquement les cellules primaires murines, nous pouvons mieux étudier le développement, la progression, le traitement et le diagnostic du cancer. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules épithéliales de langue de souris Cas9 cre-inductibles pour permettre l'édition de génome utilisant le virus adéno-associé (AAV) in vitro. Plus précisément, en modifiant KRAS, p53, et APC dans les cellules épithéliales normales de langue, nous avons produit une ligne de cellules de tête et de cou murine (HNC) in vitro, qui est tumorigenic dans les souris syngeneic. La méthode présentée ici décrit en détail comment générer des lignées cellulaires HNC avec des altérations génomiques spécifiques et explique leur pertinence pour prédire la progression tumorale chez les souris syngénéiques. Nous envisageons que cette méthode prometteuse sera instructive et utile pour étudier la biologie et la thérapie de tumeur de HNC.
Introduction
HNC est une malignité commune dans le monde1. La modélisation de la genèse de la néoplasie HNC est actuellement à un tournant scientifique2. Bien que de nombreuses mutations génétiques aient été identifiées dans HNC2,3,4 (p. ex., TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 et RAS), les combinaisons spécifiques d'altérations génomiques requises de concert pour induire hNC demeurent floues.
L'utilisation actuelle des lignées cellulaires humaines hNC a contribué de manière significative à élucider les mécanismes associés à la pathogénie et au traitement3. Cependant, l'étude des lignées cellulaires humaines dans les systèmes murines immunodéprimés a ses limites, parce que ces systèmes ne traitent pas le processus néoplastique in vivo, le rôle des mutations génétiques spécifiques, et les réponses de traitement dans un microenvironnement immunitaire. Par conséquent, le développement et l'établissement de lignées cellulaires murines avec des altérations génétiques spécifiques sont d'une importance primordiale pour étudier comment différents gènes contribuent au processus de transformation et pour tester de nouvelles thérapies à base de molécules chez des souris immunocompétentes.
Les études sur la fonction génique dans la recherche biomédicale ont été considérablement affectées par les progrès des technologies d'édition de l'ADN, en introduisant des ruptures à double brin (DSB), par exemple5. Ces technologies, y compris l'utilisation de nucléases de doigts de zinc, de nucléases effectrices semblables à des activateurs de transcription et de répétitions palindromic courtes interespaces (CRISPR/Cas9), permettent la manipulation de tout gène d'intérêt à son locus. Les derniers systèmes CRISPR/Cas9 sont composés d'un ARN guide (gRNA) qui dirige la nucléase Cas9 pour générer un DSB à un site spécifique du génome. Ce système a acquis une large reconnaissance dans la modification des gènes endogènes dans n'importe quelle cellule ou tissu cible, même dans les organismes les plus traditionnellement difficiles à traiter5. Il a de multiples avantages par rapport à d'autres systèmes en raison de sa simplicité, la vitesse et l'efficacité.
En oncologie, la technologie CRISPR/CAS9 a répondu à la nécessité d'imiter efficacement les cellules cancéreuses. Pour établir ce système dans HNC, nous avons manipulé l'oncogène puissant de KRAS et deux gènes importants de suppresseur de tumeur, APC et p536. Selon la base de données GENIE7, cette combinaison est rare dans HNC. Les mutations de RAS (HRAS, NRAS, et KRAS) sont présentes dans seulement 7% de toutes les populations de HNC. Ces tumeurs ont tendance à être résistantes à la thérapie8,9.
La livraison de Cas9 et de son gRNA est réalisée par transduction virale à l'aide de AAV ou de lentivirus. L'AAV recombinant est souvent la méthode préférée pour délivrer des gènes aux cellules cibles en raison de son titre élevé, de sa réponse immunitaire légère, de sa capacité à transduire un large éventail de cellules et de sa sécurité globale. À l'aide d'un système AAV, diverses lignées de cellules de souris spécifiques aux tissus ont été générées, et de nouvelles lignées cellulaires sont encore en cours de développement10,11,12. Cependant, un système d'édition génomique efficace qui peut générer des cellules de modèles de lignée cellulaire HNC murine reste à développer. Dans cette étude, nous avons cherché à développer un système in vitro aAV-Cas9-basé pour transformer les cellules primaires de langue murine dans un état tumorigenic. Ce protocole unique de transformation DE CRISPR/Cas9 et la ligne établie de cellules de tumeur peuvent être employés pour mieux comprendre la biologie de HNC induite par une diversité des altérations génomiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cette étude a été approuvée par l'Université Ben Gourion du Comité de soins et d'utilisation des animaux du Néguev. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par l'IACUC (IL.80-12-2015 et IL.29-05-2018(E)). Tous les aspects de l'expérimentation animale, du logement et des conditions environnementales utilisés dans la présente étude étaient conformes au Guide pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire13.
1. Production de virus associée à l'adéno
- Jour 1: Culture cellulaire
- Graine 4 x 106 cellules HEK293T par plaque de 14,5 cm dans 15 ml de DMEM. Préparer 10 plaques pour la transfection avec la polyéthylènenimine (PEI) (1 g/L).
- Jour 2 : Transfection des cellules HEK293T à l'aide de l'Ile-du-Prince-Édouard
- Retirer les médias et les renourrir avec le DMEM chaud 1 h avant la transfection.
- Réagents de transfection préchauffés et DMEM.
- Utiliser 10 g du plasmide d'intérêt contenant AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 g du plasmide capsid AAV 2/9n (avec le gène de rep de AAV2 et le gène de la casquette de AAV9, et 10 g du plasmide d'aide (aide pAdDelta F5) par assiette (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Une nouvelle génération de plasmique d'aide - pAdDeltaF614,15,16 qui peut également être utilisé pour la production AAV est disponible. - Mélanger les plasmides dans 1 ml de DMEM ordinaire par assiette. Ajouter ensuite 90 ll de polyéthylénimine (plasmide total : concentration de l'Ile-du-Prince-Édouard 1:3) au mélange plasmide et au vortex brièvement.
- Incuber le mélange d'ADN plasmique de l'Ile-du-Prince-Édouard pendant 20 min à température ambiante (RT).
- Ajouter le mélange dans le sens goutte à goutte sur les cellules HEK293T et transférer les plaques à l'incubateur de culture cellulaire à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.
- Jour 3 : Changement moyen après transfection
- Retirer complètement le milieu et ajouter 15 ml de DMEM frais.
- Jour 5: Récolter le virus
- Préparer un bain de glace sèche/éthanol.
- Recueillir les cellules avec un grattoir cellulaire et les transférer dans des tubes de 50 ml (2 plaques par tube de 50 ml).
- Tourner les tubes à 800 x g pendant 15 min à température ambiante.
- Jetez le supernatant de tous les tubes. Ajouter 0,5 ml de tampon de lyse (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH à 8,5) par assiette (c.-à-d. 5 ml pour 10 plaques) au premier tube seulement. Resuspendre les cellules et transférer le volume total vers le tube suivant et continuer jusqu'au dernier tube.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube frais de 50 ml. Laver les tubes avec le même volume de tampon de lyse (0,5 ml par plaque) en utilisant la même méthode de transfert que décrite à l'étape 1.4.4.
- Soumettez la suspension cellulaire à trois cycles de gel/dégel de 10 min entre un bain sec glace/éthanol et un bain d'eau de 37 oC. Vortex peu après chaque décongélation.
- Si la purification est effectuée le même jour, régler le tampon d'équilibre et d'élution (voir le tableau 1 pour la recette) à RT.
- Ajouter 50 unités de benzonase par assiette et incuber à 37 oC pendant 1,5 h.
REMARQUE : Le benzonase est employé pour digérer les acides nucléiques résiduels des cellules de producteur d'hôte et l'ADN plasmide présent dans la suspension de cellules. - Faire tourner les tubes à 3 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
- Recueillir le supernatant dans une seringue à l'aide d'une aiguille en acier de 18 G et pousser la solution à travers un filtre de 0,45 m dans un tube de 15 ml pour obtenir le lysate brut.
- Conserver le lysate brut à 4 oC pendant quelques semaines jusqu'à ce que la purification ou continuer la purification.
2. Purification AAV
- Jour 5 ou plus tard
- Placez le tampon d'équilibre et d'élution à RT.
- Laver les colonnes de chromatographie avec 10 ml de tampon d'équilibre.
- Ajouter 0,5 ml par plaque d'héparine-agarose à la colonne17, puis ajouter le tampon d'équilibre (4fois le volume de l'héparine-agarose). Mélanger les solutions en inversant la colonne et laisser les sédiments agarose.
- Élipellez le tampon d'équilibre de la colonne par gravité.
REMARQUE : Laissez un tampon d'équilibre pour empêcher l'agarose de se dessécher. - Chargez le lysate brut sur la colonne et incubez pendant 2 h à 4 oC avec une agitation constante. Mettre la colonne en position verticale et laisser l'agarose dans les sédiments.
- Elute le lysate brut par gravité.
- Laver la colonne avec un tampon d'équilibre (4fois le volume de l'héparine-agarose).
- Placez un filtre à protéines centrifuges de 100 kDa sous la colonne et élichez le virus à l'aide d'un tampon d'élution (3 fois le volume de l'héparine-agarose) dans le filtre.
REMARQUE : Le tampon d'élution ne doit pas dépasser 15 ml. - Centrifuger le filtre à 3 000 x g pendant 30 min jusqu'à ce qu'il reste moins de 1 ml dans le filtre.
- Remplissez le filtre avec du PBS et de la centrifugeuse à 3 000 x g pendant 30 min jusqu'à ce qu'il reste moins de 1 ml dans le filtre. Répétez cette étape 2x pour enlever tous les sels.
- Concentrez la solution de virus dans le filtre par centrifugation à 3 000 x g pour arriver à un volume aussi petit que possible (moins de 200 l).
- Aspirez la solution virale à l'utilisation d'une aiguille et d'une seringue et poussez la solution à travers un filtre de 0,22 m dans un tube.
- Faire des aliquots de particules virales concentrées pour le stockage.
REMARQUE : Les aliquots doivent être de 20 l pour un stockage à court terme à 4 oC et de 5 oL pour un stockage à long terme à -80 oC. - Déterminer le titre viral et l'efficacité de la transduction virale tel que décrit précédemment14,18,19,20.
3. Isolement et culture des cellules primaires
- Jour 1
- Euthanasiez un mâle ou une femelle de 6 semaines B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9MD,-EGFP)Fezh/J par asphyxie CO2 ou tout autre protocole approuvé par l'IACUC.
REMARQUE : Ces souris de knockin de CRISPR/Cas9 ont l'expression Cre recombinase-dépendante de cas9 endonuclease et EGFP dirigée par un promoteur de CAG. La séquence en amont de Lox-Stop-Lox (LSL) présente dans le génome de ces souris empêche l'expression de Cas9 et de l'EGFP en l'absence de Cre recombinase. Lorsqu'ils sont utilisés en combinaison avec des ARN à guide unique (sgRNAs) et une source de Cre, ils permettent l'édition de gènes de souris simples ou multiples in vivo ou ex vivo14. - Disséquer la langue des souris euthanasiées à l'aide de ciseaux chirurgicaux.
- Dissocier manuellement le tissu en hachant le tissu de la langue en très petits fragments à l'aide d'un scalpel. Recueillir les fragments de tissu dans un tube de 15 ml contenant 4,5 ml de milieu ordinaire RPMI (avec le sérum).
- Ajouter le mélange triple enzymatique (200 l) (voir le tableau 1 pour la recette) aux fragments de tissu.
- Incuber le mélange tissu-enzyme à 37 oC pendant 30 min et appuyez sur le tube toutes les 10 minutes pour améliorer la dissociation enzymatique du tissu.
- Ajouter 5 % de sérum bovin fœtal (SGF) contenant du HBSS/PBS au mélange tissu-enzyme pour arrêter l'action enzymatique.
- Filtrer la suspension cellulaire ci-dessus à l'intérieur d'un maillage stérile en nylon de 70 m pour séparer les cellules dispersées et les fragments de tissus plus importants.
- Laver la suspension des cellules filtrées par centrifugation pendant 300 x g pendant 5 min dans HBSS/PBS à RT.
- Resuspendre le granule dans le milieu de culture (10% FBS dans RPMI/DMEM) et se développer dans des plats de culture de 60 mm jusqu'à ce que des colonies cellulaires distinctes soient formées.
- Agrégats de cellules de culture conservés sur le dessus du filtre dans un plat de culture de 60 mm contenant 3 ml de milieux complets (10 % de FBS en RPMI/DMEM) jusqu'à formation de colonies cellulaires.
- Examiner au microscope les cellules primaires pour la présence de contamination par le fibroblaste après 1 semaine de culture. Traiter les cellules primaires développées à partir d'agrégats et de suspensions cellulaires avec 0,25 trypsine 0,02% solution EDTA à 37 oC pendant 1 min pour enlever les fibroblastes.
REMARQUE : Habituellement, la culture primaire à partir d'agrégats cellulaires produit plus de colonies que les suspensions unicellulaires. Les cellules de ces colonies offrent une meilleure efficacité de transduction avec la transduction AAV.
- Euthanasiez un mâle ou une femelle de 6 semaines B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9MD,-EGFP)Fezh/J par asphyxie CO2 ou tout autre protocole approuvé par l'IACUC.
4. Transduction AAV des cellules primaires
- Jour 10
- Seed 2 x 105 cellules primaires par puits dans 6 plaques de puits dans 2 ml de milieux complets (10 % de FBS dans RPMI/DMEM).
- Le lendemain, transduire les cellules avec 1012 génome sviral/mL (1010 unités de transducage/mL) et incuber les cellules dans des médias de particules virales pendant 48 h à 37 oC.
- Retirez les médias contenant des particules virales et alimentez les cellules transducées par l'AAV avec un support complet.
REMARQUE : Seules les cellules qui ont subi une transduction exprimeront le GFP et commenceront à proliférer. Les cellules qui n'ont pas subi de transduction finiront par mourir dans les 2 semaines. - Après 2 semaines d'expansion de culture, ensemencez les cellules pour la validation et les expériences tumorigenic in vivo.
REMARQUE : L'ADN génomique des cellules transducées par aAV et des cellules primaires normales de souris Cas9 a été extrait pour valider l'édition spécifique du génome à l'aide de protocoles standard. Le séquençage de l'ADN extrait et l'analyse des données séquentées (tableau 2) ont été effectués à l'aide d'un test de séquençage de prochaine génération basé sur la capture d'hybridation (p. ex., plate-forme MSK-IMPACT) tel que décrit précédemment21.
5. Valider la transformation des cellules normales en cellules tumorigènes à l'aide de l'immunofluorescence et du ballonnement occidental
- Immunofluorescence
- Seed 2 x 105 cellules sur des couvercles en verre de 12 mm et les placer dans un incubateur pendant la nuit.
- Fixer les cellules dans 4% de paraformaldéhyde dans le PBS (pH - 7.4) et le processus pour l'étiquetage d'immunofluorescence.
- Incuber les cellules fixes avec le premier anticorps primaire dans 1% BSA ou 1% sérum en PBST dans une chambre humidifiée pendant 1 h à RT ou pendant la nuit à 4 oC. Les principaux anticorps utilisés sont le lapin monoclonal anti-KRT 14, lapin monoclonal anti-E-cadherin anticorps, et Cas9 souris mAb.
- Retirez la solution d'anticorps primaire des couvertures en lavant les cellules 3x pendant 5 min avec 1x PBS.
- Incuber les cellules avec Cy3 âne anti-lapin IgG et / ou Cy3 chèvre anti-souris igG anticorps secondaires dans 5% BSA en PBST pour 1 h à RT dans l'obscurité.
- Retirez la solution d'anticorps secondaire des couvertures et lavez les cellules 3x comme décrit à l'étape 5.1.4.
- Montez les couvertures avec une goutte de support de montage contenant DAPI (DAPI Fluoromount).
- Conserver dans l'obscurité à 4 oC jusqu'à ce que les diapositives soient représentées à l'aide d'une microscopie à fluorescence.
- Le ballonnement occidental
- Seed 1 x 106 ont transformé les cellules dans un plat de culture de 100 mm et les placer dans un incubateur pendant la nuit.
- Laver et gratter les cellules transformées en PBS froid de glace de 200 'l.
- Centrifuger le tube contenant la suspension cellulaire pendant 10 min à 2 000 x g à 4 oC pour granuler les cellules.
- Aspirer le supernatant et lyser les cellules à l'aide d'un tampon de lyse (voir tableau 1) contenant des cocktails inhibiteurs de la phosphatase et un inhibiteur de la protéase pendant 10 min à 4 oC. Centrifuger les lysates pendant 10 min à 10 000 x g et 4 oC et recueillir les lysates défrichés.
- Utilisez un kit d'évaluation Bradford disponible dans le commerce pour déterminer la concentration en protéines selon le protocole du fabricant. Utilisez un tampon d'échantillon 4x (500 mM de pH Tris à 6,8, 40 % de glycérol, 8 % de SDS, 20 % H2O, 0,02 % de bromophénol bleu) pour ajuster les échantillons de protéines à 0,5 ou 1 g/L. Faire bouillir à 96 oC pendant 5 min.
REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -80 oC ou jusqu'à ce qu'une analyse de tache occidentale soit effectuée. - Séparez des quantités égales de lysate total (30 g) par 10 % d'électrophores gel de sulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE). Assurez-vous que le colorant atteint le fond du gel. Transférer la protéine dans la membrane de nylon par ballonnement semi-sec à 25 V pendant 30 min.
- Verser 5 % de BSA dans la saline tamponnée Tris (TBS)-0,1 % de tween (TBST) sur la membrane pour la recouvrir complètement. Bloquez la membrane pendant 1 h à RT. Incuber la mébrane avec des anticorps primaires (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, anti-caténine, anti-p53, anti-phospho-ERK, et anti-actin dilué dans 5% BSA TBST) à 4 oC du jour au lendemain.
- Après l'incubation, laver les membranes pendant 10 min avec 1x TBST en s'assurant que la solution couvre complètement la membrane. Effectuer ce lavage 3x, puis ajouter le raifort peroxidase (HRP) conjugué anticorps secondaires (dilué 1:10,000 dans 5% BSA TBST) à la membrane. Incuber pour 1 h à RT.
- Après l'incubation, laver les membranes pendant 10 min avec 1x TBST en s'assurant que la solution couvre complètement la membrane. Effectuez l'imagerie par chemiluminescence (voir Tableau des matériaux)pour exposer les bandes et capturez des images en conséquence.
- Validation du potentiel tumorigène des cellules transformées chez les souris immunocompétentes
REMARQUE : Les souris ont été maintenues et traitées selon les directives institutionnelles de l'Université Ben-Gourion du Néguev. Nod. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) et C57BL/6 souris ont été utilisés pour les études in vivo. Les souris étaient logées dans des armoires à débit laminaire filtrées à l'air avec un cycle de 12 heures de lumière/obscurité et ont été nourries de nourriture et d'eau ad libitum.- Utilisez 6-8 semaines-vieille femelle NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) et C57BL/6 pour l'étude.
- Trypsiniser les cellules transformées AAV-Cas9. Arrêter la trypsinisation à l'aide de DMEM préréchauffé à 37 oC et recueillir dans un tube de 50 ml.
- Centrifuger le tube à 800 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans le milieu DMEM sans FBS. Effectuer la centrifugation à nouveau et resuspendre la pastille cellulaire en 1x PBS.
REMARQUE: Ne pas garder les cellules dans 1x PBS pendant trop longtemps. Gardez toujours la suspension cellulaire sur la glace pour éviter l'agglutination cellulaire. - Utilisez un compteur cellulaire automatique pour compter les cellules et diluer les cellules à la concentration désirée (2,5 x 107 cellules/mL) à l'aide de 1x PBS. Générer des tumeurs par une injection sous-cutanée de la suspension cellulaire transformée AAV-Cas9 dans le flanc droit de chaque NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Souris SCID) (2 x 106 cellules/souris). Pour générer un modèle orthotropique chez les souris syngénétiques, injectez 0,5 à 106 cellules primaires ou les cellules transformées AAV-Cas9 en langue de souris immunocompétentes C57BL/6.
- Euthanasier les animaux 2 semaines postinjection par asphyxie co2, et disséquer les tumeurs des souris euthanasiées pour l'analyse d'immunohistochimie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilisation du système AAV pour transformer les cellules Cas9 normales
La figure 1 fournit une carte vectorielle détaillée du plasmide transgénique AAV utilisé dans cette étude. La figure 2 décrit la conception et le fonctionnement du système à base d'AAV-Cas9. Pour produire des particules virales, les cellules HEK293T ont été transfectées avec le vecteur transgénique AAV et d'autres vecteurs d'emballage viral à l'aide de la méthode de transfection de l'Ile-du-Prince-Édouard. Après la transfection, les cellules contenant le virus ont été recueillies et lysées, et à l'aide du processus de purification de l'héparine-agarose, les particules virales ont été purifiées et concentrées (Figure 2A). Ces particules virales purifiées ont été utilisées pour la transformation in vitro des cellules primaires isolées des souris Cas9 pour vérifier l'efficacité. Dans notre système, la cassette d'expression transgène AAV est introduite par recombinaison homologue dans le modèle de ciblage Cas9 Rosa26 dépendant de Cre dans les cellules de souris qui portent un promoteur CAG omniprésent (pCAG), une cassette LoxP-Stop-LoxP (LSL), un gène nucléase Cas9, un peptide P2A auto-clivant, et le gène reporter (EGFP) flanqué de deux bras homologous14. L'activité De recombinase des cellules transductrices excise le LSL et induit l'expression Cas9 et GFP (Figure 2B). L'activité de nucléane de Cas9 introduit une pause à double brin sur les sites cibles d'intérêt, dirigée par le biais de gRNAs, et aide à l'édition de gènes. Le système AAV utilisé dans cette étude aide à fournir des gARN multiplexés (sgRNAs pour KRAS, p53, et APC) et aussi dans l'expression d'un allèle KRASG12D oncogène par la réparation homology-dirigée (HDR) dans les cellules cédées.
Figure 1 : Carte vectorielle du plasmide transgénique AAV utilisé dans cette étude. Ce système AAV a une colonne vertébrale AAV qui exprime Cre recombinase et trois SgRNAs Pilotés par U6 ciblant KRAS, p53, et APC. Il contient également un kraS G12D homology-directed repair (HDR) donneur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Conception et fonctionnement d'un système AAV-Cas9 pour transformer les cellules normales. (A) Aperçu de la production et de la purification des particules AAV de HEK293T après les avoir transfectifiées avec le transgène AAV et les plasmides d'emballage. (B) Transduction virale des cellules primaires avec des particules AAV et le mécanisme par lequel l'expression Cas9 cre-dépendante permet l'édition CRISPR et la transformation des cellules primaires en cellules tumorigènes. Un seul vecteur AAV intégrant des gARN pour trois gènes différents avec un knockin de l'allèle KRAS G12D par HDR avec une cassette d'expression Cre recombinase a été livré dans les cellules primaires de la souris Cas9 dépendantes de Cre. L'activité de recombinase de cre dans les cellules transductées mène à l'excision de la cassette de LoxP-Stop-LoxP et induit l'expression de Cas9 et de GFP. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Validation du système AAV-Cas9 in vitro dans des cellules de fibroblaste embryonnaires de souris isolées
Les cellules embryonnaires primaires de fibroblaste de souris (MEF) ont été employées exclusivement pour étudier les conséquences de l'ablation de gène dans la croissance cellulaire et la prolifération22. Pour valider l'efficacité du système AAV-Cas9 dans la transformation des cellules normales, nous avons transduiré des cellules MEF isolées des embryons de souris Cas9 (E14) avec AAV. Les cellules MEF ont été isolées comme décrit précédemment23,24. Des MEF d'embryons de souris Cas9 de 14 jours ont été utilisés parce qu'ils sont faciles à culture et à transduire in vitro. En bref, pour transformer les MEF par la transduction AAV, les MEF primaires à environ 30% de confluence ont été considérés prêts pour la transduction. Une heure avant la transduction, les médias culturels du MEF ont été modifiés. L'AAV purifié a été décongelé sur la glace et les médias culturels du MEF ont été aspirés. Le supernatant viral avec un titer variant de 106-1014 génome viral/mL a été ajouté à chaque puits et incubé pendant la nuit à 37 oC. Le supernatant viral a été enlevé après 48 h, remplacé par 2 mL de milieu de culture MEF, puis incubé à 37 oC jusqu'à l'expression gFP, environ 5 jours après la transduction. Les MEF exprimant le GFP ont été sous-cultivés et validés. Notez que pour ce vecteur, nous avons constaté que 1012 génomes viraux/mL (équivalent à 1010 unités de transduive/mL) pourraient transformer efficacement les cellules primaires de MEF en MEF tumorigènes(figure 3A). Les cellules cédées exprimaient Cre, Cas9 et GFP(figure 3B,C). Pour accéder au potentiel tumorigenic des cellules transformées de MEF d'AAV, 0.5 x 106 cellules (MEF primaire/AAV-transduced) ont été injectées dans la langue, la lèvre, et sous-cutanée dans les souris NOD-SCID. Les cellules transformées ont formé des tumeurs chez ces souris, comparées au MEF primaire, qui n'a pas formé de tumeurs (Figure 3D-F).
Figure 3 : Validation et transformation in vitro des cellules MEF primaires à l'aide du système AAV-Cas9. (A) Aperçu de la transformation in vitro des fibroblastes à partir d'embryons prélevés sur des souris Cas9 à l'aide de particules AAV. (B) Image représentative d'immunofluorescence des cellules primaires de MEF et d'AAV-transduced de MEF montrant l'expression de GFP, de Cre, et de Cas9. DAPI a été utilisé pour tacher le noyau. (C) le ballonnement occidental montrant Cre, Cas9, GFP, et '-actin dans les fibroblastes normaux embryonnaires et les fibroblastes génétiquement édités. (D) Image représentative d'une tumeur de langue qui s'est développée dans une souris NOD-SCID après l'avoir injectée avec des cellules transformées de fibroblaste. (E) Image représentative d'une tumeur de lèvre qui s'est formée dans une souris NOD-SCID après l'avoir injectée avec des cellules transformées de fibroblaste. (F) Image représentative d'une tumeur de flanc qui s'est développée dans une souris NOD-SCID après l'avoir injectée avec des cellules transformées de fibroblaste. Les flèches indiquent une tumeur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Génération in vitro de la langue murine tumorigène ligne épithéliale de cellules épithéliales des cellules épithéliales primaires de langue utilisant le système aAV-Cas9
Après avoir validé la propriété transformable du système AAV à l'aide des cellules MEF, nous avons isolé les cellules épithéliales de langue primaire des souris Cas9 et les avons cultivées in vitro. Les cellules principales de langue ont été transduced avec des particules virales d'AAV (1010 cfu/mL), et après une semaine les cellules ont commencé à exprimer GFP. La transformation tumorigène des cellules épithéliales primaires de langue(figure 4A) a été confirmée utilisant l'immunofluorescence et le ballonnement occidental ( figure4B,C). Les cellules transformées présentent une expression KRT 14, E-cadherin et GFP améliorée(figure 4B). La transformation tumorigène des cellules épithéliales primaires de langue a été confirmée par l'expression de GFP (c.-à-d., l'expression Cre-dépendante de Cas9 et de GFP) (figure 4C). L'expression de KRT14 et d'E-cadherin confirme leurs caractéristiques épithéliales de cellules. La validation de protéine a confirmé l'amélioration de la caténine, de la phospho-ERK, et de l'expression réduite de p53 (figure 4C), indiquant la downregulation efficace de l'APC et du p53 et l'incorporation du KRAS mutant dans les cellules de langue, les rendant ainsi tumorigenic. L'analyse génomique par séquençage profond de l'ADN isolé des cellules transformées a confirmé l'édition efficace des gènes et le déplacement du cadre des gènes TP53 et APC par le système AAV-Cas9(tableau 2). La propriété tumorigenic de la ligne de cellules de langue AAV-transformée a été davantage évaluée en l'injectant dans la langue des souris sauvages immunocompétentes de type C57BL/6. Les cellules de langue transformées, désignées comme cellules épithéliales mutantes KRAS de la langue (KRAS Mut EpT), forment des tumeurs efficacement chez les souris C57BL/6(figure 4D). Les tumeurs d'EpT de KRAS Mut ont été évaluées par un pathologiste oral et maxillofacial par l'hématoxylin courant et l'éosine (H et E) coloration et par immunohistochemistry. Les tumeurs ont exhibé une morphologie de cellules de fuseau avec l'atypia nucléaire en avant : pléomorphisme, hyperchromatisme, noyaux géants, plusieurs nucléoli, et un taux mitotique élevé avec des figures mitotic atypiques. L'invasion perivascular et l'invasion angioontique ont été également notées. Ces dispositifs morphologiques ont été accompagnés par l'inflammation tumeur-associée très limitée à inexistante. Immunohistochemically, les cellules néoplastiques étaient cytoplasmically positives pour E-cadherin et KRT 14, les deux marqueurs du tissu épithélial. KRT 14 est typique de l'épithélium squamous, soutenant l'origine squamous des cellules de tumeur et ainsi le diagnostic du carcinome épidermoïde de cellules (figure 4E). Par conséquent, cette approche fournit une méthodologie polyvalente pour transformer les cellules primaires in vitro avec une altération génétique souhaitée. En outre, cette méthodologie facilite l'utilisation de ces lignées cellulaires développées in vivo chez les souris syngénéiques pour une meilleure compréhension de la néoplasie dans un milieu microenvironnement tumoral réel.
Figure 4 : Transformation in vitro des cellules épithéliales de langue primaire utilisant le système AAV-Cas9. (A) Représentation schématique de la transformation in vitro des cellules épithéliales normales obtenues à partir de la langue des souris Cas9. (B) Image immunofluorescence représentative des cellules épithéliales de langue AAV-transduced montrant l'expression de KRT14, E-cadherin, et GFP. (C) Tache occidentale montrant Cas9, 'caténine, et phospho-ERK upregulation avec la baisse du niveau de protéine p53, montrant les cellules épithéliales génétiquement modifiées. (D) Image représentative d'une tumeur qui s'est développée dans la langue des souris immunocompétentes après leur injection avec des cellules épithéliales transformées de langue (KRAS Mut EpT). (E) Images représentatives des sections de tissu de tumeur pour H et E, E-cadherin, et KRT 14 coloration à 20x et 40x grossissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tampon de lyse cellulaire pour la récolte virale | Volume |
| 150 mM NaCl | 876,6 mg |
| 50 mM Tris-HCl | 605,7 mg |
| Utilisez HCl pour ajuster le pH 8.5 | |
| Eau de qualité moléculaire | Faire jusqu'à 100 ml |
| Tampon d'équilibre | |
| 1 mM MgCl2 | 9,52 mg |
| 2,5 mM KCl | 18,64 mg |
| Mélanger le tout en PBS 1X et ajuster le pH à 7,2 | Faire jusqu'à 100 ml |
| Tampon d'élution | |
| 0,5 M NaCl | 2,92 g |
| Mélanger le tout en PBS 1X et ajuster le pH à 7,2 | Faire jusqu'à 100 ml |
| 10X Solution triple enzyme stock: | |
| Collagènase | 1 g de conc. final [10 mg/ml] |
| Hyaluronidase | 100 mg [1 mg/ml] |
| Dnase | 20 000 unités finalecon [200 mg/ml] |
| PBS 1X (en anglais) | Faire jusqu'à 100 ml |
| Mélange de Plasmide (pour une plaque de 14,5 cm) | |
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR | 10g |
| Vecteur capside AAV 2/9 | 10g |
| aide delta F5 pAD | 10g |
| PEI (1 g/l Stock) | 90 l |
| Dmem | 1 mL |
Tableau 1 : Recettes de tampons utilisées dans cette étude.
Tableau 2 : Données d'analyse génomique des cellules Kras Mut EpT. S'il vous plaît cliquez ici pour voir ce tableau (Cliquez à droite pour télécharger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plusieurs méthodes ont déjà été utilisées pour transformer les cellules primaires en culture avec des degrés variables de succès25,26,27,28. La plupart de ces méthodes utilisent des cellules de fibroblaste de souris pour la transformation14,17,18,19 ou utilisent des cancérogènes tels que 4-nitroquinoline-1-oxyde (4-NQO)21,22 pour le développement de modèles de lignée cellulaire surine. L'utilisation de modèles de souris knock-out et transgéniques a également grandement amélioré notre compréhension des diverses voies moléculaires qui régissent le développement et la différenciation de HNC. L'utilisation des lignées épithéliales orales murines avec un modèle génétique unique compléterait certainement ces études, et leurs essais biochimiques subséquents contribueraient au traitement et au diagnostic de HNC. Cependant, seulement quelques rapports ont décrit l'établissement des cellules épithéliales orales de souris28,29,30,31,32,33 et ces lignées cellulaires ne sont pas dans l'utilisation répandue.
La limitation principale de ces lignées épithéliales orales murines est qu'elles ne sont pas caractérisées intensivement au niveau moléculaire et se sont avérées pour exprimer des modèles de gène rares. Ainsi, la compréhension moléculaire limitée de ces modèles de lignées cellulaires murines et l'absence d'une méthodologie efficace nous ont incités à exploiter le potentiel unique de la technologie d'édition du génome AAV-CRISPR chez les souris knock-in Cas9 pour établir des lignées cellulaires murines avec modifications génétiques spécifiques. Dans cette étude, nous avons introduit et développé un système in vitro AAV-Cas9 pour transformer les cellules murines primaires en un état tumorigène pour confirmer les altérations génétiques qui donnent lieu à des cellules de carcinome. Nous avons établi avec succès des cellules épithéliales de langue murine avec des mutations génétiques spécifiques avec l'efficacité élevée utilisant l'édition somatique de gène CRISPR-négociée aAV par plusieurs combinaisons de sgRNA.
Cette méthodologie offre une nouvelle approche expérimentale pour mieux comprendre l'étiologie cellulaire-autonome de HNC. En commençant par les cellules épithéliales primaires de langue murine, nous avons pu transformer de telles cellules à la tumorigenicity en supprimant un ensemble limité de gènes et en introduisant une mutation unique de KRAS. En utilisant cette méthodologie, il est maintenant possible d'étudier si d'autres gènes connus pour être impliqués dans d'autres carcinomes peuvent produire des tumeurs malignes qui ressemblent plus étroitement à HNC. Les caractéristiques morphologiques des tumeurs de KRAS Mut EpT ont confirmé le carcinome épidermoïde de cellules. L'analyse histopathologique des tumeurs d'EpT de KRAS Mut dans les souris syngeneic est associée et soutenant le comportement biologique agressif du carcinome de tête et de cou. Ainsi, il peut être possible de lier les génotypes des cellules cancéreuses aux dispositifs cliniques et histopathologiques spécifiques des tumeurs.
Les principaux avantages de cette méthodologie sont la capacité de développer des lignées cellulaires à partir de cellules primaires à partir de n'importe quel organe en utilisant des mutations génétiques spécifiques et l'utilisation de AAV-Cas9, ce qui rend le système plus robuste et stable. Le système endogène Cas9 permet d'utiliser d'autres gènes knockouts. Le principal inconvénient de la méthodologie actuelle est le temps nécessaire pour isoler et établir la culture primaire ainsi que le titre élevé de particules virales nécessaires pour transduire les cellules primaires. Cependant, cela pourrait être surmonté en standardisant le processus d'isolement pour chaque type de cellule. Le problème de l'exigence d'un haut aAV titer viral pour une transduction efficace pourrait être atténuée par l'utilisation de la dernière génération de plasmides capsides et d'aide pour l'emballage viral et un meilleur processus de purification.
À l'avenir, un système AAV meilleur et plus efficace pourrait être conçu et extrapolé in vivo pour fabriquer des modèles de tumeurs génétiquement modifiées spécifiques à l'organe. En conclusion, l'établissement des lignées cellulaires murines par cette approche servira d'outil précieux basé sur la culture cellulaire in vitro pour tester plusieurs hypothèses dans le contexte de l'oncologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.S. est membre du conseil consultatif de l'Institut des sciences biologiques, et Menarini Ricerche a reçu des fonds de recherche de Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics et Menarini Ricerche. M.S. est également co-fondateur de Medendi Medical Travel, et au cours des 2 dernières années, a reçu des honoraires de Menarini Ricerche et ADC Pharma. Tous les autres auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Daniel Gitler de nous avoir fourni le plasmide de la plasmide de la plasmide de la plasmide delta 5. Ces travaux ont été financés par l'Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (à ME), la United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (à ME et MS), l'Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (à ME), l'Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (à ME), et la Concern Foundation (#7895) (à ME). Bourse : bourse Alon à ME et BGU Kreitman fellowships à SJ et MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
