Summary
Per la comprensione della neoplasia è necessario lo sviluppo di modelli murini con geni specifici mutati nei pazienti affetti da cancro alla testa e al collo. Qui, presentiamo un protocollo per la trasformazione in vitro delle cellule primarie della lingua murina utilizzando un sistema adeno-associato al virus-Cas9 per generare linee cellulari MURine HNC con specifiche alterazioni genomiche.
Abstract
L'uso di cellule epiteliali normali primarie consente di indurre riproducibilmente alterazioni genomiche necessarie per la trasformazione cellulare introducendo mutazioni specifiche negli oncogeni e nei geni soppressori tumorali, utilizzando interspazii normativi raggruppati tecnologia di editing del genoma a breve ripetizione palindromica (CRISPR) nei topi. Questa tecnologia ci permette di imitare con precisione i cambiamenti genetici che si verificano nei tumori umani usando i topi. Trasformando geneticamente le cellule primarie del murino, possiamo studiare meglio lo sviluppo, la progressione, il trattamento e la diagnosi del cancro. In questo studio, abbiamo usato cellule epiteliali della lingua di topo Cas9 inducibili in Cre-inducibili per consentire l'editing del genoma utilizzando il virus adeno-associato (AAV) in vitro. In particolare, alterando KRAS, p53 e APC nelle normali cellule epiteliali della lingua, abbiamo generato una linea cellulare di cancro della testa e del collo murino (HNC) in vitro, che è cancerogena nei topi sinogene. Il metodo qui presentato descrive in dettaglio come generare linee cellulari HNC con specifiche alterazioni genomiche e spiega la loro idoneità per prevedere la progressione del tumore nei topi sinosgenici. Abbiamo immaginato che questo promettente metodo sarà informativo e utile per studiare la biologia del tumore e la terapia di HNC.
Introduction
HNC è una malignità comune in tutto il mondo1. La modellazione della genesi della neoplasia HNC è attualmente a un punto di svolta scientifica2. Mentre molte mutazioni genetiche sono state identificate nell'HNC2,3,4 (ad esempio, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 e RAS) le combinazioni specifiche di alterazioni genomiche necessarie in concerto per indurre HNC rimangono poco chiare.
L'attuale uso di linee cellulari umane di HNC ha contribuito in modo significativo a chiarire i meccanismi associati alla patogenesi e al trattamento3. Tuttavia, lo studio delle linee cellulari umane nei sistemi murini immunocompromessi ha i suoi limiti, perché questi sistemi non affrontano il processo neoplastico in vivo, il ruolo di specifiche mutazioni genetiche e le risposte al trattamento in un microambiente immunitario. Di conseguenza, lo sviluppo e la creazione di linee cellulari murine con specifiche alterazioni genetiche sono di primaria importanza per studiare come diversi geni contribuiscono al processo di trasformazione e per testare nuove terapie basate su molecole in topi immunocompetenti.
Gli studi sulle funzioni geniche nella ricerca biomedica sono stati significativamente influenzati dai progressi nelle tecnologie di editing del DNA, introducendo interruzioni a doppio filamento (DSB), per esempio5. Queste tecnologie, tra cui l'uso di nucleasi per dita di zinco, nucleasi effettore simili all'attivatore di trascrizione e brevi ripetizioni palindromiche regolatorie raggruppate (CRISPR/Cas9), consentono la manipolazione di qualsiasi gene di interesse nel suo locus. Gli ultimi sistemi CRISPR/Cas9 sono costituiti da una guida RNA (gRNA) che dirige la nucleacanda Cas9 per generare un DSB in un sito specifico del genoma. Questo sistema ha ottenuto un ampio riconoscimento nella modifica dei geni endogeni in qualsiasi cellula o tessuto bersaglio, anche negli organismi più tradizionalmente difficili da trattare5. Ha molteplici vantaggi rispetto ad altri sistemi grazie alla sua semplicità, velocità ed efficienza.
In oncologia, la tecnologia CRISPR/CAS9 ha soddisfatto la necessità di imitare efficacemente le cellule tumorali. Per stabilire questo sistema in HNC, abbiamo manipolato il potente oncogene KRAS e due importanti geni soppressori tumorali, APC e p536. Secondo il database GENIE7, questa combinazione è rara in HNC. Le mutazioni RAS (HRAS, NRAS e KRAS) sono presenti solo nel 7% di tutte le popolazioni di HNC. Questi tumori tendono ad essere resistenti alla terapia8,9.
La consegna di Cas9 e del suo gRNA si ottiene attraverso la trasduzione virale utilizzando AAV o lentivirus. L'AAV ricombinante è spesso il metodo preferito per fornire geni alle cellule bersaglio a causa del suo alto titro, della risposta immunitaria lieve, della capacità di trasdurli di un'ampia gamma di cellule e della sicurezza generale. Utilizzando un sistema AAV, sono state generate varie linee cellulari del topo specifiche del tessuto e nuove linee cellulari sono ancora in fase di sviluppo10,11,12. Tuttavia, rimane da sviluppare un efficiente sistema di editing genomico in grado di generare murini modelli di linee cellulari HNC. In questo studio, abbiamo cercato di sviluppare un sistema in vitro basato su AAV-Cas9 per trasformare le cellule primarie della lingua murina in uno stato tumorale. Questo protocollo unico di trasformazione CRISPR/Cas9 e la linea cellulare tumorale stabilita possono essere utilizzati per comprendere meglio la biologia dell'HNC indotta da una diversità di alterazioni genomiche.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dall'Università Ben Gurion del Negev Animal Care and Use Committee. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'IACUC (IL.80-12-2015 e DAL.29-05-2018(E)). Tutti gli aspetti della sperimentazione animale, dell'alloggio e delle condizioni ambientali utilizzate in questo studio erano conformi alla Guida per la cura el'usodegli animali da laboratorio 13 .
1. Produzione di virus associati ad Adeno
- Giorno 1: Coltura cellulare
- Seme 4 x 106 celle HEK293T per piastra 14,5 cm in 15 mL di DMEM. Preparare 10 piastre per la trasfezione con polietilenimine (PEI) (1 g/l).
- Giorno 2: Trasfezione di cellule HEK293T con PEI
- Rimuovere il supporto e rialimentarlo con DMEM 1 h caldo prima della trasfezione.
- Reagenti di trasfezione preriscaldata e DMEM.
- Utilizzare 10 g di plasmide di interesse contenente AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg P53- KRAS HDR), 10 g del plasmide a fladij AAV 2/9n (con il gene rep di AAV2 e il gene cap di AAV9, e 10 g del plasmide dell'helper (pAdDelta F5 helper) per piastra (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: è disponibile una nuova generazione di plasmide di supporto - pAdDeltaF614,15,16 che possono essere utilizzati anche per la produzione AAV. - Mescolare i plasmidi in 1 mL di DMEM semplice per piastra. Aggiungete per breve tempo 90 l di polietilenimina (plasmide totale: concentrazione di PEI - 1:3) al mix e al vortice di plasmide.
- Incubare il mix di DNA PEI-plasmid per 20 min a temperatura ambiente (RT).
- Aggiungere il mix dropwise sopra le cellule HEK293T e trasferire le piastre all'incubatore di coltura cellulare a 37 s C con 5% DI CO2 per 24 h.
- Giorno 3: Cambio medio dopo la trasfezione
- Rimuovere completamente il mezzo e aggiungere 15 mL di DMEM fresco.
- Giorno 5: Raccogliere il virus
- Preparare un bagno di ghiaccio /etanolo secco.
- Raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e trasferirle in tubi da 50 mL (2 piastre per tubo da 50 mL).
- Tubo di rotazione a 800 x g per 15 min a temperatura ambiente.
- Scartare il supernatante da tutti i tubi. Aggiungere 0,5 mL del buffer di lisi (150 mM NaCl, 50 mM MM Tris-HCl, pH - 8,5) per piastra (cioè 5 mL per 10 piastre) solo al primo tubo. Risospendere le cellule e trasferire il volume totale al tubo successivo e continuare fino all'ultimo tubo.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo fresco da 50 mL. Lavare i tubi con lo stesso volume di tampone di lisi (0,5 mL per piastra) utilizzando lo stesso metodo di trasferimento descritto al punto 1.4.4.
- Sottoporre la sospensione cellulare a tre cicli di congelamento/scongelamento di 10 min tra un bagno di ghiaccio secco/etanolo e un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi. Vortice brevemente dopo ogni scongelamento.
- Se la purificazione viene effettuata lo stesso giorno, impostare il buffer di equilibratzione ed eluizione (cfr. tabella 1 per la ricetta) su RT.
- Aggiungete 50 unità di benzonasi per piastra e incubate a 37 gradi centigradi per 1,5 h.
NOTA: Il benzonasi viene utilizzato per digerire gli acidi nucleici residui dalle cellule del produttore ospite e il DNA plasmide presente nella sospensione cellulare. - Girare i tubi a 3.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
- Raccogliere il supernatante in una siringa utilizzando un ago di acciaio 18 G e spingere la soluzione attraverso un filtro 0,45 m in un tubo da 15 mL per ottenere il lisato grezzo.
- Conservare il lisato grezzo a 4 gradi centigradi per alcune settimane fino alla purificazione o alla provificazione.
2. Purificazione AAV
- Giorno 5 o successivo
- Posizionare l'equilibratione e il tampone di eluizione in RT.
- Lavare le colonne di cromatografia con 10 mL del buffer di equilibratione.
- Aggiungere 0,5 mL per piastra di eparina-agarose alla colonna17 e quindi aggiungere il buffer di equilibrio (4 volte il volume dell'eparina-agarose). Mescolare le soluzioni invertendo la colonna e lasciare che il sedimento agarose.
- Eluso il buffer di equilibratione dalla colonna per gravità.
NOTA: Lasciare un po 'di tampone di equilibration per evitare che l'agarose si secchi. - Caricare il lisato grezzo sulla colonna e incubare per 2 h a 4 gradi centigradi con agitazione costante. Portare la colonna in posizione eretta e lasciare che l'agarose si sedimenti.
- Elute il lisato grezzo per gravità.
- Lavare la colonna con cuscinetto di equilibratore (4 volte il volume dell'eparina-agarose).
- Posizionare un filtro proteico centrifuga di 100 kDafugal sotto la colonna ed eluire il virus utilizzando un tampone di eluizione (3 volte il volume dell'eparina-agarose) nel filtro.
NOTA: il buffer di eluizione non deve superare 15 mL. - Centrifugare il filtro a 3.000 x g per 30 min fino a quando non viene lasciato meno di 1 mL nel filtro.
- Riempire il filtro con PBS e centrifugare a 3.000 x g per 30 min fino a quando non viene lasciato meno di 1 mL nel filtro. Ripetere questo passaggio 2x per rimuovere tutti i sali.
- Concentrare la soluzione del virus nel filtro per centrifugazione a 3.000 x g per arrivare ad un volume il più piccolo possibile (meno di 200 l).
- Aspirare la soluzione antivirus con ago e siringa e spingere la soluzione attraverso un filtro di 0,22 m in un tubo.
- Fare aliquote di particelle virali concentrate per lo stoccaggio.
NOTA: Le aliquote devono essere di 20 gradi per l'immagazzinamento a breve termine a 4 gradi centigradi e di 5 gradi per lo stoccaggio a lungo termine a -80 gradi centigradi. - Determinare il titra virale e l'efficienza della trasduzione virale come descritto in precedenza14,18,19,20.
3. Isolamento e coltura delle cellule primarie
- Giorno 1
- Eutanasia di un maschio o femmina di 6 settimane B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-cas9, -EGFP)Fezh/J da CO2 asfissia o qualsiasi altro protocollo approvato IACUC.
NOTA: questi topi knockin CRISPR/Cas9 hanno l'espressione dipendente dalla Cre ricombinante di cas9 endonuclease e EGFP diretta da un promotore CAG. La sequenza upstream Lox-Stop-Lox (LSL) presente nel genoma di questi topi impedisce l'espressione di Cas9 ed EGFP in assenza di Cre ricombinasi. Se utilizzati in combinazione con RNA a guida singola (sgRNA) e una fonte Cre, consentono l'editing di singoli o multipli geni di topo in vivo o ex vivo14. - Dissezionare la lingua dai topi eutanasia utilizzando forbici chirurgiche.
- Dissociare manualmente il tessuto maciacquando il tessuto della lingua in frammenti molto piccoli utilizzando un bisturi. Raccogliere i frammenti di tessuto in un tubo da 15 mL contenente 4,5 ml di minimo indice (con siero esterno).
- Aggiungere il mix di triplo enzima (200 ol) (vedi tabella 1 per la ricetta) ai frammenti di tessuto.
- Incubare la miscela tessuto-enzima a 37 gradi centigradi per 30 min e toccare il tubo ogni 10 min per migliorare la dissociazione enzimatica del tessuto.
- Aggiungere il 5% di siero bovino fetale (FBS) contenente HBSS/PBS alla miscela tessuto-enzima per arrestare l'azione enzimatica.
- Filtrare la sospensione cellulare di cui sopra attraverso una rete sterile di nylon di 70 m per separare le cellule disperse e frammenti di tessuto più grandi.
- Lavare la sospensione filtrata delle cellule per centrifugazione per 300 x g per 5 min in HBSS/PBS a RT.
- Risospendere il pellet nel mezzo di coltura (10% FBS in RPMI/DMEM) e crescere in piatti di coltura 60 mm fino a formare colonie cellulari distinte.
- Aggregati di cellule di coltura mantenuti sopra il filtro in un piatto di coltura di 60 mm contenente 3 mL di supporti completi (10% FBS in RPMI/DMEM) fino a quando non si formano colonie cellulari.
- Microscopicamente esaminare le cellule primarie per la presenza di contaminazione fibroblasta dopo 1 settimana di coltura. Trattare le cellule primarie sviluppate da aggregati e sospensioni cellulari con 0,25 trypsin 0.02% soluzione EDTA a 37 s per 1 min per rimuovere i fibroblasti.
NOTA: Di solito la coltura primaria degli aggregati cellulari produce più colonie rispetto alle sospensioni a cella singola. Le cellule di queste colonie forniscono una migliore efficienza di trasduzione con la trasduzione AAV.
- Eutanasia di un maschio o femmina di 6 settimane B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-cas9, -EGFP)Fezh/J da CO2 asfissia o qualsiasi altro protocollo approvato IACUC.
4. Trasduzione AAV delle cellule primarie
- Giorno 10
- Seme 2 x 105 cellule primarie per pozzo in 6 piastre ben in 2 mL di supporto completo (10% FBS in RPMI / DMEM).
- Il giorno successivo, trasduci le cellule con 1012 genome/mL virale (1010 unità trasduttrici/mL) e incuba le cellule nei supporti contenenti particelle virali per 48 h a 37 .
- Rimuovere il supporto contenente particelle virali e nutrire le cellule trasdotte da AAV con supporti completi.
NOTA: Solo le cellule che hanno subito la trasduzione esprimeranno GFP e inizieranno a proliferare. Le cellule che non hanno subito la trasduzione alla fine moriranno entro 2 settimane. - Dopo 2 settimane di espansione della coltura, semina le cellule per la convalida e gli esperimenti in vivo tumorigenici.
NOTA: Il DNA genomico proveniente dalle cellule trasdotte da AAV e dalle normali cellule primarie dei topi Cas9 è stato estratto per la convalida dell'editing del genoma specifico utilizzando protocolli standard. Il sequenziamento del DNA estratto e l'analisi dei dati sequenziati (Tabella 2) sono stati eseguiti utilizzando un saggio di sequenziamento basato sull'acquisizione di ibridazione (ad esempio, piattaforma MSK-IMPACT) come descritto in precedenza21.
5. Convalidare la trasformazione delle cellule normali in cellule tumorigene utilizzando l'immunofluorescenza e il gonfiore occidentale
- Immunofluorescenza
- Seme 2 x 105 cellule su 12 mm vetro coprelabbra e metterli in un'incubatrice durante la notte.
- Fissare le cellule in 4% paraformaldeide in PBS (pH 7.4) e processo per l'etichettatura immunofluorescenza.
- Incubare le cellule fisse con il primo anticorpo primario nell'1% di BSA o nell'1% del siero in PBST in una camera umidificata per 1 h a RT o durante la notte a 4 gradi centigradi. Gli anticorpi primari utilizzati sono il coniglio monoclonale anti-KRT 14, anticorpo monoclonale anti-E-cadherin coniglio e Cas9 topo mAb.
- Rimuovere la soluzione anticorpale primaria dai copricoperture lavando le cellule 3x per 5 min con 1x PBS.
- Incubare le cellule con anticorpi secondari Cy3 asini anti-coniglio IgG e/o Cy3 capra anti-topo IgG nel 5% BSA in PBST per 1 h a RT al buio.
- Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria dai copricoproee e lavare le cellule 3x come descritto nel passaggio 5.1.4.
- Montare i copricopertine con una goccia di supporto di montaggio contenente DAPI (DAPI Fluoromount).
- Conservare al buio a 4 gradi centigradi fino a quando i vetrini non vengono immagine mediante microscopia a fluorescenza.
- Gonfiore occidentale
- Seme 1 x 106 cellule trasformate in un piatto di coltura 100 mm e metterle in un'incubatrice durante la notte.
- Lavare e raschiare le cellule trasformate in PBS freddo di ghiaccio da 200.
- Centrifugare il tubo contenente la sospensione cellulare per 10 min a 2.000 x g a 4 gradi centigradi per pelletare le cellule.
- Aspirare il supernatante e lividare le cellule utilizzando tampone di lisi (vedi tabella 1) contenente cocktail inibitori di fosforo e un inibitore della proteasi per 10 min a 4 gradi centigradi. Centrifugare i lisati per 10 min a 10.000 x g e 4 gradi centigradi e raccogliere le lismi cancellate.
- Utilizzare un kit di analisi Bradford disponibile in commercio per determinare la concentrazione di proteine secondo il protocollo del produttore. Utilizzare il buffer del campione 4x (500 mMM Tris pH : 6,8, 40% glicerolo, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% di bromofenolo blu) per regolare i campioni di proteine a 0,5 o 1 g/ .
NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 gradi centigradi o fino a quando non viene eseguita un'analisi della macchia occidentale. - Separare la stessa quantità di lisato totale (30 g) per 10% di sodio dodecyl solfato-poliacrite gel elettroforesi (SDS-PAGE). Assicurarsi che il colorante raggiunga il fondo del gel. Trasferire la proteina nella membrana di nylon svasando a 25 V per 30 min.
- Versare il 5% di BSA in salina (TBS) -0,1% Tween (TBST) sulla membrana per coprirlo completamente. Bloccare la membrana per 1 h a RT. Incubare il mebrane con anticorpi primari (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, anti-catenina, anti-phospho-ERK, e atto anti-z diluito nel 5% BSA TBST) a 4 gradi durante la notte.
- Dopo l'incubazione, lavare le membrane per 10 min con 1x TBST assicurandosi che la soluzione copra completamente la membrana. Eseguire questo lavaggio 3x, quindi aggiungere anticorpo secondario coniugato perossidasi (HRP) di rafano (diluito 1:10,000 nel 5% BSA TBST) alla membrana. Incubare per 1 h a RT.
- Dopo l'incubazione, lavare le membrane per 10 min con 1x TBST assicurandosi che la soluzione copra completamente la membrana. Eseguire la chemiluminescenza (vedere Tabella dei materiali) per esporre le bande e acquisire le immagini di conseguenza.
- Convalidare il potenziale cancerogeno delle cellule trasformate in topi immunocompetenti
NOTA: I topi sono stati mantenuti e trattati secondo le linee guida istituzionali dell'Università Ben-Gurion del Negev. Cenno. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) e c57BL/6 topi sono stati utilizzati per gli studi in vivo. I topi erano alloggiati in armadi a flusso laminare filtrati ad aria con un ciclo di 12 ore luce / buio e sono stati alimentati con cibo e acqua ad libitum.- Utilizzare 6-8 settimane-vecchio NOD femminile. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) e Topi C57BL/6 per lo studio.
- Prova a fare clic su apposta le celle trasformate AAV-Cas9. Interrompere la prova utilizzando DMEM preriscaldato a 37 gradi centigradi e raccogliere in un tubo da 50 mL.
- Centrifugare il tubo a 800 x g per 10 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare nel mezzo DMEM senza FBS. Eseguire nuovamente la centrifugazione e risospendere il pellet cellulare in 1x PBS.
NOTA: non mantenere le celle in 1x PBS per troppo tempo. Mantenere sempre la sospensione cellulare sul ghiaccio per evitare l'agglomeramento delle cellule. - Utilizzare un contatore cellulare automatico per contare le cellule e diluire le cellule alla concentrazione desiderata (2,5 x 107 celle/mL) utilizzando 1x PBS. Generare tumori attraverso un'iniezione sottocutanea della sospensione cellulare trasformata AAV-Cas9 nel fianco destro di ogni NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) mouse (2 x 106 celle/topo). Per generare un modello ortotropico nei topi sinogene, iniettare le cellule primarie 0,5 x 106 o le cellule trasformate AAV-Cas9 nella lingua dei topi immunocompetenti C57BL/6.
- Eutanasia gli animali 2 settimane dopo l'iniezione da CO2 asfissia, e sezionare i tumori dai topi eutanasia per l'analisi immunoistochimica.
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Representative Results
Utilizzo del sistema AAV per trasformare le normali celle Cas9
La figura 1 fornisce una mappa vettoriale dettagliata del plasmide transgene AAV utilizzato in questo studio. Figura 2 delinea la progettazione e il funzionamento del sistema basato AAV-Cas9. Per produrre particelle virali, le cellule HEK293T sono state trafette con il vettore transgene AAV e altri vettori di imballaggio virali utilizzando il metodo di trasfezione PEI. Dopo la trasfezione, le cellule contenenti virus sono state raccolte e lismilate, e utilizzando il processo di purificazione dell'eparina-agarose, le particelle virali sono state purificate e concentrate(Figura 2A). Queste particelle virali purificate sono state utilizzate per la trasformazione in vitro delle cellule primarie isolate dai topi Cas9 per verificare l'efficacia. Nel nostro sistema, la cassetta di espressione transgene AAV è introdotta attraverso la ricombinazione omologa nel modello di targeting Cas9 Rosa26 dipendente da Cre all'interno di cellule di topo che trasportano un onnipresente promotore CAG (pCAG), un LoxP-Stop-LoxP (LSL), un gene cas9 nuclesi, un pep pep P2Atide auto-cleaving, e il reporter (EGFP) affiancato da due bracci di cassette omelogo14. L'attività di ricombinante Cre delle cellule tradotte eccita la l'LSL e induce l'espressione Cas9 e GFP (Figura 2B). L'attività nuclease di Cas9 introduce una rottura a doppio filamento nei siti di interesse di destinazione, diretta attraverso gRNA, e aiuta nell'editing genico. Il sistema AAV utilizzato in questo studio aiuta a fornire gRNA multiplexed (sgRNA per KRAS, p53 e APC) e anche nell'esprimere un allele oncogenico KRASG12D attraverso la riparazione omologia-diretto (HDR) nelle cellule tradusse.
Figura 1: mappa vettoriale del plasmide transgene AAV utilizzata in questo studio. Questo sistema AAV ha una spina dorsale AAV che esprime Cre ricombinante e tre sgRNA U6-driven mirakra, p53 e APC. Contiene anche un donatore di riparazione a omologia (HDR) diretto da KRAS G12D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Progettazione e funzionamento di un sistema AAV-Cas9 nella trasformazione delle cellule normali. (A) Delineare la produzione e la purificazione delle particelle AAV di HEK293T dopo averle tradotte con la transgene AAV e i plasmidi di imballaggio. (B) La trasduzione virale delle cellule primarie con particelle AAV e il meccanismo con cui l'espressione Cas9 dipendente dalla Crena consente l'editing CRISPR e la trasformazione delle cellule primarie in cellule tumorigene. Un singolo vettore AAV che integra gRNA per tre diversi geni con un knockin dell'allele KRAS G12D attraverso l'HDR con una cassetta di espressione ricombinase Cre è stato consegnato in cellule primarie di topo Cas9 dipendenti da Cre. L'attività ricombinabile nelle cellule trasdotte porta all'escissione della cassetta LoxP-Stop-LoxP e induce l'espressione Cas9 e GFP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Convalida del sistema AAV-Cas9 in vitro in cellule fibroblaste embrionali di topo isolate
Le cellule primarie del fibroblasto embrionale del topo (MEF) sono state utilizzate esclusivamente per studiare le conseguenze dell'ablazione genica nella crescita cellulare e nella proliferazione22. Per convalidare l'efficienza del sistema AAV-Cas9 nella trasformazione delle cellule normali, abbiamo transdotto cellule MEF isolate dagli embrioni di topo Cas9 (E14) con AAV. Le cellule MEF sono state isolate come descritto in precedenza23,24. Sono stati utilizzati i MEF di embrioni di topo Cas9 risalenti a 14 giorni fa perché sono facili da coltura e trasduzione in vitro. In breve, per trasformare i MEF attraverso la trasduzione AAV, i MEF primari a circa il 30% di confluenza sono stati considerati pronti per la trasduzione. Un'ora prima della trasduzione, i media della cultura MEF sono stati cambiati. L'AAV purificato è stato scongelato sul ghiaccio e i media della cultura MEF sono stati aspirati. Il supernatante virale con un titro variabile da 106-1014 genoma virale/mL è stato aggiunto ad ogni pozzo e incubato durante la notte a 37 gradi centigradi. Il supernatante virale è stato rimosso dopo 48 h, sostituito con 2 mL di mezzo di coltura MEF, e poi incubato a 37 s fino all'espressione GFP, circa 5 giorni dopo la trasduzione. MEF che esprimono i GFP sono stati sottocolti e convalidati. Si noti che per questo vettore abbiamo scoperto che 1012 genomi virali/mL (equivalente a 1010 unità trasduttrici/mL) potrebbero trasformare in modo efficiente le cellule MEF primarie in MEF tumorigeni(Figura 3A). Le cellule trasdotte hanno espresso Cre, Cas9 e GFP (Figura 3B,C). Per accedere al potenziale tumorigenico delle cellule MEF trasformate da AAV, 0,5 x 106 cellule (MEF primario/traspolede da AAV) sono state iniettate nella lingua, nel labbro e sottocutaneamente nei topi NOD-SCID. Le cellule trasformate formavano tumori in questi topi, rispetto al MEF primario, che non formava tumori (Figura 3D-F).
Figura 3: Convalida e trasformazione in vitro delle cellule MEF primarie utilizzando il sistema AAV-Cas9. (A) Contorno della trasformazione invitro dei fibroblasti da embrioni raccolti da topi Cas9 utilizzando particelle AAV. (B) Immagine rappresentativa dell'immunofluorescenza delle cellule MEF primarie e trasdotte da AAV che mostra l'espressione di GFP, Cre e Cas9. DAPI è stato utilizzato per macchiare il nucleo. (C) Gonghida occidentale che mostra Cre, Cas9, GFP, e atto z in fibroblasti embrionali normali e fibroblasti geneticamente modificati. (D) Immagine rappresentativa di un tumore della lingua che si è sviluppato in un topo NOD-SCID dopo averlo iniettato con cellule fibroblaste trasformate. (E) Immagine rappresentativa di un tumore al labbro che si è formato in un topo NOD-SCID dopo averlo iniettato con cellule fibroblaste trasformate. (F) Immagine rappresentativa di un tumore al fianco che si è sviluppato in un topo NOD-SCID dopo averlo iniettato con cellule fibroblaste trasformate. Le frecce indicano un tumore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella generazione in vitro della linea epiteliale della lingua murinale tumorale dalle cellule epiteliali della lingua primaria utilizzando il sistema AAV-Cas9
Dopo aver convalidato la proprietà trasformante del sistema AAV utilizzando le cellule MEF, abbiamo isolato le cellule epiteliali della lingua primaria dai topi Cas9 e le abbiamo coltivate in vitro. Le cellule primarie della lingua sono state tradurti con particelle virali AAV (1010 cfu/mL), e dopo una settimana le cellule hanno iniziato ad esprimere GFP. La trasformazione tumorale delle cellule epiteliali primarie (Figura 4A) è stata confermata utilizzando l'immunofluorescenza e il gonfiore occidentale ( Figura4B,C). Le celle trasformate presentano un'espressione KRT 14, E-cadherin ed GFP migliorata (Figura 4B). La trasformazione tumorale delle cellule epiteliali della lingua primaria è stata confermata dall'espressione della GFP (cioè, l'espressione dipendente dalla Crescia di Cas9 e GFP) (Figura 4C). L'espressione di KRT14 ed E-cadherin conferma le loro caratteristiche cellulari epiteliali. La convalida delle proteine ha confermato una maggiore valorizzata di z-catenina, fosfo-ERK, e ridotta espressione p53 (Figura 4C), indicando l'efficace downregolazione di APC e p53 e l'incorporazione di KRAS mutanti nelle cellule della lingua, rendendole così tumorigeni. L'analisi genomica mediante sequenziamento profondo del DNA isolato dalle cellule trasformate ha confermato l'efficace modifica genica e lo spostamento dei geni TP53 e APC da parte del sistema AAV-Cas9(tabella 2). La proprietà cancerogena della linea cellulare della lingua trasformata dall'AvAv è stata ulteriormente valutata iniettandola nella lingua di topi immunocompetenti di tipo selvaggio C57BL/6. Le cellule della lingua trasformate, designate come cellule epiteliali mutanti KRAS della lingua (KRAS Mut EpT), formano i tumori in modo efficiente nei topi C57BL/6 (Figura 4D). I tumori KRAS Mut EpT sono stati valutati da un patologo orale e maxillo-facciale dalla colorazione di ematossia ed eosina (H&E) di routine e dall'immunohistochimica. I tumori presentavano una morfologia delle cellule del mandrino con atipia nucleare prominente: pleomorfismo, ipercroma, nuclei giganti, diversi nucleoli e un alto tasso mitotico con figure mitotiche atipiche. Sono state notate anche l'invasione perivascolare e l'invasione. Queste caratteristiche morfologiche erano accompagnate da un'infiammazione molto limitata a un tumore inesistente. Immunohistochimicamente, le cellule neoplastiche erano citoplasmaticamente positive per E-cadherin e KRT 14, entrambi marcatori del tessuto epiteliale. KRT 14 è tipico dell'epitelio squamoso, sostenendo l'origine squamosa delle cellule tumorali e quindi la diagnosi di carcinoma a cellule squamose (Figura 4E). Di conseguenza, questo approccio fornisce una metodologia versatile per trasformare le cellule primarie in vitro con un'alterazione genica desiderata. Inoltre, questa metodologia facilita l'uso di queste linee cellulari sviluppate in vivo nei topi sinogene per una migliore comprensione della neoplasia in un vero e proprio ambiente di microambiente tumorale.
Figura 4: Trasformazione in vitro delle cellule epiteliali della lingua primaria utilizzando il sistema AAV-Cas9. (A) Rappresentazione schematica della trasformazione in vitro delle normali cellule epiteliali ottenute dalla lingua dei topi Cas9. (B) Immagine immunofluorescenza rappresentativa delle cellule epiteliali della lingua trasdotte da AAV che mostra l'espressione di KRT14, E-cadherin e GFP. (C) Macchia occidentale che mostra la Cas9, la z-catena e l'upregulation del fosfo-ERK con il downregulation del livello proteico p53, mostrando le cellule epiteliali geneticamente modificate. (D) Immagine rappresentativa di un tumore che si è sviluppato nella lingua dei topi immunocompetenti dopo averli iniettati con cellule epiteliali della lingua trasformate (KRAS Mut EpT). (E) Immagini rappresentative delle sezioni del tessuto tumorale per la colorazione H&E, E-cadherin e KRT 14 a ingrandimento 20x e 40x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer di lisi cellulare per la raccolta virale | Volume |
| 150 mM NaCl | 876.6mg |
| 50 mM Tris-HCl | 605,7 mg |
| Utilizzare HCl per regolare il pH 8.5 | |
| Acqua di grado molecolare | Fino a 100 mL |
| Buffer di equilibratione | |
| 1 mM MgCl2 | 9,52 mg |
| 2,5 mM KCl | 18.64mg |
| Mescolare il tutto in PBS 1X e regolare il pH a 7.2 | Fino a 100 mL |
| Buffer di eluzione | |
| 0,5 M NaCl | 2,92g |
| Mescolare il tutto in PBS 1X e regolare il pH a 7.2 | Fino a 100 mL |
| 10X Soluzione Stock A triplo enzima: | |
| Collagenae | 1 g conc finale [10 mg/ml] |
| Ialuronidasi | 100 mg [1 mg/ml] |
| DNano | 20.000 Unità di conc finale |
| PBS 1X | Fino a 100 mL |
| Miscela di plasmide (per una piastra da 14,5 cm) | |
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR | 10.g |
| Vettore capside AAV 2/9 | 10.g |
| PAD Delta F5 helper | 10.g |
| PEI (1g/l Stock) | 90il |
| DMEM (informazioni in stato di | 1 mL |
Tabella 1: Ricette dei buffer utilizzati in questo studio.
Tabella 2: Dati di analisi genomica delle cellule Kras Mut EpT. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Diversi metodi sono stati precedentemente utilizzati per trasformare le cellule primarie nella coltura con gradi variabili di successo25,26,27,28. La maggior parte di questi metodi utilizza cellule fibroblaste di topi per la trasformazione14,17,18,19 o utilizzare agenti cancerogeni come 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO)21,22 per lo sviluppo di modelli di linea cellulare murini. L'uso di modelli murini knockout e transgenici ha anche notevolmente migliorato la nostra comprensione dei vari percorsi molecolari che governano lo sviluppo e la differenziazione dell'HNC. L'uso di linee cellulari epiteliali orali murine con un modello genetico unico andrebbe certamente a completare questi studi, e i loro successivi saggi biochimici contribuirebbero al trattamento e alla diagnosi dell'HNC. Tuttavia, solo pochi rapporti hanno descritto la creazione di cellule epiteliali orali del topo28,29,30,31,32,33 e queste linee cellulari non sono in uso diffuso.
La principale limitazione di queste linee cellulari epiteliali orali murine è che non sono caratterizzate ampiamente a livello molecolare e sono state trovate per esprimere modelli genici non comuni. Pertanto, la limitata comprensione molecolare di questi modelli di linea cellulare murina e la mancanza di una metodologia efficiente ci hanno spinto a sfruttare il potenziale unico della tecnologia di editing del genoma AAV-CRISPR nei topi knock-in Cas9 per stabilire linee cellulari murine con specifiche alterazioni genetiche. In questo studio, abbiamo introdotto e sviluppato un sistema AAV-Cas9 in vitro per trasformare le cellule murine primarie in uno stato tumorigenico per confermare le alterazioni genetiche che danno origine alle cellule cancerogene. Abbiamo stabilito con successo cellule epiteliali della lingua murina con specifiche mutazioni genetiche con alta efficienza utilizzando l'editing genico somatico indotto da CRISPR mediato da AAV da diverse combinazioni di sgRNA.
Questa metodologia offre un nuovo approccio sperimentale per comprendere meglio l'eziologia cellulare-autonoma dell'HNC. Partendo dalle cellule epiteliali della lingua primaria murina, siamo stati in grado di trasformare tali cellule in tumorigenicità eliminando un insieme limitato di geni e introducendo una singola mutazione KRAS. Utilizzando questa metodologia, è ora possibile studiare se altri geni noti per essere implicati in altri carcinomi possono produrre neoplasie che assomigliano più da vicino all'HNC. Le caratteristiche morfologiche dei tumori di KRAS Mut EpT hanno confermato il carcinoma a cellule squamose. L'analisi istopatologica dei tumori KRAS Mut EpT nei topi sinogene è associata e favorevole al comportamento biologico aggressivo del carcinoma della testa e del collo. Pertanto, potrebbe essere possibile collegare i genotipi delle cellule tumorali a specifiche caratteristiche cliniche e istopatologiche dei tumori.
I principali vantaggi di questa metodologia sono la capacità di sviluppare linee cellulari da cellule primarie da qualsiasi organo utilizzando specifiche mutazioni genetiche e l'uso di AAV-Cas9, che rende il sistema più robusto e stabile. L'endogeno sistema Cas9 permette di utilizzare altri knockout genici. Il principale svantaggio della metodologia attuale è il tempo necessario per isolare e stabilire la coltura primaria, nonché l'elevato tire di particelle virali necessarie per trasdurre le cellule primarie. Tuttavia, questo potrebbe essere superato standardizzando il processo di isolamento per ogni tipo di cella. Il problema di richiedere un alto titer virale AAV per una trasduzione efficiente potrebbe essere alleviato con l'uso dell'ultima generazione di plasmidi di capside e helper per l'imballaggio virale e un migliore processo di purificazione.
In futuro, un sistema AAV migliore e più efficiente potrebbe essere progettato ed estrapolato in vivo per creare modelli tumorale geneticamente modificati specifici dell'organo. In conclusione, stabilire le linee cellulari murine da questo approccio servirà come un prezioso strumento in vitro cellulare basato sulla coltura per testare diverse ipotesi nel contesto dell'oncologia.
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Disclosures
M.S. fa parte dell'Advisory Board dell'Istituto di Bioscienze e Menarini Ricerche ha ricevuto fondi di ricerca da Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics e Menarini Ricerche. M.S. è anche co-fondatrice di Medendi Medical Travel, e negli ultimi 2 anni, ha ricevuto onorarida da Menarini E ADC Pharma. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Desideriamo ringraziare il Dr. Daniel Gitler per averci fornito il pAd Delta 5 Helper plasmid. Questo lavoro è stato finanziato dalla Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (per me), dalla United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (per ME e MS), dalla Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (per ME), dalla Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (per ME) e dalla Concern #7895 (ME). Fellowship: la borsa di studio Alon a ME e BGU Kreitman a SJ e MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
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