Summary
פיתוח של מודלים murine עם גנים ספציפיים מוטציה בראש ובצוואר חולי סרטן נדרש להבנת neoplasia. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור שינוי בלתי מתורבת של תאי הלשון הראשי murine באמצעות מערכת וירוס הקשורים adeno-Cas9 כדי ליצור קווים מורין HNC התאים עם שינויים גנומית ספציפיים.
Abstract
השימוש בתאי אפיתל הראשוני נורמלי מאפשר ליצור לגרום לשינויים גנומית נדרש עבור שינוי הסלולר על ידי החדרת מוטציות ספציפיות אונגנים וגנים מדכא הגידול, באמצעות במרווחים רגולציה באשכולות לחזור קצר palindromic (CRISPR)-מבוססי הגנום עריכת טכנולוגיה בעכברים. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לחקות במדויק את השינויים הגנטיים המתרחשים בסרטן האנושי באמצעות עכברים. על ידי שינוי גנטי מהפך תאים ראשוניים, אנחנו יכולים ללמוד טוב יותר התפתחות סרטן, התקדמות, טיפול, ואבחון. במחקר זה, השתמשנו inducible Cas9 לשון העכבר תאים אפיתל כדי לאפשר עריכת הגנום באמצעות וירוס הקשורים adeno (AAV) ב מבחנה. באופן ספציפי, על ידי שינוי קראס, p53, ו APC בתאי האפיתל הלשון נורמלי, הצלחנו הראש מורנין סרטן הצוואר (HNC) קו מחוץ לתחום, אשר הוא הטמורגניים בעכברים syngeneic. השיטה המוצגת כאן מתארת בפרוטרוט כיצד ליצור קווי התאים HNC עם שינויים גנומית ספציפיים ומסביר התאמה שלהם לחיזוי התקדמות הגידול בעכברים syngeneic. אנו לדמיין כי זו שיטה מבטיחה יהיה אינפורמטיבי ושימושי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול וטיפול של HNC.
Introduction
HNC הוא ממאירות נפוצה ברחבי העולם1. מידול בראשית של HNC neoplasia נמצא כעת נקודת מפנה מדעית2. בעוד מוטציות גנטיות רבות זוהו hnc2,3,4 (למשל, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, ו RAS) שילובים ספציפיים של שינויים גנותיים נדרש בקונצרט כדי לגרום hnc להישאר ברור.
השימוש הנוכחי בקווי התאים האנושיים HNC עזר באופן משמעותי כדי להבהיר את המנגנונים הקשורים בפתוגנזה וטיפול3. עם זאת, המחקר של קווי התאים האנושיים במערכות murine החיסונית יש המגבלות שלה, כי מערכות אלה אינם מטפלים בתהליך vivo נאופלסטי, התפקיד של מוטציות גנים ספציפיים, ותגובות טיפול במיקרו הסביבה החיסונית. מכאן, הפיתוח והקמתה של קווי תא מורטין עם שינויים גנטיים ספציפיים הם בעלי חשיבות עיקרית ללמוד כיצד גנים שונים תורמים לתהליך הטרנספורמציה ולבדוק טיפולים מבוססי מולקולה הרומן עכברים המוסמכת.
לימודי התפקוד הגנטי במחקרים ביו-רפואיים הושפעו באופן משמעותי מהתקדמות בטכנולוגיות לעריכת דנ א, על ידי החדרת הפסקות כפולות (DSBs), לדוגמה5. טכנולוגיות אלה, כולל שימוש בנוקלאוסים של אצבעות אבץ, שעתוק activator-כמו אפקטור נוקלאוסיס, ומקובצים באשכולות במרווחים של הרגולציה הבין-מפרידים (CRISPR/Cas9), מאפשרים מניפולציה של כל גן התעניינות בלוקוס. מערכות crispr האחרונה/Cas9 מורכב מדריך RNA (grna) המכוון את Cas9 נוקלאז כדי ליצור dsb באתר ספציפי בגנום. מערכת זו צברה הכרה נרחבת בשינוי גנים אנדוגני בתוך כל תא או רקמות היעד, אפילו באופן מסורתי קשה לטפל באורגניזמים5. יש לו יתרונות רבים על מערכות אחרות בשל פשטותו, מהירות, ויעילות.
באונקולוגיה, CRISPR/CAS9 הטכנולוגיה מילא את הצורך לחקות ביעילות תאים סרטניים. כדי להקים מערכת זו ב HNC, אנו מניפולציות קראס אואונגן חזק ושני גנים מדכא הגידול חשוב, APC ו p536. על פי מסד הנתונים של ג ' יני7, שילוב זה נדיר ב hnc. מוטציות RAS (HRAS, NRAS, ו קראס) קיימים רק ~ 7% של כל אוכלוסיית HNC. גידולים אלה נוטים להיות עמידים לטיפול8,9.
משלוח של Cas9 ו gRNA שלה מושגת באמצעות התמרה ויראלית באמצעות AAVs או לנטיאוירוסים. רקומביננטי AAV הוא לעתים קרובות את השיטה המועדפת לאספקת גנים כדי למקד את התאים בשל titer גבוה שלה, התגובה החיסונית מתון, היכולת לשנות מגוון רחב של תאים, ובטיחות כוללת. באמצעות מערכת AAV, שונים מסוימים רקמות תא העכבר נוצרו, וקווי תא חדש עדיין מפותחים10,11,12. עם זאת, מערכת יעילה של עריכת גנומית שיכולה ליצור קו התאים של murine HNC הדגמים שרידים להתפתח. במחקר זה, אנו ביקשו לפתח במערכת מבוססת על מבחנה AAV-Cas9 להפיכת תאי הלשון הראשוניים של מורלין למצב הטומורגניים. זה ייחודי CRISPR/Cas9 פרוטוקול הטרנספורמציה ואת קו הגידול הוקם התא ניתן להשתמש כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של HNC הנגרמת על ידי מגוון של שינויים גנומית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי אוניברסיטת בן גוריון במועצה לטיפול בבעלי חיים בנגב ושימוש. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי IACUC (IL. 80-12-2015 ו-IL. 29-05-2018 (E)). כל ההיבטים של בדיקות בעלי חיים, דיור, ותנאים סביבתיים המשמשים במחקר זה היו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה13.
1. אדנו-הפקת וירוס משויך
- יום 1: תרבית תאים
- זרע 4 x 106 HEK293T תאים לצלחת 14.5 ס מ ב 15 מ ל של DMEM זיכרון. הכינו 10 צלחות לגלגול עם פוליאתילן (1 μg/μL).
- יום 2: העברה של תאים HEK293T באמצעות פיי.
- הסר מדיה והזנה מחדש באמצעות הכלי _ זיכרון חם 1 לפני ההעברה.
- ריאגנטים לחימום והגברת לפני החלקה.
- השתמש 10 μg של הפלמיד של עניין המכיל AAV ITR (AAV pCM109 EFS היצור sg APC ס ג קראס sg P53-קראס HDR), 10 μg של AAV 2/9n capsid באמצע (עם הגן הנציג של AAV2 ואת הגן כובע של AAV9, ו 10 μg של העוזר פלמיד (מסייע פאדדלתא F5) לכל צלחת (ראה טבלת חומרים).
הערה: דור חדש של מסייע פלאבין pAdDeltaF614,15,16 כי ניתן להשתמש גם עבור ייצור aav זמין. - ערבב את הפלמידים ב 1 מ ל של DMEM רגיל לכל צלחת. לאחר מכן להוסיף 90 μL של פוליאתילן (הכולל הפלסטיות: פיי הריכוז = 1:3) לערבב באמצע ומערבולת בקצרה.
- מרכז את ה-DNA הפיי-פלמיד עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הוסף את מיקס התערובת על גבי התאים הHEK293T והעבר את הלוחות לחממה לתרבות התא ב-37 ° c עם 5% CO2 עבור 24 שעות.
- יום 3: שינוי בינוני לאחר החצייה
- הסר את המדיום לחלוטין והוסף 15 מ ל של DMEM טרי.
- יום 5: קצירת הנגיף
- הכינו אמבטיית קרח יבשה/אתנול.
- לאסוף את התאים עם מגרד התא ולהעביר אותם לצינורות 50 mL (2 לוחות לכל 50 mL שפופרת).
- שפופרות ספין ב 800 x g עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- למחוק את הסופרנטאנט מכל הצינורות. הוסף 0.5 mL של מאגר הליזה (150 מ"מ מילימטר, 50 mM Tris-HCl, pH = 8.5) לכל צלחת (כלומר, 5 מ ל 10 צלחות) לצינור הראשון בלבד. השהה את התאים מחדש והעבר את הנפח הכולל לשפופרת הבאה והמשך עד לשפופרת האחרונה.
- העבר את ההשעיה התא לצינור 50 mL טרייה. רוחצים את הצינורות בנפח זהה של מאגר הליזה (0.5 mL לצלחת) תוך שימוש באותה שיטת העברה כמתואר בשלב 1.4.4.
- בנושא ההשעיה התא כדי שלושה סיבובים של ~ 10 דקות להקפיא/הפשרה בין אמבט קרח יבש/אתנול ו-37 אמבט מים ° c. מערבולת לזמן קצר לאחר כל החלקה.
- אם הטיהור מתבצע באותו יום, הגדר את השפה ואת מאגר הלייווציה (ראה טבלה 1 למתכון) ב-RT.
- הוסף 50 יחידות של בנזיל לוחית ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 1.5 h.
הערה: בנזיל משמש כדי לעכל חומצות גרעין שיורית מתאי המפיק המארחים ואת ה-DNA פלמיד הנוכחי ההשעיה התא. - לסובב את הצינורות ב 3,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
- לאסוף את supernatant במזרק באמצעות המחט 18 G פלדה ולדחוף את הפתרון באמצעות מסנן 0.45 יקרומטר לתוך שפופרת 15 mL כדי להשיג את הליפוסט הגס.
- אחסן את הליפוסט הגולמי ב -4 ° c במשך כמה שבועות עד לטיהור או להמשיך בטיהור.
2. טיהור AAV
- . היום ה -5 ואילך
- מניחים את השפה ואת מאגר הלייוציה ב-RT.
- שוטפים עמודי כרומטוגרפיה עם 10 מ ל של מאגר השפה.
- הוסיפו 0.5 mL לצלחת של הפארין-אגקם לטור17 ולאחר מכן הוסיפו את מאגר האקליציה (4x הנפח של הפארין-agarose). ערבב את הפתרונות על ידי היפוך העמודה ולתת את המשקע.
- מאגר המשקל המפוקפק. מהעמודה על ידי כוח הכבידה
הערה: השאר מאגר שיווציה כדי למנוע את התייבשות הצמח. - טען את הליספוסט הגולמי על הטור ואת הדגירה עבור 2 h ב 4 ° c עם עצבנות מתמדת. הביאו את הטור לתנוחה זקופה והניחו לצמח להיות משקעים.
- . לאלט הגולמי של כוח הכבידה
- שטוף את הטור בעזרת מאגר אקליציה (4x הנפח של הפארין-agarose).
- מניחים מסנן חלבון צנטריפוגלי 100 kDa מתחת לטור והווירוס באמצעות מאגר הימנעות (3x הנפח של הפארין-agarose) לתוך המסנן.
הערה: לא יעלה על 15 מ"ל מאגר הימנעות. - צנטריפוגה את המסנן ב-3,000 x g עבור ~ 30 דקות עד שפחות מ-1 mL נשאר במסנן.
- למלא את המסנן עם PBS ו צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור ~ 30 דקות עד פחות מ 1 mL נשאר במסנן. חזור על שלב 2x זה כדי להסיר את כל המלחים.
- לרכז את פתרון וירוס במסנן ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g כדי להגיע באמצעי אחסון קטן ככל האפשר (פחות מ 200 μl).
- מחדירים את פתרון הווירוס עם מחט ומזרק ולדחוף את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר לתוך צינור.
- הפוך את מאגרי החלקיקים המרוכזים לאחסון.
הערה: האליבטים צריכים להיות ~ 20 μL לאחסון לטווח קצר ב -4 ° צ' ו ~ 5 μL לאחסון לטווח ארוך ב-80 ° c. - לקבוע את היעילות של סיכוייו והתמרה ויראלית כפי שמתואר בעבר14,18,19,20.
3. בידוד ותרבות של תאים ראשוניים
- היום הראשון
- המתת חסד של גבר בן 6 שבועות או נשים B6; 129-Gt (רוזה) 26Sortm1 (הקאג-cas9 *,-EGFP) Fezh/J על ידי שיתוף2 חנק או כל פרוטוקול iacuc אחרים שאושרו.
הערה: אלה CRISPR/Cas9 בעכברים יש recombinase ביטוי תלוי של Cas9 endonuclease ו-egfp בבימויו של מקדם הקאג. את הרצף הנמצא במעלה לקס-Stop-לקס (LSL) בגנום של עכברים אלה למנוע את הביטוי של Cas9 ו-EGFP בהעדר recombinase היצורים. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם RNAs מדריך יחיד (sgRNAs) ומקור היצור, הם מאפשרים עריכה של גנים בודדים או מרובים של העכבר vivo או ex vivo14. - מנתחים את הלשון מפני עכברים מורדמים באמצעות מספריים כירורגיים.
- באופן ידני לנתק את רקמת ידי משתמש רקמת הלשון לתוך שברים קטנים מאוד באמצעות אזמל. לאסוף את שברי הרקמה בצינור 15 מ ל המכיל 4.5 מ ל של RPMI רגיל (עם החוצה סרום).
- הוסף את שילוב האנזים המשולש (200 μl) (ראה טבלה 1 למתכון) לשברי הרקמה.
- דגירה את הרקמה-אנזים ערבוב ב 37 ° c עבור 30 דקות ולהקיש על הצינור כל 10 דקות כדי לשפר את הדיסוציאציה אנזימטית של הרקמה.
- להוסיף 5% סרום בפרה העובר (FBS) המכיל HBSS/PBS כדי לערבב את הרקמה-אנזים להפסיק את פעולת האנזים.
- לסנן את השעיית התא לעיל דרך רשת הניילון סטרילי 70 יקרומטר להפריד את התאים מפוזרים שברי רקמות גדול.
- לשטוף את ההשעיה התא מסוננים על ידי צנטריפוגה עבור 300 x g עבור 5 דקות ב HBSS/PBS ב RT.
- השהה מחדש את הגלולה בתווך התרבות (10% FBS ב RPMI/Dמאמ) ולצמוח ב 60 מנות תרבות מילימטר עד הקימו מושבות תאים נפרדות.
- מצרפים של תאים לתרבות שנשמרו על גבי המסנן בצלחת תרבות 60 מ"מ המכילה 3 מ ל של מדיה מלאה (10% FBS ב-RPMI/DMEM) עד שנוצרו מושבות תאים.
- לבחון את התאים העיקריים לנוכחות של זיהום פיברובלסט אחרי שבוע של תרבות. התייחס לתאים העיקריים שפותחו מאגרגטים ומשעיות תא עם 0.25 טריפסין 0.02% EDTA פתרון ב 37 ° c עבור 1 דקות כדי להסיר פיברוהולים.
הערה: בדרך כלל, התרבות הראשית מאגרגטים של תאים יוצרת מושבות נוספות לעומת השעיות בתאים בודדים. התאים ממושבות אלה מספקים יעילות התמרה טובה יותר עם התמרה AAV.
- המתת חסד של גבר בן 6 שבועות או נשים B6; 129-Gt (רוזה) 26Sortm1 (הקאג-cas9 *,-EGFP) Fezh/J על ידי שיתוף2 חנק או כל פרוטוקול iacuc אחרים שאושרו.
4. התמרה חושית של תאים ראשוניים
- היום העשירי
- זרעים 2 x 105 תאים ראשוניים לכל טוב ב 6 לוחות היטב ב 2 מ ל של מדיה מלאה (10% FBS ב RPMI/dmem).
- למחרת, העברת התאים עם 1012 הגנום הנגיפי/mL (1010 התמרה יחידות/ml) ו מודקת את התאים במדיה ויראלי חלקיקים המכילים עבור 48 h ב 37 ° c.
- הסירו את המדיה האנטי-חלקיק הנגיפית והאכילו את תאי ה-AAV עם המדיה המלאה.
הערה: רק תאים שעברו התמרה מבטאים את GFP ומתחילים להתרבות. תאים שלא עברו התמרה לבסוף ימותו בתוך שבועיים. - לאחר 2 שבועות של התרחבות התרבות, זרע את התאים עבור אימות ו בניסויים vivo tuמגניים.
הערה: דנ א גנומית מהתמרה תאים ותאים ראשוניים נורמליים מעכברים Cas9 חולצו לאימות עריכת הגנום ספציפיים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. רצף של ה-DNA שחולצו וניתוח של נתונים רצף (שולחן 2) בוצעו באמצעות הכלאה מבוסס לכידת הדור הבא בקביעת רצף (למשל, msk-השפעה פלטפורמה) כמתואר בעבר21.
5. מאמת את הטרנספורמציה של תאים נורמליים לתאים הטוריגניים באמצעות immunofluorescence ומערב מערבי
- אימונולווקורנציה
- זרע 2 x 105 תאים על 12 מ"מ שמיכות זכוכית ומניחים אותם בחממה לילה.
- תקן את התאים ב 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS (pH = 7.4) והתהליך עבור תיוג מimmunofluorescence.
- מודדת את התאים הקבועים עם הנוגדן העיקרי הראשון ב 1% BSA או 1% סרום ב PBST בחדר מחולל לחות עבור 1 h ב RT או לילה ב 4 ° c. הנוגדנים העיקריים המשמשים הם הארנב מונושבטיים anti-KRT 14, ארנב מונושבטיים אנטי-Cas9 נוגדן, ואת העכבר mAb.
- הסר את פתרון הנוגדן העיקרי מתוך שמיכות ידי שטיפת התאים 3x עבור 5 דקות עם 1x PBS.
- דגירה את התאים עם Cy3 החמור אנטי ארנב IgG ו/או Cy3 עז אנטי עכבר משנית הigg נוגדנים ב 5% BSA ב PBST עבור 1 h ב RT בחושך.
- להסיר את הפתרון נוגדן משני מתוך שמיכות ולשטוף את התאים 3x כפי שמתואר בשלב 5.1.4.
- הר את הכיסויים עם טיפה של בינוני גובר המכיל DAPI (DAPI Fluoromount).
- אחסן בחשכה ב-4 ° צ' עד שהשקופיות ממבחנות באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
- בלוק מערבי
- זרע 1 x 106 תאים השתנה בצלחת תרבות 100 מ"מ ולמקם אותם בחממה לילה.
- לשטוף ולגרד את התאים הופכים לתוך 200 μl קרח קר PBS.
- צנטריפוגה את הצינור המכיל את ההשעיה התא עבור 10 דקות ב 2,000 x g ב 4 ° c כדי לצנפה את התאים.
- מנושף את הסופרנטאנט ולאחר מכן את התאים באמצעות מאגר הליזה (ראו לוח 1) המכיל קוקטיילים מעכבי פוספספטאז ומעכבי פרוטאז למשך 10 דקות ב -4 ° c. צנטריפוגה את lysates עבור 10 דקות ב 10,000 x g ו 4 ° צ' ולאסוף את lysates נקי.
- השתמש בערכת שיטת ברדפורד זמינה מסחרית כדי לקבוע את ריכוז החלבון בעקבות פרוטוקול היצרן. השתמש 4x מאגר לדוגמה (500 mM Tris pH = 6.8, 40% גליצרול, 8% SDS, 20% H2O, 0.02% ברומאופנול כחול) כדי לכוונן את דגימות חלבון ל 0.5 או 1 μg/μl. מרתיחים ב 96 ° c עבור 5 דקות.
הערה: ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 ° צ' או עד לביצוע ניתוח כתמי אבן מערבי. - הפרדה כמויות שוות של סה כ ליפוסט (30 μg) ב-10% נתרן dodecyl סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל (SDS-עמוד). ודא שצבען מגיע לתחתית הג. להעביר את החלבון קרום ניילון על ידי חצי יבש לחסום ב 25 V עבור 30 דקות.
- יוצקים 5% BSA ב טריס-מלוחים באגירה (TBS)-0.1% רצף (TBST) על הקרום כדי לכסות אותו לחלוטין. לחסום את הקרום עבור 1 h ב RT. דגירה הmebrane עם נוגדנים העיקרי (אנטי-היצורים, anti-Cas9, אנטי-gfp, אנטי β catenin, אנטי p53, anti-פוספהו-טיפשה, ו אנטי β אקטין מדולל ב 5% bsa tbst) ב 4 ° c לילה.
- לאחר הדגירה, לשטוף את הקרומים עבור 10 דקות עם 1 x TBST לוודא כי הפתרון מכסה את הקרום לחלוטין. לבצע זה לשטוף את 3x, ולאחר מכן להוסיף חזרת peroxidase (HRP)-מצותת נוגדן משני (מדולל 1:10000 ב 5% BSA TBST) לקרום. . מודטה בשביל 1 h ב-RT
- לאחר הדגירה, לשטוף את הקרומים עבור 10 דקות עם 1 x TBST לוודא כי הפתרון מכסה את הקרום לחלוטין. בצעו את הדימות הכימי (ראו טבלת חומרים) כדי לחשוף את הלהקות ולוכדים תמונות בהתאם.
- אימות הפוטנציאל הטוריגני של תאים שעברו שינוי בעכברים חיסוניים
הערה: בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת בן-גוריון בנגב, שמרו וטופלו על-ידי עכברים. תהנהן. CB17-Prkdc-scid/סי אר אס (נוד. SCID) ו C57BL/6 עכברים שימשו למחקרים vivo. עכברים היו שוכנו באוויר מסוננים ארונות זרימה עם מחזור 12 שעות אור/כהה האכילו מזון מים libitum המודעה.- שימוש 6-8 נקבה בת הנוד הנשי. CB17-Prkdc-scid/סי אר אס (נוד. SCID) ו C57BL/6 עכברים עבור המחקר.
- טריזיסיזציה של התאים הCas9 ל-AAV. הפסיקו את הטריסיזציה באמצעות DMEM ראש בשעה 37 ° צ' ואספו בשפופרת של 50 mL.
- צנטריפוגה את הצינור ב 800 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית במדיום DMEM ללא FBS. לבצע את צנטריפוגה שוב ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב-1x PBS.
הערה: אל תשאיר את התאים ב-1x PBS במשך זמן רב מדי. תמיד לשמור על השעיה התא על הקרח כדי למנוע החוצה התאים. - השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים ולדלל את התאים לריכוז הרצוי (2.5 x 107 תאים/mL) באמצעות 1X PBS. ליצור גידולים באמצעות הזרקה תת עורית של AAV-Cas9 השעיית התא השתנה באגף הימני של כל נוד. CB17-Prkdc-scid/סי אר אס (נוד. SCID) העכבר (2 x 106 תאים/עכבר). כדי ליצור מודל אורתוטרופי בעכברים syngeneic, להזריק 0.5 × 106 תאים ראשוניים או aav-Cas9 התאים הפכו לתוך הלשון של C57BL/6 עכברים המוסמכים החיסונית.
- המתת חסד בעלי חיים 2 שבועות הזרקה על ידי CO2 חנק, ולנתח את הגידולים מן העכברים מורדמים עבור ניתוח אימונוהיסטוכימיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש במערכת AAV לשינוי תאי Cas9 רגילים
איור 1 מספק מפה וקטורית מפורטת של הפלג ' ה-aav המשמש במחקר זה. איור 2 מתווה את העיצוב והעבודה של המערכת המבוססת על Aav-Cas9. כדי לייצר חלקיקים ויראליים, התאים HEK293T היו מזוהמים עם וקטור הטרנסגנטי AAV ו אחרים וקטורי אריזה ויראליות באמצעות שיטת החצייה של פיי. לאחר הטיהור, התאים המכילים וירוס נאספו ולאחר מכן באמצעות תהליך החיטוי הפארין-agarose, החלקיקים הנגיפי היו מטוהרים ומרוכזים (איור 2א). אלה חלקיקים מטוהרים ויראלי שימשו לשינוי מחוץ לגופית של תאים ראשוניים מבודדים מעכברים Cas9 כדי לבדוק את היעילות. במערכת שלנו, את הקלטת הביטוי aav ביטוי הציג באמצעות שילוב הומוולוגי לתוך Cas9 Rosa26 תלויי תבנית המיקוד בתוך תאי העכבר לשאת מיזם הקאג בכל מקום (pcag), מחסנית loxp-Stop-loxp (lsl), גן Cas9 נוקלאז, P2A פפטיד העצמי, ואת גן העיתונאי (egfp) מוקף שתי זרועות הומוולוגי14. פעילות recombinase היצור של התאים המותמרים מגזים את LSL ומשרה Cas9 ו-GFP ביטוי (איור 2ב). פעילות Cas9 נוקלאז מציגה הפסקה כפולה תקוע על אתרי היעד של עניין, בבימויו של grnas, ומסייע בעריכת גנים. מערכת aav בשימוש במחקר זה מסייע באספקת grnas המוקפצים (sgrnas עבור קראס, p53, ו APC) וגם ביטוי אונגניים קראסG12D אלל באמצעות הומולוגיה מכוונת תיקון (HDR) בתאי התמרה.
איור 1: מפה וקטורית של מרכז המחקר הפלסטי של AAV בשימוש זה. מערכת AAV זו יש עמוד השדרה AAV המבטא recombinase היצורים שלושה U6 מונחה sgRNAs מיקוד קראס, p53, ו APC. הוא מכיל גם קראס G12D homology מכוון תיקון (HDR) תורם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עיצוב ועבודה של מערכת AAV-Cas9 בהפיכת תאים נורמליים. (א) המתאר את הייצור והטיהור של חלקיקי aav מ HEK293T לאחר העברה לעברם באמצעות ה-aav והאריזות הפלסטיות. (ב) התמרה ויראלית של תאים ראשוניים עם חלקיקי aav ומנגנון הביטוי התלוי בCas9 ביטוי מאפשר לעריכת CRISPR ואת הטרנספורמציה של תאים ראשוניים לתאים הטוריגניים. וקטור aav יחיד שילוב grnas עבור שלושה גנים שונים עם הסתרה של אלל קראס G12D באמצעות HDR עם הקלטת ביטוי מrecombinase מועברת לתוך התאים התלויים Cas9 העכבר הראשי. היצור recombinase הפעילות בתאי התמרה מוביל לכיוון כריתה של הקלטת LoxP-Stop-LoxP וגורמת Cas9 ו-GFP ביטוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
ואלידציה של מערכת AAV-Cas9 בתוך מבחנה בתאים מבודדים של העכבר העובריים מתחלקים
העכבר העיקרי פיברומריים הפיצוץ (MEF) תאים שימשו באופן בלעדי ללמוד את ההשלכות של אבלציה הגנים בצמיחה הסלולר התפשטות22. כדי לאמת את היעילות של מערכת AAV-Cas9 ב הפיכת תאים נורמליים, אנו התמרה תאים MEF מבודדים מעוברי Cas9 העכבר (E14) עם AAV. תאי mef היו מבודדים כמתואר קודם לכן23,24. MEFs מ 14-יום Cas9 העכבר הישן שימשו כי הם קלים לתרבות ומינוחים בתוך מבחנה. בקצרה, כדי להפוך MEFs באמצעות התמרה AAV, MEFs הראשי בערך 30% המפגש נחשבו מוכנים התמרה. שעה לפני התמרה, התקשורת התרבותית של MEF השתנתה. AAV מטוהרים הופלה על קרח, התקשורת תרבות MEF היה מנושף. ויראלי סופרנט עם סיכוייו שונים מ 106-1014 הגנום הנגיפי/mL התווסף כל טוב ולבן לילה ב 37 ° c. Supernatant ויראלי הוסר לאחר 48 h, הוחלף 2 מ ל של מדיום תרבות MEF, ולאחר מכן הודבטים ב 37 ° c עד ביטוי GFP, כ 5 ימים לאחר התמרה. הביטוי GFP-ביטוי. היה מתורבת ומאומת שימו לב כי עבור וקטור זה מצאנו כי 1012 הגנום הנגיפי/ml (שווה ערך ל 1010 התמרה יחידות/ml) יכול ביעילות להפוך את תאי mef הראשי כדי Tuמוגניים mef (איור 3א). התאים המתתמרים הביעו את היצור, Cas9 ו-GFP (איור 3ב, ג). כדי לגשת אל הפוטנציאל הטוטליגני של התאים AAV שהפך, 0.5 x 106 תאים (ראשי/aav-התמרה ED mef) הוזרקו לתוך הלשון, שפתיים, ו תת-עורי ב הנהון-scid עכברים. תאים שהפכו להיות גידולים בעכברים אלה, לעומת MEF העיקרי, אשר לא ליצור גידולים (איור 3D-F).
איור 3: אימות ובינוי מחוץ למערכת של תאי MEF העיקרי באמצעות מערכת AAV-Cas9. (א) מתאר את הטרנספורמציה החוץ-גופית של פיברותקיעות מעוברים שנאספו מעכברים Cas9 באמצעות חלקיקי aav. (ב) מייצג את התמונה החיסונית של התאים הראשוניים של mef ו-aav מראה את הביטוי של gfp, יצור, ו Cas9. DAPI שימש כדי להכתים את הגרעין. (ג) הכתמים המערביים המציגים את היצור, CAS9, gfp, ו-β-actin בפיברותקיעות רגילה ומעובריים שנערכו באופן גנטי. (ד) דמות מייצגת של גידול לשון שהתפתח בעכבר הנהון-scid לאחר הזרקת אותו עם תאים שהפכו שינוי פיברוהפיצוץ. (ה) דמות מייצגת של גידול שפתיים שנוצר בעכבר הנהון-scid לאחר הזרקת אותו עם שינוי תאים פיברוהפיצוץ. (F) דמות מייצגת של גידול מאגף שהתפתח בעכבר הנהון-scid לאחר הזרקת אותו עם תאים שהפכו שינוי פיברוהפיצוץ. . החיצים מצביעים על גידול אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בדור מחוץ למערכת האפיתל של הלשון התאית מורמורגניים לשון של התאים האפיתל הלשון הראשי באמצעות מערכת AAV-Cas9
לאחר אימות תכונת שינוי הצורה של מערכת AAV באמצעות התאים MEF, בודדנו תאים אפיתל הלשון הראשי מ Cas9 עכברים ומתורבתים אותם בתוך מבחנה. תאי הלשון העיקריים היו מקוהים עם חלקיקי AAV ויראלי (1010 cfu/mL), ואחרי שבוע תאים החלו לבטא gfp. הטרנספורמציה הטוריגנית של תאי האפיתל הלשון העיקרי (איור 4א) אושרה באמצעות immunofluorescence ובלקטים מערביים (איור 4ב, ג). התאים שהפכו מוצגים משופר KRT 14, E-קדהרין, ו GFP ביטוי (איור 4ב). הטרנספורמציה הטומוגנית של תאים האפיתל הלשון העיקרי אושרה על ידי הביטוי של GFP (כלומר, ביטוי תלוי היצורים של Cas9 ו-GFP) (איור 4ג). ההבעה של KRT14 והאי-קדהרין מאשרת. את מאפייני תאי האפיתל שלהם אימות חלבון אישר β-catenin משופרת, פוספהו-טיפשה, ו p53 ביטוי מופחת (איור 4ג), המציין את המטה האפקטיבי של APC ו p53 והתאגדות של מוטציה קראס לתוך התאים הלשון, ובכך להפוך אותם tuמהגניים. ניתוח גנומי על-ידי רצף עמוק של ה-DNA מבודדים מן התאים שעברו שינוי אישר את העריכה האפקטיבית של הגן ואת משמרת מסגרת של TP53 ו APC הגנים על ידי מערכת AAV-Cas9 (שולחן 2). המאפיין הטוטליגני של קו ה-AAV-שעבר שינוי הלשון הוערך עוד יותר על ידי הזרקת אותו לתוך לשונו של סוג פראי מוסמך C57BL/6 עכברים. תאי הלשון שעברו טרנספורמציה, המיועדים לתאי אפיתל קראס המוטציות של הלשון (קראס Mut EpT), גידולים בטופס ביעילות ב C57BL/6 עכברים (איור 4ד). קראס Mut EpT גידולים הוערכו על ידי אוראלי הפתולוג מקסאילין על ידי המטאוקסיולין שגרתית ו אאוזין (H & E) כתמים ועל ידי אימונוהיסטוכימיה. הגידולים הציגו מורפולוגיה של תא של ציר עם האב גרעינית בולטים: פלאומורפיזם, hyperchromatism, גרעיני ענק, מספר נוקלאופולי, ושיעור mitotic גבוה עם דמויות טיפוסיות mitotic. הפלישה הפריסקולרית ו-אנגיו, הפלישה צוינו גם. תכונות מורפולוגיות אלה התלוו בצורה מוגבלת מאוד לדלקת שאינה קיימת הקשורה לגידול. אימונוהיסטוכימית, התאים הנאופלסטיים היו cytoplasmically חיוביים עבור E-קדהרין ו-KRT 14, שני הסמנים של רקמת האפיתל. KRT 14 הוא אופייני האפיתל הקשקש, תמיכה מקור קשקש של תאים סרטניים ובכך את האבחנה של קרצינומה של תאים קשקשיים (איור 4E). מכאן, גישה זו מספקת מתודולוגיה רב-תכליתית להפיכת תאים ראשוניים בתוך מבחנה עם שינוי גנטי הרצוי. בנוסף, מתודולוגיה זו מקלה על השימוש בקווי תאים מפותחים אלה בvivo בעכברים תחביאריים להבנה טובה יותר של neoplasia בסביבה מיקרוסביבתית של גידול אמיתי.
איור 4: בשינוי מחוץ למבחנה של תאים האפיתל הלשון העיקרי באמצעות מערכת AAV-Cas9. (א) ייצוג סכימטי של טרנספורמציה מחוץ למבחנה של תאים אפיתל נורמלי שהתקבלו מן הלשון של Cas9 עכברים. (ב) מייצג את הדימוי של תאי אפיתל הלשון של aav, המציג את הביטוי של KRT14, E-קדהרין ו-gfp. (ג) אבן חשופה מערבית המציגה Cas9, β-catenin ופוספהו-טיפשה upregulation ברמת חלבון p53, מראה את תאי האפיתל שנערכו בצורה גנטית. (ד) דמות ייצוגית של גידול שפיתח בלשון העכברים המוסמכים לאחר הזרקת אותם בתאי אפיתל הלשון השתנה (קראס Mut ept). (ה) תמונות מייצגות של מקטעי רקמת הגידול עבור H & E, E-קדהרין, ו krt 14 צביעת בהגדלה 20x ו-40x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מאגר פירוק תאים לקציר נגיפי | אמצעי אחסון |
| 150 ממ י | 876.6 mg |
| 50 mM טריס-HCl | 605.7 mg |
| השתמש HCl כדי להתאים את ה-pH 8.5 | |
| מי כיתה מולקולרית | הפוך עד 100 mL |
| מאגר שיווציה | |
| 1 מ"ממג2 | 9.52 מ ג |
| 2.5 ממ י | 18.64 mg |
| מערבבים את כל ב-PBS 1X ולהתאים את ה-pH ל 7.2 | הפוך עד 100 mL |
| מאגר הימנעות | |
| 0.5 M הנאל | 2.92 g |
| מערבבים את כל ב-PBS 1X ולהתאים את ה-pH ל 7.2 | הפוך עד 100 mL |
| 10X משולשת אנזים מלאי פתרון: | |
| קולגנאז | 1 g מיקוד סופי [10 מ"ג/ml] |
| היאלוורונידאז | 100 מ"ג [1 מ"ג/ml] |
| מיכל שנקר | 20,000 יחידות מיקוד סופי [200 מ"ג/ml] |
| 1X PBS | הפוך עד 100 mL |
| תערובת פלסמיד (עבור צלחת אחת 14.5 ס מ) | |
| PCM109-AAV לאחר מעשה שאין לדון בקראס | 10μg |
| 2/9 AAV הקפיסיד וקטור | 10μg |
| עוזר pAD דלתא F5 | 10μg |
| פיי (1μg/μl מלאי) | 90 μl |
| מיכל הזיכרון | 1 מ ל |
טבלה 1: מתכונים של מאגרים המשמשים במחקר זה.
שולחן 2: ניתוח הגנום נתונים של תאים EpT קראס Mut. אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר שיטות שימשו בעבר כדי לשנות את התאים הראשוניים בתרבות עם דרגות משתנה של הצלחה25,26,27,28. רוב השיטות האלה להשתמש העכבר פיברוההדף תאים עבור שינוי14,17,18,19 או להשתמש קרצינוגנים כגון 4-ניטרוגליצרין quin, 1-תחמוצת (4-nqo)21,22 לפיתוח מודלים קו תא מוריין. השימוש במודלים של עכבר הסתרה וטרנסגניים גם השתפר מאוד את הבנתנו את המסלולים המולקולריים השונים השולטים בפיתוח ובבידול של HNC. שימוש בקווי האפיתל האוראלי מוריין עם דפוס גנטי ייחודי בהחלט משלימים את המחקרים האלה, ושלהם ביוכימית הבאים יתרום לקראת הטיפול והאבחנה של HNC. עם זאת, רק דיווחים מעטים תיארו את הקמתה של תאים אפיתל העכבר אוראלי28,29,30,31,32,33 וקווי תאים אלה אינם בשימוש נרחב.
המגבלה העיקרית של קווי האפיתל האוראלי האלה מורטין הוא שהם לא מאופיינים בהרחבה ברמה המולקולרית ונמצאו לבטא דפוסי גנים נדירים. כך, ההבנה המולקולרית המוגבלת של מודלים אלה קו תא מורטין והיעדר מתודולוגיה יעילה מבקשת מאתנו לרתום את הפוטנציאל הייחודי של טכנולוגיית עריכת הגנום של AAV-CRISPR ב Cas9 טוק-בעכברים להקמת קווי תא מורלין עם שינויים גנים ספציפיים. במחקר זה, אנו הציגו ופיתח במערכת מחוץ לגוף AAV-Cas9 להפיכת תאים murine העיקרי לתוך המדינה tumorigenic כדי לאשר את השינויים הגנטיים כי להצמיח תאים קרצינומה. הקמנו בהצלחה את מורטין תאים אפיתל הלשון עם מוטציות גנים ספציפיים עם יעילות גבוהה באמצעות AAV-תיווך CRISPR המושרה הנגרמת גנטית העריכה על ידי כמה שילובים sgRNA.
מתודולוגיה זו מציעה גישה ניסיונית חדשה להבנת טוב יותר התא-אוטונומית האטיולוגיה של HNC. החל בתאי אפיתל הלשון העיקרי של murine, היינו מסוגלים לשנות תאים כאלה כדי tumorigenicity על ידי מחיקת קבוצה מוגבלת של גנים והיכרות יחיד קראס מוטציה. באמצעות מתודולוגיה זו, כעת ניתן לחקור אם גנים אחרים ידוע להיות מעורב קרצינומות אחרים יכולים לייצר ממאירות כי דומה יותר HNC. המאפיינים מורפולוגית של גידולים מ קראס Mut EpT מאושר קרצינומה של תאים. ניתוח histopathological של גידולים קראס Mut EpT בעכברים syngeneic קשורה ותומכת של התנהגות אגרסיבית ביולוגית של הראש והצוואר קרצינומה. כך, ייתכן שניתן לקשר את גנוסוגים של תאים סרטניים לתכונות קליניות והיפוולוגיים ספציפיים של גידולים.
היתרונות העיקריים של מתודולוגיה זו הם היכולת לפתח קווי התא מתאים ראשוניים מכל איבר באמצעות מוטציות גן ספציפיות והשימוש AAV-Cas9, מה שהופך את המערכת חזק יותר ויציב. מערכת אנדודוגני Cas9 מאפשרת לנצל את החיקויים האחרים של גנים. החיסרון העיקרי של המתודולוגיה הנוכחית הוא הזמן הנדרש כדי לבודד ולבסס את התרבות העיקרית, כמו גם את סיכוייו גבוה של חלקיקים ויראלי הדרושים כדי לשנות את התאים העיקריים. עם זאת, ניתן להתגבר על זה באמצעות סטנדרטיזציה של תהליך הבידוד עבור כל סוג תא. הבעיה של דרישה סיכוייו גבוהה ויראלי גבוה עבור התמרה יעילה ניתן להקל על ידי שימוש בדור האחרון של capsid ומסייע פלמידים עבור אריזה נגיפית ותהליך טיהור טוב יותר.
בעתיד, מערכת AAV טובה יותר ויעילה יותר יכולה להיות מעוצבת ומvivo כדי להפוך איברים ספציפיים מודל מהונדסים גנטית הגידול. לסיכום, הקמת קווי התאים של murine על ידי גישה זו תשמש ערך בכלי התרבותי של מבחנה מבוססת על התרבות כדי לבדוק השערות מספר בהקשר של אונקולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
טרשת נפוצה היא על הוועד המייעצת של המכון הביומדע, ומנליני ריצרצ'ה קיבל כספים מחקר של פומה ביוטכנולוגיה, Daiichi-Sankio Targimmune, אימונומתודולוגיה, ו מנארני Ricerche. טרשת נפוצה היא גם מייסדת משותפת של Medendi מסעות רפואיות, ו ב 2 השנים האחרונות, קיבל את התואר אריה מ Menarini Ricerche ו-ADC פרמה. לכל הסופרים האחרים. אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מבקשים להודות לד ר דניאל גידלר על שסיפק לנו את הפלביניים של הדלתא 5. עבודה זו ממומנת ע י הקרן הישראלית למדע, 700/16) (ME), הקרן הלאומית למדעי המדינה-ישראל (BSF, 2017323) (לי ו-MS), האגודה הישראלית לסרטן (ICA, 20170024) (לי), הקרן הישראלית לחקר הסרטן (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME), והקרן הדאגה (#7895) (לי). מלגת מלגות: מלגת אלון בשבילי ובאוניברסיטת בן גוריון במלגות ל-SJ ו-MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
