Summary
Für das Verständnis von Neoplasie ist die Entwicklung von murinen Modellen mit spezifischen Genen erforderlich, die bei Kopf- und Nackenkrebspatienten mutiert sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vitro-Transformation von primären murinen Zungenzellen unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus-Cas9-Systems vor, um murine HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen zu erzeugen.
Abstract
Die Verwendung von primären normalen Epithelzellen ermöglicht es, genomische Veränderungen, die für die zelluläre Transformation erforderlich sind, reproduzierbar zu induzieren, indem spezifische Mutationen in Onkogene und Tumorsuppressor-Gene eingeführt werden, indem clustered regulatory interspaced kurze palindromische Wiederholung (CRISPR)-basierte Genom-Editing-Technologie bei Mäusen. Diese Technologie ermöglicht es uns, die genetischen Veränderungen, die bei menschlichen Krebserkrankungen auftreten, mit Mäusen genau nachzuahmen. Durch die genetische Umwandlung muriner Primärzellen können wir die Entwicklung von Krebs, progression, Behandlung und Diagnose besser untersuchen. In dieser Studie verwendeten wir creinduzible Cas9-Maus-Zungenepithelzellen, um die Genombearbeitung mit Adeno-assoziiertem Virus (AAV) in vitro zu ermöglichen. Insbesondere durch veränderung von KRAS, p53 und APC in normalen Zungenepithelzellen, erzeugten wir eine murine Kopf- und Halskrebs-Zelllinie (HNC) in vitro, die bei syngenischen Mäusen tumoriogen ist. Die hier vorgestellte Methode beschreibt detailliert, wie MAN HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen erzeugt und erklärt ihre Eignung zur Vorhersage der Tumorprogression bei syngenischen Mäusen. Wir stellen uns vor, dass diese vielversprechende Methode informativ und nützlich sein wird, um Tumorbiologie und Therapie von HNC zu studieren.
Introduction
HNC ist eine häufige Bösartigkeit weltweit1. Die Modellierung der Entstehung der HNC Neoplasie befindet sich derzeit an einem wissenschaftlichen Wendepunkt2. Während viele genetische Mutationen in HNC2,3,4 (z. B. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 und RAS) identifiziert wurden, bleiben die spezifischen Kombinationen genomischer Veränderungen, die zusammen erforderlich sind, um HNC zu induzieren, unklar.
Die aktuelle Verwendung menschlicher HNC-Zelllinien hat wesentlich dazu beigetragen, die Mechanismen im Zusammenhang mit Pathogenese und Behandlung zu klären3. Die Untersuchung menschlicher Zelllinien in immungeschwächten murinen Systemen hat jedoch ihre Grenzen, da diese Systeme den in vivo neoplastischen Prozess, die Rolle spezifischer Genmutationen und Behandlungsreaktionen in einer Immunmikroumgebung nicht behandeln. Daher ist die Entwicklung und Etablierung von murinen Zelllinien mit spezifischen genetischen Veränderungen von vorrangiger Bedeutung, um zu untersuchen, wie verschiedene Gene zum Transformationsprozess beitragen, und um neuartige molekülbasierte Therapien an immunkompetenten Mäusen zu testen.
Genfunktionsstudien in der biomedizinischen Forschung wurden durch Fortschritte in der DNA-Editing-Technologien erheblich beeinflusst, indem beispielsweise Doppelstrangbrüche (DSBs) eingeführt wurden, zum Beispiel5. Diese Technologien, einschließlich der Verwendung von Zinkfingernukleasen, Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornukleasen und gruppierten regulatorischen interspaceierten kurzen palindromischen Wiederholungen (CRISPR/Cas9), ermöglichen die Manipulation jedes Gens, das an seinem Ort von Interesse ist. Die neuesten CRISPR/Cas9-Systeme bestehen aus einer Guide-RNA (gRNA), die die Cas9-Nuklease anweist, um ein DSB an einem bestimmten Standort im Genom zu erzeugen. Dieses System hat eine umfassende Anerkennung bei der Modifizieren endogener Gene in jeder Zelle oder Zielgewebe gewonnen, selbst in den traditionell schwer zu behandelnden Organismen5. Es hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Systemen aufgrund seiner Einfachheit, Geschwindigkeit und Effizienz.
In der Onkologie hat die CRISPR/CAS9-Technologie die Notwendigkeit erfüllt, Krebszellen effektiv zu imitieren. Um dieses System im HNC zu etablieren, haben wir das potente KRAS-Onkogen und zwei wichtige Tumorsuppressorgene, APC und p536,manipuliert. Laut der GENIE-Datenbank7ist diese Kombination im HNC selten. RAS-Mutationen (HRAS, NRAS und KRAS) sind nur in 7 % aller HNC-Populationen vorhanden. Diese Tumoren neigen dazu, resistent gegen Therapie8,9.
Die Lieferung von Cas9 und seiner gRNA erfolgt durch virale Transduktion mit AAVs oder Lentiviren. Rekombinantes AAV ist oft die bevorzugte Methode zur Bereitstellung von Genen an Zielzellen aufgrund seiner hohen Titer, milde Immunantwort, Fähigkeit, eine breite Palette von Zellen zu transduzieren, und allgemeine Sicherheit. Mit Hilfe eines AAV-Systems wurden verschiedene gewebespezifische Mauszelllinien generiert, und neue Zelllinien werden noch entwickelt10,11,12. Es muss jedoch noch ein effizientes genomisches Bearbeitungssystem entwickelt werden, das murine HNC-Zelllinienmodelle erzeugen kann. In dieser Studie versuchten wir, ein in vitro AAV-Cas9-basiertes System zur Umwandlung von primären murinen Zungenzellen in einen tumorgenen Zustand zu entwickeln. Dieses einzigartige CRISPR/Cas9-Transformationsprotokoll und die etablierte Tumorzelllinie können verwendet werden, um die Biologie von HNC, die durch eine Vielzahl von genomischen Veränderungen induziert wird, besser zu verstehen.
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Protocol
Diese Studie wurde von der Ben Gurion University of the Negev Animal Care and Use Committee genehmigt. Tierversuche wurden von der IACUC genehmigt (IL.80-12-2015 und IL.29-05-2018(E)). Alle Aspekte von Tierversuchen, -unterkünften und Umweltbedingungen, die in dieser Studie verwendet wurden, entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren13.
1. Adeno-assoziierte Virusproduktion
- Tag 1: Zellkultur
- Samen 4 x 106 HEK293T Zellen pro 14,5 cm Platte in 15 ml DMEM. Bereiten Sie 10 Platten für die Transfektion mit Polyethylenimin (PEI) (1 g/ l) vor.
- Tag 2: Transfektion von HEK293T-Zellen mit PEI
- Entfernen Sie die Medien und speisen Sie mit warmem DMEM 1 h vor der Transfektion.
- Vorwarme Transfektionsreagenzien und DMEM.
- Verwenden Sie 10 g des von Interesse sindden Plasmids, das AAV ITR enthält (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 g des AAV 2/9n Capsid-Plasmids (mit dem Rep-Gen von AAV2 und dem Cap-Gen von AAV9 und 10 g des Helferplasmids (pAdDelta F5-Helfer) pro Platte (siehe Tabelle).
HINWEIS: Eine neue Generation von Helfer-Plasmid - pAdDeltaF614,15,16, die auch für die AAV-Produktion verwendet werden kann, ist verfügbar. - Mischen Sie die Plasmide in 1 ml reines DMEM pro Platte. Dann fügen Sie 90 l Polyethylenimin (Gesamtplasmid: PEI-Konzentration = 1:3) kurz in die Plasmidmischung und Wirbel.
- Inkubieren Sie den PEI-Plasmid-DNA-Mix 20 min bei Raumtemperatur (RT).
- Fügen Sie die Mischung tropfenweise auf die HEK293T-Zellen und übertragen Sie die Platten auf den Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h.
- Tag 3: Mittlerer Wandel nach Transfektion
- Entfernen Sie das Medium vollständig und fügen Sie 15 ml frisches DMEM hinzu.
- Tag 5: Das Virus ernten
- Bereiten Sie ein Trockeneis/Ethanol-Bad vor.
- Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen Sie sie in 50 ml-Rohre (2 Platten pro 50 ml Rohr).
- Spin Rohre bei 800 x g für 15 min bei Raumtemperatur.
- Entsorgen Sie den Überstand aus allen Rohren. 0,5 ml des Lysepuffers (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) pro Platte (d.h. 5 ml für 10 Platten) nur in das erste Rohr geben. Setzen Sie die Zellen wieder auf, und übertragen Sie das Gesamtvolumen auf die nächste Röhre, und fahren Sie bis zur letzten Röhre fort.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein frisches 50 ml-Rohr. Waschen Sie die Rohre mit dem gleichen Volumen des Lysepuffers (0,5 ml pro Platte) nach dem gleichen Übertragungsverfahren wie in Schritt 1.4.4 beschrieben.
- Unterziehen Sie die Zellsuspension drei Runden von 10 min Gefrier-/Tauzyklen zwischen einem Trockeneis/Ethanol-Bad und einem 37 °C-Wasserbad. Wirbel kurz nach jedem Auftauen.
- Wenn die Reinigung am selben Tag durchgeführt wird, stellen Sie den Ausgleichs- und Elutionspuffer (siehe Tabelle 1 für das Rezept) auf RT fest.
- 50 Einheiten Benzonase pro Platte hinzufügen und bei 37 °C für 1,5 h brüten.
HINWEIS: Benzonase wird verwendet, um Restnukleinsäuren aus den Wirtszellen und die Plasmid-DNA in der Zellsuspension zu verdauen. - Drehen Sie die Rohre bei 3.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- Sammeln Sie den Überstand in einer Spritze mit einer 18 G Stahlnadel und drücken Sie die Lösung durch einen 0,45 m Filter in ein 15 ml Rohr, um das rohe Lysat zu erhalten.
- Das Rohlysat einige Wochen bei 4 °C lagern, bis die Reinigung oder die weitere Reinigung andauert.
2. AAV-Reinigung
- Tag 5 oder später
- Platzieren Sie den Gleichgewichts- und Elutionspuffer bei RT.
- Waschen Sie Chromatographiesäulen mit 10 ml des Ausgleichspuffers.
- 0,5 ml pro Platte Heparin-Agarose in die Spalte17 geben und dann den Ausgleichspuffer (4x das Volumen der Heparin-Agarose) hinzufügen. Mischen Sie die Lösungen, indem Sie die Säule invertieren und lassen Sie die Agarose Sediment.
- Elute den Ausgleichspuffer aus der Spalte durch Schwerkraft.
HINWEIS: Lassen Sie einen Gleichgewichtspuffer, um das Austrocknen der Agarose zu verhindern. - Das rohe Lysat auf die Säule laden und bei 4 °C bei konstanter Rührung 2 h brüten. Bringen Sie die Säule in eine aufrechte Position und lassen Sie die Agarose sedimentieren.
- Elute das grobe Lysat durch die Schwerkraft.
- Waschen Sie die Säule mit Ausgleichspuffer (4x das Volumen der Heparin-Agarose).
- Legen Sie einen 100 kDa Zentrifugalproteinfilter unter die Säule und löschen Sie das Virus mit einem Elutionspuffer (3x des Volumens der Heparin-Agarose) in den Filter.
HINWEIS: Der Elutionspuffer sollte 15 ml nicht überschreiten. - Zentrifugieren Sie den Filter bei 3.000 x g für 30 min, bis weniger als 1 ml im Filter verbleibt.
- Füllen Sie den Filter mit PBS und Zentrifuge bei 3.000 x g für 30 min, bis weniger als 1 ml im Filter verbleibt. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um alle Salze zu entfernen.
- Konzentrieren Sie die Viruslösung im Filter durch Zentrifugierung auf 3.000 x g, um ein möglichst geringes Volumen (weniger als 200 l) zu erreichen.
- Saugen Sie die Viruslösung mit einer Nadel und Spritze und drücken Sie die Lösung durch einen 0,22 m Filter in ein Rohr.
- Machen Sie Aliquots von konzentrierten virusischen Partikeln für die Lagerung.
ANMERKUNG: Die Aliquots sollten bei kurzfristiger Lagerung bei 4 °C 20 l und bei Langzeitlagerung bei -80 °C bei Langzeitspeicherung 20 L betragen. - Bestimmen Sie die virale Titer- und virale Transduktionseffizienz, wie zuvor beschrieben14,18,19,20.
3. Isolation und Kultur von Primärzellen
- Tag 1
- Euthanisieren Sie ein 6 Wochen altes männliches oder weibliches B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J durchCO2-Erstickung oder ein anderes IACUC-zugelassenes Protokoll.
HINWEIS: Diese CRISPR/Cas9-Knockin-Mäuse haben eine crerekombindienabhängige Expression von cas9-Endonuklease und EGFP, die von einem CAG-Promotor geleitet werden. Die vorgelagerte Lox-Stop-Lox (LSL) Sequenz, die im Genom dieser Mäuse vorhanden ist, verhindert die Expression von Cas9 und EGFP in Abwesenheit von Cre Recombinase. In Kombination mit Single Guide RNAs (sgRNAs) und einer Cre-Quelle ermöglichen sie die Bearbeitung von Einzel- oder Mehreren Mausgenen in vivo oder ex vivo14. - Sezieren Sie die Zunge von den eingeschläferten Mäusen mit einer chirurgischen Schere.
- Trennen Sie das Gewebe manuell, indem Sie das Zungengewebe mit einem Skalpell in sehr kleine Fragmente zerkleinern. Sammeln Sie die Gewebefragmente in einem 15 ml-Röhrchen, das 4,5 ml RPMI-Normalmedium (mit Ausserum) enthält.
- Fügen Sie den dreifachen Enzymmix (200 l) (siehe Tabelle 1 für das Rezept) zu den Gewebefragmenten hinzu.
- Inkubieren Sie den Gewebe-Enzym-Mix bei 37 °C für 30 min und tippen Sie alle 10 min auf die Röhre, um die enzymatische Dissoziation des Gewebes zu verbessern.
- Fügen Sie 5% fetales Rinderserum (FBS) mit HBSS/PBS in den Gewebe-Enzym-Mix ein, um die Enzymwirkung zu stoppen.
- Filtern Sie die obige Zellsuspension durch ein steriles 70-m-Nylongewebe, um die dispergierten Zellen und größere Gewebefragmente zu trennen.
- Waschen Sie die gefilterte Zellsuspension durch Zentrifugation für 300 x g für 5 min in HBSS/PBS bei RT.
- Das Pellet im Kulturmedium (10% FBS in RPMI/DMEM) wieder aufhängen und in 60 mm Kulturgerichten wachsen, bis sich verschiedene Zellkolonien bilden.
- Kulturzellaggregate, die auf dem Filter in einer 60-mm-Kulturschale aufbewahrt werden, die 3 ml vollständige Medien (10% FBS in RPMI/DMEM) enthält, bis Zellkolonien gebildet werden.
- Mikroskopisch untersuchen Sie die Primärzellen auf das Vorhandensein von Fibroblastenkontamination nach 1 Woche Kultur. Behandeln Sie die aus Aggregaten und Zellsuspensionen entwickelten Primärzellen mit 0,25 Trypsin 0,02% EDTA-Lösung bei 37 °C für 1 min, um Fibroblasten zu entfernen.
HINWEIS: Normalerweise erzeugt die Primärkultur aus Zellaggregaten mehr Kolonien als Einzelzellsuspensionen. Die Zellen aus diesen Kolonien sorgen für eine bessere Transduktionseffizienz mit AAV-Transduktion.
- Euthanisieren Sie ein 6 Wochen altes männliches oder weibliches B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J durchCO2-Erstickung oder ein anderes IACUC-zugelassenes Protokoll.
4. AAV-Transduktion von Primärzellen
- Tag 10
- Samen 2 x 105 Primärzellen pro Brunnen in 6 Brunnenplatten in 2 ml Gesamtmedien (10% FBS in RPMI/DMEM).
- Am nächsten Tag die Zellen mit 1012 viralen Genomen/ml (1010 Transducing Units/mL) zu transduzieren und die Zellen in viralen partikelhaltigen Medien für 48 h bei 37 °C zu inkubieren.
- Entfernen Sie die viralen partikelhaltigen Medien und füttern Sie die AAV-transduced Zellen mit vollständigen Medien.
HINWEIS: Nur Zellen, die einer Transduktion unterzogen wurden, drücken GFP aus und beginnen sich zu vermehren. Zellen, die sich keiner Transduktion unterzogen haben, werden schließlich innerhalb von 2 Wochen sterben. - Nach 2 Wochen Kulturerweiterung säen Sie die Zellen für die Validierung und die in vivo tumorigenen Experimente.
HINWEIS: Genomische DNA aus AAV-transduzierten Zellen und normale Primärzellen von Cas9-Mäusen wurden extrahiert, um die spezifische Genombearbeitung mithilfe von Standardprotokollen zu validieren. Die Sequenzierung der extrahierten DNA und die Analyse der sequenzierten Daten (Tabelle 2) wurden mit einem hybridisierungserfassungsbasierten Sequenzierungstest der nächsten Generation (z. B. MSK-IMPACT-Plattform) durchgeführt, wie zuvorbeschrieben 21.
5. Validierung der Umwandlung normaler Zellen in tumorgene Zellen mittels Immunfluoreszenz und westlicher Blotting
- Immunofluoreszenz
- Samen 2 x 105 Zellen auf 12 mm Glasabdeckungen und legen Sie sie über Nacht in einen Inkubator.
- Fixzellen in 4% Paraformaldehyd in PBS (pH = 7.4) und Verfahren zur Immunfluoreszenzkennzeichnung.
- Inkubieren Sie die festen Zellen mit dem ersten primären Antikörper in 1% BSA oder 1% Serum in PBST in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C. Die primären Antikörper sind die monoklonalen Anti-KRT 14-Kaninchen-, monoklonalen Anti-E-Cadherin-Antikörper und Cas9-Maus mAb.
- Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus den Abdeckungen, indem Sie die Zellen 3x für 5 min mit 1x PBS waschen.
- Inkubieren Sie die Zellen mit Cy3 Esel Anti-Kaninchen IgG und/oder Cy3 Ziege Anti-Maus-IgG sekundäre Antikörper in 5% BSA in PBST für 1 h bei RT im Dunkeln.
- Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung aus den Abdeckungen und waschen Sie die Zellen wie in Schritt 5.1.4 beschrieben 3x.
- Montieren Sie die Abdeckungen mit einem Tropfen Montagemedium, das DAPI (DAPI Fluoromount) enthält.
- Im Dunkeln bei 4 °C lagern, bis die Dias mit der Fluoreszenzmikroskopie abgebildet sind.
- Western Blotting
- Samen 1 x 106 transformierte Zellen in einer 100 mm Kulturschale und legen Sie sie über Nacht in einen Inkubator.
- Waschen und kratzen Sie die umgewandelten Zellen in 200 l eiskalte PBS.
- Zentrifugieren Sie das Rohr, das die Zellsuspension für 10 min bei 2.000 x g bei 4 °C enthält, um die Zellen zu pellet.
- Aspirieren Sie den Überstand und lysieren Sie die Zellen mit Lysepuffer (siehe Tabelle 1), der Phosphatase-Inhibitor-Cocktails und einen Protease-Inhibitor für 10 min bei 4 °C enthält. Zentrifugieren Sie die Lysate 10 min bei 10.000 x g und 4 °C und sammeln Sie die gereinigten Lysate.
- Verwenden Sie ein handelsübliches Bradford-Assay-Kit, um die Proteinkonzentration nach dem Herstellerprotokoll zu bestimmen. Verwenden Sie 4x Probenpuffer (500 mM Tris pH = 6,8, 40% Glycerin, 8% SDS, 20%H2O, 0,02% Bromphenolblau), um die Proteinproben auf 0,5 oder 1 g/l einzustellen. Bei 96 °C für 5 min kochen.
HINWEIS: Die Proben können bei -80 °C oder bis zur Durchgeführt einer Western Blot Analyse gelagert werden. - Separate gleiche Mengen des Gesamtlysats (30 g) durch 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Stellen Sie sicher, dass der Farbstoff den Boden des Gels erreicht. Übertragen Sie das Protein 30 min durch halbtrockenes Blotting bei 25 V auf die Nylonmembran.
- Gießen Sie 5% BSA in Tris-gepufferter Kochsaline (TBS)-0,1% Tween (TBST) über die Membran, um sie vollständig zu bedecken. Blockieren Sie die Membran für 1 h bei RT. Inkubieren Sie das Mebranmit mit primären Antikörpern (Anti-Cre, Anti-Cas9, Anti-GFP, Anti-Catenin, Anti-p53, Anti-Phospho-ERK und Anti-A-Actin in 5% BSA TBST) bei 4 °C über Nacht verdünnt.
- Waschen Sie die Membranen nach der Inkubation 10 min mit 1x TBST, um sicherzustellen, dass die Lösung die Membran vollständig abdeckt. Führen Sie diese Wäsche 3x, und fügen Sie dann Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörper (verdünnt 1:10,000 in 5% BSA TBST) in die Membran. 1 h bei RT inkubieren.
- Waschen Sie die Membranen nach der Inkubation 10 min mit 1x TBST, um sicherzustellen, dass die Lösung die Membran vollständig abdeckt. Führen Sie die Chemilumineszenz-Bildgebung (siehe Tabelle der Materialien) durch, um die Bänder verfügbar zu machen und Bilder entsprechend zu erfassen.
- Validierung des tumorgenen Potenzials transformierter Zellen in immunkompetenten Mäusen
HINWEIS: Mäuse wurden gemäß den institutionellen Richtlinien der Ben-Gurion-Universität des Negev gepflegt und behandelt. Nicken. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) und C57BL/6-Mäuse wurden für die In-vivo-Studien verwendet. Mäuse wurden in luftgefilterten laminaren Strömungsschränken mit einem 12-stündigen Licht-Dunkel-Zyklus untergebracht und mit Nahrungsmitteln und Wasser ad libitum gefüttert.- Verwenden Sie 6-8 Wochen alte hündin NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) und C57BL/6-Mäuse für die Studie.
- Trypsinize die AAV-Cas9 transformierten Zellen. Stoppen Sie die Trypsinisierung mit DMEM vorgewärmt bei 37 °C und sammeln Sie in einem 50 ml Rohr.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 800 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in DMEM-Medium ohne FBS wieder auf. Führen Sie die Zentrifugation erneut durch und setzen Sie das Zellpellet in 1x PBS wieder auf.
HINWEIS: Bewahren Sie die Zellen nicht zu lange in 1x PBS auf. Halten Sie die Zellsuspension immer auf Eis, um Zellverklumpung zu verhindern. - Verwenden Sie einen automatischen Zellzähler, um die Zellen zu zählen und die Zellen mit 1x PBS auf die gewünschte Konzentration (2,5 x 107 Zellen/ml) zu verdünnen. Generieren Sie Tumore durch eine subkutane Injektion der AAV-Cas9 transformierten Zellsuspension in der rechten Flanke jedes NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) Maus (2 x 106 Zellen/Maus). Um ein orthotropes Modell bei syngenischen Mäusen zu erzeugen, injizieren Sie 0,5 x 106 Primärzellen oder die AAV-Cas9-transformierten Zellen in die Zunge von C57BL/6 immunkompetenten Mäusen.
- Euthanisieren Sie die Tiere 2 Wochen nach der Injektion durch CO2-Erstickung, und sezieren Sie die Tumoren von den eingeschläferten Mäusen für die Immunhistochemie-Analyse.
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Representative Results
Verwenden des AAV-Systems zum Transformieren normaler Cas9-Zellen
Abbildung 1 enthält eine detaillierte Vektorkarte des in dieser Studie verwendeten Transgenplasmids AAV. Abbildung 2 zeigt das Design und die Funktionsweise des AAV-Cas9-basierten Systems. Um virale Partikel zu produzieren, wurden die HEK293T-Zellen mit dem AAV-Transgenvektor und anderen viralen Verpackungsvektoren mit der PEI-Transfektionsmethode transfiziert. Nach der Transfektion wurden die virushaltigen Zellen gesammelt und lysiert, und mit dem Heparin-Agarose-Reinigungsprozess wurden die Viruspartikel gereinigt und konzentriert (Abbildung 2A). Diese gereinigten Viruspartikel wurden für die In-vitro-Transformation von Primärzellen verwendet, die von Cas9-Mäusen isoliert wurden, um die Wirksamkeit zu überprüfen. In unserem System wird die AAV-Transgenexpressionskassette durch homologe Rekombination in die cre-abhängige Cas9 Rosa26 Targeting-Vorlage in Mauszellen eingeführt, die einen allgegenwärtigen CAG-Promotor (pCAG), eine LoxP-Stop-LoxP-Kassette (LSL), ein Cas9-Nuklease-Gen, ein selbstspaltendes P2A-Peptid und das Reportergen (EGFP) tragen, das von zwei homologenArmenflankiert wird. Die Cre-Rekombinatoa-Aktivität der transduzierten Zellen setzt die LSL aus und induziert Cas9- und GFP-Expression (Abbildung 2B). Die Cas9-Nuklease-Aktivität führt einen doppelsträngigen Bruch an den Zielstandorten ein, der über gRNAs gesteuert wird, und hilft bei der Genbearbeitung. Das in dieser Studie verwendete AAV-System hilft bei der Bereitstellung von multiplexed gRNAs (sgRNAs for KRAS, p53, and APC) und auch bei der Exzidung eines onkogenen KRASG12D-Alleels durch homologiegesteuerte Reparatur (HDR) in den transduced Cells.
Abbildung 1: Vektorkarte des in dieser Studie verwendeten AAV-Transgenplasmids. Dieses AAV-System verfügt über ein AAV-Backbone, das Cre-Rekombinatase und drei U6-gesteuerte sgRNAs für KRAS, p53 und APC ausdrückt. Es enthält auch einen KRAS G12D Homologie-gesteuerten Reparatur (HDR) Spender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Entwurf und Betrieb eines AAV-Cas9-Systems bei der Transformation normaler Zellen. (A) Umriss der Herstellung und Reinigung von AAV-Partikeln aus HEK293T nach Transfizierung mit den AAV-Transgen- und Verpackungsplasmiden. (B) Virale Transduktion von Primärzellen mit AAV-Partikeln und der Mechanismus, durch den die creabhängige Cas9-Expression die CRISPR-Bearbeitung und die Umwandlung von Primärzellen in tumorgene Zellen ermöglicht. Ein einziger AAV-Vektor, der gRNAs für drei verschiedene Gene mit einem Knockin des KRAS G12D-Allels durch HDR mit einer Cre-Rekombinatog-Expressionskassette integriert, wurde in cre-abhängige Cas9-Maus-Primärzellen geliefert. Die Cre-Rekombinantase-Aktivität in den transduzierten Zellen führt zur Exzision der LoxP-Stop-LoxP-Kassette und induziert Cas9- und GFP-Expression. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Validierung des AAV-Cas9-Systems in vitro in isolierten embryonalen Fibroblastenzellen der Maus
Primäre embryonale Fibroblasten (MEF) wurden ausschließlich verwendet, um die Folgen der Genablation bei Zellwachstum und Proliferation zu untersuchen22. Um die Effizienz des AAV-Cas9-Systems bei der Transformation normaler Zellen zu validieren, transduzierten wir MEF-Zellen, die aus Cas9-Mausembryonen (E14) isoliert wurden, mit AAV. Die MEF-Zellen wurden wie zuvor beschrieben23,24isoliert. MEFs aus 14 Tage alten Cas9-Mausembryonen wurden verwendet, weil sie leicht zu kulturieren und in vitro zu transducieren. Kurz gesagt, um MEFs über AAV-Transduktion zu transformieren, wurden primäre MEFs bei etwa 30 % Zusammenfluss als transduktuktionsbereit betrachtet. Eine Stunde vor der Transduktion wurden die MEF-Kulturmedien verändert. Der gereinigte AAV wurde auf Eis aufgetaut und die MEF-Kulturmedien angesaugt. Viraler Überstand mit einem Titer, der von 106-1014 viralem Genom/ml variiert, wurde jedem Brunnen zugesetzt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Der virale Überstand wurde nach 48 h entfernt, durch 2 ml MEF-Kulturmedium ersetzt und dann bei 37 °C bis zur GFP-Expression, etwa 5 Tage nach der Transduktion, inkubiert. GFP-exemitende MEFs wurden subkultiviert und validiert. Beachten Sie, dass wir für diesen Vektor festgestellt haben, dass 1012 virale Genome/ml (entspricht 1010 Transducing Units/mL) primäre MEF-Zellen effizient in tumorgene MEFs transformieren könnten (Abbildung 3A). Die transduced Zellen exprimierten Cre, Cas9 und GFP (Abbildung 3B,C). Um auf das tumorgene Potenzial der aAV-transformierten MEF-Zellen zuzugreifen, wurden 0,5 x 106 Zellen (primär/AAV-transduced MEF) in die Zunge, Lippe und subkutan in NOD-SCID-Mäuse injiziert. Transformierte Zellen bildeten bei diesen Mäusen Tumore, verglichen mit dem primären MEF, das keine Tumore bildete (Abbildung 3D-F).
Abbildung 3: Validierung und In-vitro-Transformation primärer MEF-Zellen mit dem AAV-Cas9-System. (A) Umriss der In-vitro-Transformation von Fibroblasten von Embryonen, die von Cas9-Mäusen mit AAV-Partikeln gesammelt wurden. (B) Repräsentatives Immunfluoreszenzbild primärer MEF- und AAV-transduzierter MEF-Zellen, die die Expression von GFP, Cre und Cas9 zeigen. DAPI wurde verwendet, um den Kern zu färben. (C) Western Blotting zeigt Cre, Cas9, GFP und A-Actin in embryonalen normalen Fibroblasten und genetisch bearbeiteten Fibroblasten. (D) Repräsentatives Bild eines Zungentumors, der sich in einer NOD-SCID-Maus nach der Injektion mit transformierten Fibroblastenzellen entwickelte. (E) Repräsentatives Bild eines Lippentumors, der sich in einer NOD-SCID-Maus nach der Injektion mit transformierten Fibroblastenzellen gebildet hat. (F) Repräsentatives Bild eines Flankentumors, der sich in einer NOD-SCID-Maus nach der Injektion mit transformierten Fibroblastenzellen entwickelte. Die Pfeile weisen auf einen Tumor hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In-vitro-Generierung der tumorgenen murinen Zungenepithelzelllinie aus primären Zungenepithelzellen unter Verwendung des AAV-Cas9-Systems
Nach der Validierung der transformierenden Eigenschaft des AAV-Systems unter Verwendung der MEF-Zellen isolierten wir primäre Zungenepithelzellen von Cas9-Mäusen und kultivierten sie in vitro. Die primären Zungenzellen wurden mit AAV-Viruspartikeln (1010 cfu/ml) transduziert, und nach einer Woche begannen die Zellen, GFP auszudrücken. Die tumorgene Transformation von primären Zungenepithelzellen (Abbildung 4A) wurde mit Immunfluoreszenz und Westlicher Blotting bestätigt ( Abbildung4B,C). Die transformierten Zellen weisen eine verbesserte KRT 14-, E-Cadherin- und GFP-Expression auf (Abbildung 4B). Die tumorgene Transformation von primären Zungenepithelzellen wurde durch die Expression von GFP (d.h. die cre-abhängige Expression von Cas9 und GFP) bestätigt (Abbildung 4C). Die Expression von KRT14 und E-Cadherin bestätigt ihre Epithelzelleigenschaften. Die Proteinvalidierung bestätigte verbessertes -catenin, Phospho-ERK und reduzierte p53-Expression (Abbildung 4C), was auf die effektive Downregulation von APC und p53 und die Aufnahme von mutiertem KRAS in die Zungenzellen hindeutet, wodurch sie tumoriogen werden. Die Genomanalyse durch tiefe Sequenzierung der aus den transformierten Zellen isolierten DNA bestätigte die effektive Genbearbeitung und Frameverschiebung der TP53- und APC-Gene durch das AAV-Cas9-System (Tabelle 2). Die tumorgene Eigenschaft der AAV-transformierten Zungenzelllinie wurde weiter bewertet, indem sie in die Zunge immunkompetenter Wildmäuse des Typs C57BL/6 injiziert wurde. Die transformierten Zungenzellen, die als KRAS-mutierte Epithelzellen der Zunge (KRAS Mut EpT) bezeichnet werden, bilden bei C57BL/6-Mäusen effizient Tumore (Abbildung 4D). KRAS Mut EpT Tumoren wurden von einem Mund- und Kiefer-Gesichtspathologen durch routinemäßige Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) und durch Immunhistochemie untersucht. Die Tumoren zeigten eine Spindelzellmorphologie mit prominenter Kernatypie: Pleomorphismus, Hyperchromatismus, Riesenkerne, mehrere Nukleoli und eine hohe Mitotische Rate mit atypischen Mitotischen. Perivaskuläre Invasion und Angioinvasion wurden ebenfalls festgestellt. Diese morphologischen Merkmale wurden von sehr begrenzten auf nicht existierende tumorassoziierte Entzündungen begleitet. Immunohistochemisch waren die neoplastischen Zellen zytoplasmatisch positiv für E-Cadherin und KRT 14, beide Marker des Epithelgewebes. KRT 14 ist typisch für Plattenepithel, unterstützt den Plattenepithelursprung der Tumorzellen und damit die Diagnose des Plattenepithelkarzinoms (Abbildung 4E). Daher bietet dieser Ansatz eine vielseitige Methodik zur Transformation von Primärzellen in vitro mit einer gewünschten Genveränderung. Darüber hinaus erleichtert diese Methode die Verwendung dieser entwickelten Zelllinien in vivo in syngenen Mäusen für ein besseres Verständnis der Neoplasie in einem echten Tumor-Mikroumgebungsmilieu.
Abbildung 4: In-vitro-Transformation von Primärzungenepithelzellen unter Verwendung des AAV-Cas9-Systems. (A) Schematische Darstellung der In-vitro-Transformation normaler Epithelzellen aus der Zunge von Cas9-Mäusen. (B) Repräsentatives Immunfluoreszenzbild von AAV-transduced Zungenepithelzellen, die die Expression von KRT14, E-Cadherin und GFP zeigen. (C) Western Blot zeigt Cas9, B-Catenin und Phospho-ERK-Upregulation mit p53-Proteinspiegel Downregulation, die die genetisch bearbeiteten Epithelzellen zeigt. (D) Repräsentatives Bild eines Tumors, der sich in der Zunge der immunkompetenten Mäuse entwickelte, nachdem sie sie mit transformierten Zungenepithelzellen injiziert hatten (KRAS Mut EpT). (E) Repräsentative Bilder von Tumorgewebeabschnitten für H&E, E-Cadherin und KRT 14 Färbung bei 20-facher und 40-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zelllysepuffer für die virale Ernte | Volumen |
| 150 mM NaCl | 876,6mg |
| 50 mM Tris-HCl | 605,7mg |
| Verwenden Sie HCl, um pH 8,5 einzustellen | |
| Molekulares Wasser | Bis zu 100 ml |
| Ausgleichspuffer | |
| 1 mM MgCl2 | 9,52 mg |
| 2,5 mM KCl | 18,64mg |
| Mischen Sie alle in PBS 1X und stellen Sie pH auf 7,2 | Bis zu 100 ml |
| Elutionspuffer | |
| 0,5 M NaCl | 2.92g |
| Mischen Sie alle in PBS 1X und stellen Sie pH auf 7,2 | Bis zu 100 ml |
| 10X Triple Enzyme Stock Lösung: | |
| Kollagenase | 1 g Endkonz. [10 mg/ml] |
| Hyaluronidase | 100 mg [1 mg/ml] |
| Dnase | 20.000 Einheiten Endkonz. [200 mg/ml] |
| PBS 1X | Bis zu 100 ml |
| Plasmid-Mischung (für eine 14,5 cm Platte) | |
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR | 10 g |
| AAV 2/9 Kapsidvektor | 10 g |
| pAD Delta F5 Helfer | 10 g |
| PEI (1 g/l Bestand) | 90 x l |
| DMEM | 1 ml |
Tabelle 1: Rezepte der in dieser Studie verwendeten Puffer.
Tabelle 2: Genomanalysedaten von Kras Mut EpT-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
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Discussion
Mehrere Methoden wurden zuvor verwendet, um primäre Zellen in Kultur mit variablen Erfolgsgraden25,26,27,28zu transformieren. Die meisten dieser Methoden verwenden Maus-Fibroblastenzellen für die Transformation14,17,18,19 oder verwenden Karzinogene wie 4-Nitrochinolin-1-Oxid (4-NQO)21,22 für die Entwicklung von murinen Zelllinienmodellen. Die Verwendung von Knockout- und transgenen Mausmodellen hat auch unser Verständnis der verschiedenen molekularen Pfade, die die Entwicklung und Differenzierung von HNC steuern, erheblich verbessert. Die Verwendung von murinen oralen Epithelzelllinien mit einem einzigartigen genetischen Muster würde diese Studien sicherlich ergänzen, und ihre nachfolgenden biochemischen Assays würden zur Behandlung und Diagnose von HNC beitragen. Allerdings haben nur wenige Berichte die Etablierung von Maus-Epithelzellen28,29,30,31,32,33 beschrieben und diese Zelllinien sind nicht weit verbreitet.
Die Hauptbeschränkung dieser murinen oralen Epithelzelllinien ist, dass sie nicht extensiv auf molekularer Ebene charakterisiert sind und ungewöhnliche Genmuster exprimieren. So veranlassten uns das begrenzte molekulare Verständnis dieser murinen Zelllinienmodelle und das Fehlen einer effizienten Methodik, das einzigartige Potenzial der AAV-CRISPR-Genom-Editing-Technologie in Cas9-Knock-in-Mäusen zur Etablierung muriner Zelllinien mit spezifischen Genveränderungen. In dieser Studie haben wir ein In-vitro-AAV-Cas9-System eingeführt und entwickelt, um primäre murine Zellen in einen tumorgenen Zustand zu transformieren, um die genetischen Veränderungen zu bestätigen, die zu Karzinomzellen führen. Mit AAV-vermittelter CRISPR-induzierter somatischer Genbearbeitung durch mehrere sgRNA-Kombinationen haben wir erfolgreich murine Zungenepithelzellen mit spezifischen Genmutationen mit hoher Effizienz etabliert.
Diese Methode bietet einen neuen experimentellen Ansatz für ein besseres Verständnis der zellautonomen Ätiologie des HNC. Ausgehend von murinen primären Zungenepithelzellen waren wir in der Lage, solche Zellen in Tumorigenizität umzuwandeln, indem wir einen begrenzten Satz von Genen löschten und eine einzelne KRAS-Mutation einführten. Mit dieser Methode ist es nun möglich zu untersuchen, ob andere Gene, von denen bekannt ist, dass sie in andere Karzinome verwickelt sind, Bösartige Nalignitäten hervorrufen können, die dem HNC näher kommen. Die morphologischen Eigenschaften der Tumoren von KRAS Mut EpT bestätigten plattenförmiges Zellkarzinom. Die histopathologische Analyse von KRAS Mut EpT Tumoren bei syngenischen Mäusen ist mit dem aggressiven biologischen Verhalten des Kopf- und Nackenkarzinoms verbunden und unterstützt es. So kann es möglich sein, die Genotypen von Krebszellen mit bestimmten klinischen und histopathologischen Merkmalen der Tumoren zu verknüpfen.
Die Hauptvorteile dieser Methode sind die Fähigkeit, Zelllinien aus Primärzellen aus jedem Organ mit spezifischen Genmutationen zu entwickeln, und die Verwendung von AAV-Cas9, was das System robuster und stabiler macht. Das endogene Cas9-System ermöglicht es, andere Genknockouts zu nutzen. Der Hauptnachteil der aktuellen Methodik ist die Zeit, die benötigt wird, um die Primärkultur zu isolieren und zu etablieren, sowie der hohe Titer von Viruspartikeln, die für die Transducder der Primärzellen erforderlich sind. Dies könnte jedoch durch Standardisierung des Isolationsprozesses für jeden Zelltyp überwunden werden. Das Problem, einen hohen AAV-Virustiter für eine effiziente Transduktion zu benötigen, könnte durch den Einsatz der neuesten Generation von Kapsid- und Hilfsplasmiden für virale Verpackungen und einen besseren Reinigungsprozess gemildert werden.
In Zukunft könnte ein besseres und effizienteres AAV-System entwickelt und in vivo extrapoliert werden, um organspezifische genetisch veränderte Tumormodelle zu erstellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Festlegung der murinen Zelllinien durch diesen Ansatz als wertvolles, auf Zellkultur basierendes Werkzeug dienen wird, um mehrere Hypothesen im Kontext der Onkologie zu testen.
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Disclosures
M.S. ist Mitglied des Beirats des Bioscience Institute, und Menarini Ricerche hat Forschungsgelder von Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics und Menarini Ricerche erhalten. M.S. ist auch Mitbegründer von Medendi Medical Travel und wurde in den letzten 2 Jahren von Menarini Ricerche und ADC Pharma geehrt. Alle anderen Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Daniel Gitler für die Bereitstellung des pAd Delta 5 Helper Plasmids. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (to ME), der United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (an ME und MS), der Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (to ME), der Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (to ME) und der Foundation Concern (#7895) (ME) (ME) (an ME) finanziert. Stipendium: das Alon-Stipendium für ME- und BGU Kreitman-Stipendien an SJ und MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
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