Summary
El desarrollo de modelos murinos con genes específicos mutados en pacientes con cáncer de cabeza y cuello es necesario para comprender la neoplasia. Aquí, presentamos un protocolo para la transformación in vitro de células de la lengua murina primaria utilizando un sistema adeno-asociado virus-Cas9 para generar líneas celulares HNC murinas con alteraciones genómicas específicas.
Abstract
El uso de células epiteliales normales primarias permite inducir reproduciblemente las alteraciones genómicas necesarias para la transformación celular mediante la introducción de mutaciones específicas en oncogenes y genes supresores de tumores, utilizando tecnología de edición del genoma basada en repetición palindrómica corta (CRISPR) en ratones. Esta tecnología nos permite imitar con precisión los cambios genéticos que se producen en los cánceres humanos que utilizan ratones. Al transformar genéticamente las células primarias murinas, podemos estudiar mejor el desarrollo, la progresión, el tratamiento y el diagnóstico del cáncer. En este estudio, utilizamos células epiteliales de lengua de ratón Cas9 inducibles Cre 9 para permitir la edición del genoma utilizando virus asociado al adeno (AAV) in vitro. Específicamente, al alterar KRAS, p53 y APC en células epiteliales normales de la lengua, generamos una línea celular de cáncer de cabeza y cuello murino (HNC) in vitro, que es tumorigénica en ratones singéricos. El método presentado aquí describe en detalle cómo generar líneas celulares HNC con alteraciones genómicas específicas y explica su idoneidad para predecir la progresión del tumor en ratones singéricos. Prevemos que este método prometedor será informativo y útil para estudiar la biología tumoral y la terapia de HNC.
Introduction
La HNC es una neoplasia maligna común en todo el mundo1. El modelado de la génesis de la neoplasia HNC se encuentra actualmente en un punto de inflexión científico2. Si bien se han identificado muchas mutaciones genéticas en HNC2,3,4 (por ejemplo, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 y RAS) las combinaciones específicas de alteraciones genómicas necesarias en concierto para inducir la HNC siguen sin estar claras.
El uso actual de líneas celulares HNC humanas ha ayudado significativamente a dilucidar los mecanismos asociados con la patogénesis y el tratamiento3. Sin embargo, el estudio de las líneas celulares humanas en sistemas murinos inmunocomprometidos tiene sus limitaciones, porque estos sistemas no abordan el proceso neoplásico in vivo, el papel de mutaciones genéticas específicas y las respuestas de tratamiento en un microambiente inmune. Por lo tanto, el desarrollo y establecimiento de líneas celulares murinas con alteraciones genéticas específicas son de importancia primordial para estudiar cómo los diferentes genes contribuyen al proceso de transformación y para probar nuevas terapias basadas en moléculas en ratones inmunocompetentes.
Los estudios de la función génica en la investigación biomédica se han visto significativamente afectados por los avances en las tecnologías de edición de ADN, mediante la introducción de roturas de doble cadena (DSB), por ejemplo5. Estas tecnologías, incluido el uso de nucleasas de dedos de zinc, las nucleasas de efector similares a los activadores de transcripción y las repeticiones palindrómicas cortas regulables agrupadas (CRISPR/Cas9), permiten la manipulación de cualquier gen de interés en su locus. Los últimos sistemas CRISPR/Cas9 se componen de un ARN guía (gRNA) que ordena a la nucleasa Cas9 que genere un OSD en un sitio específico del genoma. Este sistema ha ganado un amplio reconocimiento en la modificación de genes endógenos en cualquier célula o tejido diana, incluso en los organismos más tradicionalmente difíciles de tratar5. Tiene múltiples ventajas sobre otros sistemas debido a su simplicidad, velocidad y eficiencia.
En oncología, la tecnología CRISPR/CAS9 ha cumplido la necesidad de imitar eficazmente las células cancerosas. Para establecer este sistema en HNC, manipulamos el potente oncogén KRAS y dos genes supresores de tumores importantes, APC y p536. Según la base de datos GENIE7,esta combinación es rara en HNC. Las mutaciones de RAS (HRAS, NRAS y KRAS) están presentes en sólo el 7% de todas las poblaciones de HNC. Estos tumores tienden a ser resistentes a la terapia8,9.
La entrega de Cas9 y su ARNm se logra a través de la transducción viral utilizando AAVs o lentivirus. El AAV recombinante es a menudo el método preferido para la entrega de genes a las células diana debido a su alto títer, respuesta inmune leve, capacidad de transducción de una amplia gama de células, y seguridad general. Utilizando un sistema AAV, se han generado varias líneas celulares de ratón específicas del tejido, y todavía se están desarrollando nuevas líneas celulares10,11,12. Sin embargo, aún queda por desarrollar un sistema de edición genómica eficiente que pueda generar modelos de líneas celulares HNC murinos. En este estudio, buscamos desarrollar un sistema in vitro basado en AAV-Cas9 para transformar las células primarias de la lengua murina en un estado tumorigénico. Este protocolo único de transformación CRISPR/Cas9 y la línea celular tumoral establecida se pueden utilizar para comprender mejor la biología de la HNC inducida por una diversidad de alteraciones genómicas.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por la Universidad Ben Gurion del Comité de Cuidado y Uso de Animales Negev. Los experimentos con animales fueron aprobados por la IACUC (IL.80-12-2015 e IL.29-05-2018(E)). Todos los aspectos de las pruebas con animales, la vivienda y las condiciones ambientales utilizadas en este estudio cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio13.
1. Producción de virus asociados a Adeno
- Día 1: Cultivo celular
- Semilla 4 x 10 6 hek293T células por placa de 14,5 cm en 15 ml de DMEM. Preparar 10 placas para la transfección con polietilenimina (PEI) (1 g/L).
- Día 2: Transfección de células HEK293T usando PEI
- Retire los medios y vuelva a alimentarlo con DMEM caliente 1 h antes de la transfección.
- Reactivos de transfección precalentados y DMEM.
- Utilizar 10 g del plásmido de interés que contiene AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 g del plásmido cápside AAV 2/9n (con el gen de repetición de AAV2 y el gen de la tapa de AAV9, y 10 g del plásmido auxiliar (ayudante pAdDelta F5) por placa (Ver Tabla de Materiales).
NOTA: Una nueva generación de plásmido auxiliar - pAdDeltaF614,15,16 que también se puede utilizar para la producción de AAV está disponible. - Mezclar los plásmidos en 1 ml de DMEM liso por placa. A continuación, añadir 90 l de polietilenimina (plásmido total: concentración de PEI 1:3) a la mezcla de plásmido y vórtice brevemente.
- Incubar la mezcla de ADN PEI-plásmido durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
- Agregue la mezcla con gotas encima de las células HEK293T y transfiera las placas a la incubadora de cultivo celular a 37 oC con un 5% deCO2 durante 24 horas.
- Día 3: Cambio medio después de la transfección
- Retire el medio por completo y añada 15 ml de DMEM fresco.
- Día 5: Cosecha del virus
- Prepare un baño de hielo seco/etanol.
- Recoger las células con un rascador de células y transferirlas en tubos de 50 ml (2 placas por tubo de 50 ml).
- Tubos de giro a 800 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante de todos los tubos. Añadir 0,5 ml del tampón de lisis (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH a 8,5) por placa (es decir, 5 ml para 10 placas) solo al primer tubo. Resuspenda las células y transfiera el volumen total al siguiente tubo y continúe hasta el último tubo.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo fresco de 50 ml. Lave los tubos con el mismo volumen de tampón de lisis (0,5 ml por placa) utilizando el mismo método de transferencia descrito en el paso 1.4.4.
- Sujete la suspensión celular a tres rondas de ciclos de congelación/descongelación de 10 minutos entre un baño de hielo seco/etanol y un baño de agua de 37 oC. Vórtice brevemente después de cada descongelación.
- Si la purificación se lleva a cabo el mismo día, ajuste el tampón de equilibrio y elución (véase el Cuadro 1 para la receta) en RT.
- Añadir 50 unidades de benzonasa por placa e incubar a 37oC durante 1,5 h.
NOTA: Benzonase se utiliza para digerir los ácidos nucleicos residuales de las células productoras del huésped y el ADN plásmido presente en la suspensión celular. - Gire los tubos a 3.000 x g durante 15 min a 4 oC.
- Recoger el sobrenadante en una jeringa con una aguja de acero de 18 G y empujar la solución a través de un filtro de 0,45 m en un tubo de 15 ml para obtener el lisato crudo.
- Almacene el lisado crudo a 4oC durante unas semanas hasta su purificación o continuar la purificación.
2. Purificación AAV
- Día 5 o posterior
- Coloque el búfer de equilibrio y elución en RT.
- Lave las columnas de cromatografía con 10 ml del tampón de equilibrio.
- Añadir 0,5 ml por placa de heparina-agarosa a la columna17 y luego añadir el búfer de equilibrio (4 veces el volumen de la heparina-agarosa). Mezcle las soluciones invirtiendo la columna y deje que el sedimento de agarosa.
- Elule el búfer de equilibrio de la columna por gravedad.
NOTA: Deje un poco de tampón de equilibrio para evitar que la agarosa se seque. - Cargue el lisado crudo sobre la columna e incubar durante 2 h a 4 oC con agitación constante. Ponga la columna en posición vertical y deje que la agarosa se sedimente.
- Eluya el crudo lisado por gravedad.
- Lavar la columna con tampón de equilibrio (4 veces el volumen de la heparina-agarosa).
- Coloque un filtro de proteína centrífuga de 100 kDa debajo de la columna y eluda el virus utilizando un tampón de elución (3 veces el volumen de la heparina-agarosa) en el filtro.
NOTA: El búfer de elución no debe superar los 15 ml. - Centrifugar el filtro a 3.000 x g durante 30 minutos hasta que quede menos de 1 ml en el filtro.
- Llene el filtro con PBS y centrífuga a 3.000 x g durante 30 min hasta que quede menos de 1 ml en el filtro. Repita este paso 2x para eliminar todas las sales.
- Concentrar la solución del virus en el filtro por centrifugación a 3.000 x g para llegar a un volumen lo más pequeño posible (menos de 200 l).
- Aspirar la solución de virus con una aguja y una jeringa y empujar la solución a través de un filtro de 0,22 m en un tubo.
- Hacer alícuotas de partículas virales concentradas para su almacenamiento.
NOTA: Las alícuotas deben ser de 20 oL para el almacenamiento a corto plazo a 4 oC y 5 oC para el almacenamiento a largo plazo a -80 oC. - Determinar el titer viral y la eficiencia de transducción viral como se describió anteriormente14,18,19,20.
3. Aislamiento y cultivo de células primarias
- Día 1
- Eutanasia a un hombre o mujer de 6 semanas de edad B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J por asfixia CO2 o cualquier otro protocolo aprobado por la IACUC.
NOTA: Estos ratones knockin CRISPR/Cas9 tienen expresión dependiente de Cre recombinase de cas9 endonucleasa y EGFP dirigida por un promotor de CAG. La secuencia aguas arriba de Lox-Stop-Lox (LSL) presente en el genoma de estos ratones evita la expresión de Cas9 y EGFP en ausencia de Cre recombinase. Cuando se utilizan en combinación con ARN de guía única (sgRNAs) y una fuente Cre, permiten la edición de genes de ratón individuales o múltiples in vivo o ex vivo14. - Disecciona la lengua de los ratones eutanasiados usando tijeras quirúrgicas.
- Disocia manualmente el tejido picando el tejido de la lengua en fragmentos muy pequeños usando un bisturí. Recoger los fragmentos de tejido en un tubo de 15 ml que contiene 4,5 ml de medio plano RPMI (con suero fuera).
- Añadir la mezcla de enzimas triples (200 l) (ver Tabla 1 para la receta) a los fragmentos de tejido.
- Incubar la mezcla tejido-enzima a 37 oC durante 30 minutos y toque el tubo cada 10 minutos para mejorar la disociación enzimática del tejido.
- Añadir un 5% de suero bovino fetal (FBS) que contenga HBSS/PBS a la mezcla tejido-enzima para detener la acción enzimática.
- Filtre la suspensión celular anterior a través de una malla de nylon estéril de 70 m para separar las células dispersas y fragmentos de tejido más grandes.
- Lavar la suspensión de celda filtrada por centrifugación durante 300 x g durante 5 min en HBSS/PBS a RT.
- Resuspende el pellet en medio de cultivo (10% FBS en RPMI/DMEM) y crece en platos de cultivo de 60 mm hasta que se formen colonias celulares distintas.
- Los agregados de células de cultivo se conservan en la parte superior del filtro en una placa de cultivo de 60 mm que contiene 3 ml de medios completos (10% FBS en RPMI/DMEM) hasta que se forman colonias celulares.
- Examine microscópicamente las células primarias para detectar la presencia de contaminación por fibroblastos después de 1 semana de cultivo. Tratar las células primarias desarrolladas a partir de agregados y suspensiones celulares con 0.25 solución de trippsina 0.02% EDTA a 37 oC durante 1 min para eliminar los fibroblastos.
NOTA: Por lo general, el cultivo primario de los agregados celulares produce más colonias en comparación con las suspensiones de una sola célula. Las células de estas colonias proporcionan una mejor eficiencia de transducción con la transducción AAV.
- Eutanasia a un hombre o mujer de 6 semanas de edad B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J por asfixia CO2 o cualquier otro protocolo aprobado por la IACUC.
4. Transducción AAV de células primarias
- Día 10
- Semilla 2 x 105 células primarias por pozo en 6 placas de pozo en 2 ml de medios completos (10% FBS en RPMI/DMEM).
- Al día siguiente, transducir las células con 1012 genomas/ml virales (1010 unidades de transducción/ml) e incubar las células en medios virales que contienen partículas durante 48 h a 37 oC.
- Retire el medio viral que contiene partículas y alimente las células transducidas por AAV con medios completos.
NOTA: Sólo las células que se sometieron a transducción expresarán la FPG y comenzarán a proliferar. Las células que no fueron transductivas eventualmente morirán dentro de 2 semanas. - Después de 2 semanas de expansión del cultivo, sembrar las células para la validación y los experimentos tumorigénicos in vivo.
NOTA: El ADN genómico de las células transducidas por AAV y las células primarias normales de los ratones Cas9 se extrajeron para validar la edición específica del genoma utilizando protocolos estándar. La secuenciación del ADN extraído y el análisis de los datos secuenciados(Tabla 2) se realizaron utilizando un ensayo de secuenciación de próxima generación basado en la captura de hibridación (por ejemplo, plataforma MSK-IMPACT) como se describió anteriormente21.
5. Validación de la transformación de células normales a células tumorigénicas mediante inmunofluorescencia y hincha occidental
- Inmunofluorescencia
- Semilla 2 x 105 células en tapas de vidrio de 12 mm y colóquelas en una incubadora durante la noche.
- Fijar células en 4% paraformaldehído en PBS (pH a 7.4) y proceso para el etiquetado de inmunofluorescencia.
- Incubar las células fijas con el primer anticuerpo primario en 1% de BSA o 1% de suero en PBST en una cámara humidificada durante 1 h a RT o durante la noche a 4oC. Los anticuerpos principales utilizados son el conejo monoclonal anti-KRT 14, el anticuerpo anti-E-cadherin a conejo monoclonal y el ratón Cas9 mAb.
- Retire la solución de anticuerpos primarios de los cubretapas lavando las células 3 veces durante 5 min con 1x PBS.
- Incubar las células con Cy3 burro anticonejo anticonejo IgG y / o Cy3 cabra anti-ratón IgG anticuerpos secundarios en 5% BSA en PBST durante 1 h en RT en la oscuridad.
- Retire la solución secundaria de anticuerpos de los cubrepies y lave las células 3veces como se describe en el paso 5.1.4.
- Monte los cubreobjetos con una gota de medio de montaje que contenga DAPI (DAPI Fluoromount).
- Conservar en la oscuridad a 4oC hasta que las diapositivas se muestren con microscopía de fluorescencia.
- Hincha occidental
- Semilla 1 x 106 células transformadas en un plato de cultivo de 100 mm y colóquelas en una incubadora durante la noche.
- Lave y raspe las células transformadas en PBS helado de 200 l.
- Centrifugar el tubo que contiene la suspensión celular durante 10 min a 2.000 x g a 4 oC para peletizar las células.
- Aspirar el sobrenadante y la lentitud de las células utilizando tampón de lisis (ver Tabla 1) que contiene cócteles inhibidores de la fosfatasa y un inhibidor de la proteasa durante 10 min a 4 oC. Centrifugar los lysates durante 10 min a 10.000 x g y 4oC y recoger los lysates despejados.
- Utilice un kit de ensayo Bradford disponible comercialmente para determinar la concentración de proteínas siguiendo el protocolo del fabricante. Utilice un tampón de muestra 4x (500 mM Tris pH a 6,8, 40% glicerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% de azul bromofenol) para ajustar las muestras de proteínas a 0,5 o 1 g/L. Hervir a 96 oC durante 5 min.
NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -80 oC o hasta que se realice un análisis de la mancha occidental. - Separar las cantidades iguales de lisato total (30 g) por 10% de electroforesis de gel de dodecilo sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Asegúrese de que el tinte llegue a la parte inferior del gel. Transfiera la proteína a la membrana de nylon mediante una hinchazón semiseca a 25 V durante 30 min.
- Vierta 5% De BSA en solución salina tris tamponada (TBS)-0.1% Tween (TBST) sobre la membrana para cubrirla completamente. Bloquear la membrana durante 1 h en RT. Incubar la mebrana con anticuerpos primarios (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, anti-a catenina, anti p53, anti-fosfo-ERK, y anti-a-actina diluida en 5% BSA TBST) a 4 oC durante la noche.
- Después de la incubación, lavar las membranas durante 10 min con 1 tbST asegurándose de que la solución cubre completamente la membrana. Realice este lavado 3x, y luego agregue el anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP) (diluido 1:10,000 en 5% BSA TBST) a la membrana. Incubar durante 1 h a RT.
- Después de la incubación, lavar las membranas durante 10 min con 1 tbST asegurándose de que la solución cubre completamente la membrana. Realice la toma de imágenes de quimioluminiscencia (ver Tabla de Materiales)para exponer las bandas y capturar las imágenes en consecuencia.
- Validación del potencial tumorígeno de células transformadas en ratones inmunocompetentes
NOTA: Los ratones fueron mantenidos y tratados de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad Ben-Gurion del Negev. Cabeceo. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) y ratones C57BL/6 se utilizaron para los estudios in vivo. Los ratones fueron alojados en armarios de flujo laminar filtrados por aire con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y fueron alimentados con alimentos y agua ad libitum.- Use NOD hembra de 6-8 semanas de edad. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) y C57BL/6 para el estudio.
- Trippsinizar las células transformadas AAV-Cas9. Detenga la trippsinización con DMEM precalentado a 37 oC y recójala en un tubo de 50 ml.
- Centrifugar el tubo a 800 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en medio DMEM sin FBS. Realice la centrifugación de nuevo y vuelva a suspender el pellet celular en 1x PBS.
NOTA: No mantenga las células en 1x PBS durante demasiado tiempo. Mantenga siempre la suspensión celular sobre hielo para evitar que se agrupe las células. - Utilice un contador de células automático para contar las células y diluir las células a la concentración deseada (2,5 x 107 células/ml) utilizando 1pbS. Generar tumores a través de una inyección subcutánea de la suspensión celular transformada AAV-Cas9 en el flanco derecho de cada NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) ratón (2 x 106 celdas/ratón). Para generar un modelo ortotrópico en ratones singéricos, inyectar 0,5 x 106 células primarias o las células transformadas AAV-Cas9 en la lengua de ratones inmunocompetentes C57BL/6.
- Euthanizar a los animales 2 semanas después de la inyección por asfixia de CO2, y diseccionar los tumores de los ratones eutanasiados para el análisis de inmunohistoquímica.
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Representative Results
Uso del sistema AAV para transformar células Cas9 normales
La Figura 1 proporciona un mapa vectorial detallado del plásmido transgénico AAV utilizado en este estudio. La Figura 2 describe el diseño y el funcionamiento del sistema basado en AAV-Cas9. Para producir partículas virales, las células HEK293T se transcusaron con el vector transgén al AAV y otros vectores de empaquetado viral utilizando el método de transfección PEI. Después de la transfección, las células que contienen el virus fueron recogidas y lysed, y utilizando el proceso de purificación de heparina-agarosa, las partículas virales fueron purificadas y concentradas(Figura 2A). Estas partículas víricas purificadas se utilizaron para la transformación in vitro de células primarias aisladas de ratones Cas9 para comprobar la eficacia. En nuestro sistema, el casete de expresión transgénica AAV se introduce a través de la recombinación homóloga en la plantilla de orientación Cas9 Rosa26 dependiente de Cre dentro de células de ratón que llevan un promotor CAG ubicuo (pCAG), un casete LoxP-Stop-LoxP (LSL), un gen de nucleasa Cas9, un péptido P2A autocelante y el gen reportero (EGFP) flanqueado por dos brazos homólogos14. La actividad Cre recombinase de las células transducidas extirpa el LSL e induce la expresión Cas9 y GFP (Figura 2B). La actividad de la nucleasa Cas9 introduce una rotura de doble cadena en los sitios de interés objetivo, dirigida a través de los ARNm, y ayuda en la edición de genes. El sistema AAV utilizado en este estudio ayuda a entregar gRNAs multiplexados (sgRNAs para KRAS, p53 y APC) y también en la expresión de un alelo KRASG12D oncogénico a través de la reparación dirigida por homología (HDR) en las células transducidas.
Figura 1: Mapa vectorial del plásmido transgén AAV utilizado en este estudio. Este sistema AAV tiene una columna vertebral AAV que expresa Cre recombinase y tres sgRNAs impulsados por U6 dirigidos a KRAS, p53 y APC. También contiene un donante de reparación por homología (HDR) de KRAS G12D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diseño y funcionamiento de un sistema AAV-Cas9 en la transformación de células normales. (A) Esquema de la producción y purificación de partículas AAV de HEK293T después de transfectarlas con el transgén AAV y plásmidos de envasado. (B) La transducción viral de células primarias con partículas AAV y el mecanismo por el cual la expresión Cas9 dependiente de Cre permite la edición CRISPR y la transformación de células primarias en células tumorigénicas. Un solo vector AAV que integra gRNAs para tres genes diferentes con un knockin del alelo KRAS G12D a través de HDR con un casete de expresión recombinas Cre fue entregado en células primarias de ratón Cas9 dependientes de Cre. La actividad de la cre recombinación en las células transducidas conduce a la escisión del casete LoxP-Stop-LoxP e induce la expresión Cas9 y GFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Validación del sistema AAV-Cas9 in vitro en células fibroblastas embrionarias de ratón aisladas
Las células de fibroblastos embrionarios de ratón primario (MEF) se han utilizado exclusivamente para estudiar las consecuencias de la ablación genética en el crecimiento celular y la proliferación22. Para validar la eficiencia del sistema AAV-Cas9 en la transformación de células normales, transdujo células MEF aisladas de embriones de ratón Cas9 (E14) con AAV. Las células MEF se aislaron como se describió anteriormente23,24. Se utilizaron mefes de embriones de ratón Cas9 de 14 días de edad porque son fáciles de cultivar y transducir in vitro. En resumen, para transformar los MOF a través de la transducción AAV, los MOF primarios a aproximadamente el 30% de confluencia se consideraron listos para la transducción. Una hora antes de la transducción, los medios de cultivo del MEF cambiaron. El AAV purificado fue desalojado sobre hielo y se aspiraron los medios de cultivo del MEF. Se añadió a cada pocal un sobrenadante viral con un mareado que oscila entre 106 -1014 y se añadió un genoma/ml viral e incubado durante la noche a 37oC. El sobrenadante viral fue removido después de 48 h, reemplazado por 2 ml de medio de cultivo MEF, y luego incubado a 37 oC hasta la expresión de GFP, unos 5 días después de la transducción. Los MFP que expresan la FPG fueron subcultivos y validados. Tenga en cuenta que para este vector encontramos que 1012 genomas virales/ml (equivalentes a 1010 unidades de transducción/ml) podrían transformar eficientemente las células MEF primarias en MEF tumorigénicos(Figura 3A). Las células transducidas expresaron Cre, Cas9 y GFP(Figura 3B,C). Para acceder al potencial tumorígeno de las células MEF transformadas a AAV, se inyectaron 0,5 x 106 células (MEF primario/transducido por AAV) en la lengua, el labio y por vía subcutánea en ratones NOD-SCID. Las células transformadas formaron tumores en estos ratones, en comparación con el MEF primario, que no formó tumores(Figura 3D-F).
Figura 3: Validación y transformación in vitro de células MEF primarias utilizando el sistema AAV-Cas9. (A) Esquema de la transformación in vitro de fibroblastos de embriones recogidos de ratones Cas9 utilizando partículas AAV. (B) Imagen de inmunofluorescencia representativa de células MEF primarias y MEF transducidas por AAV que muestren la expresión de GFP, Cre y Cas9. DAPI se utilizó para manchar el núcleo. (C) hinchamiento occidental que muestra Cre, Cas9, GFP y actina en fibroblastos normales embrionarios y fibroblastos editados genéticamente. (D) Imagen representativa de un tumor de lengua que se desarrolló en un ratón NOD-SCID después de inyectarlo con células fibroexplosivas transformadas. (E) Imagen representativa de un tumor labial que se formó en un ratón NOD-SCID después de inyectarlo con células fibroblastas transformadas. (F) Imagen representativa de un tumor de flanco que se desarrolló en un ratón NOD-SCID después de inyectarlo con células fibroexplosivas transformadas. Las flechas indican un tumor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Generación in vitro de la línea celular epitelial de la lengua murina tumorigénica a partir de células epiteliales de lengua primaria utilizando el sistema AAV-Cas9
Después de validar la propiedad transformadora del sistema AAV utilizando las células MEF, aislamos células epiteliales de lengua primaria de ratones Cas9 y las cultivamos in vitro. Las células principales de la lengua fueron transducidas con partículas virales AAV (1010 cfu/ml), y después de una semana las células comenzaron a expresar GFP. La transformación tumorigénica de las células epiteliales de la lengua primaria(Figura 4A)se confirmó utilizando inmunofluorescencia y hinchazón occidental(Figura 4B,C). Las celdas transformadas exhiben una expresión mejorada de KRT 14, E-cadherin y GFP(Figura 4B). La transformación tumorigénica de las células epiteliales de la lengua primaria fue confirmada por la expresión de la FPG (es decir, la expresión dependiente de la Cre de Cas9 y GFP)(Figura 4C). La expresión de KRT14 y E-cadherina confirma sus características de células epiteliales. La validación de proteínas confirmó una mayor expresión de catenina, fosfo-ERK y p53 reducido(Figura 4C),lo que indica la regulación efectiva de APC y p53 y la incorporación de KRAS mutantes en las células de la lengua, haciéndolos tumorígenos. El análisis genómico mediante la secuenciación profunda del ADN aislado de las células transformadas confirmó la edición eficaz del gen y el cambio de fotogramas de los genes TP53 y APC por el sistema AAV-Cas9 (Tabla 2). La propiedad tumorigénica de la línea celular de la lengua transformada en AAV se evaluó aún más inyectándola en la lengua de ratones de tipo salvaje inmunocompetente C57BL/6. Las células de la lengua transformadas, designadas como células epiteliales mutantes KRAS de la lengua (KRAS Mut EpT), forman tumores eficientemente en ratones C57BL/6(Figura 4D). Los tumores kraS Mut EpT fueron evaluados por un patólogo oral y maxilofacial por tinción rutinaria de hematoxilina y eosina (H&E) y por inmunohistoquímica. Los tumores mostraron una morfología celular del husillo con atipia nuclear prominente: pleomorfismo, hipercromatismo, núcleos gigantes, varios nucleoli, y una alta tasa mitótica con figuras mitóticas atípicas. También se observaron la invasión perivascular y la angioinvasión. Estas características morfológicas fueron acompañadas de una inflamación muy limitada a la inflamación asociada a tumores inexistente. Inmunohistoquímicamente, las células neoplásicas fueron citoplasmaicamente positivas para la E-cadherina y la KRT 14, ambos marcadores del tejido epitelial. KrT 14 es típico del epitelio escamoso, apoyando el origen escamoso de las células tumorales y por lo tanto el diagnóstico de carcinoma de células escamosas(Figura 4E). Por lo tanto, este enfoque proporciona una metodología versátil para transformar las células primarias in vitro con una alteración genética deseada. Además, esta metodología facilita el uso de estas líneas celulares desarrolladas in vivo en ratones singéricos para una mejor comprensión de la neoplasia en un entorno de microambiente tumoral real.
Figura 4: Transformación in vitro de células epiteliales de lengua primaria utilizando el sistema AAV-Cas9. (A) Representación esquemática de la transformación in vitro de células epiteliales normales obtenidas de la lengua de ratones Cas9. (B) Imagen representativa de la inmunofluorescencia de las células epiteliales de lengua transducidas por AAV que muestre nIF de KRT14, E-cadherin a GFP. (C) Mancha occidental que muestra Cas9, catenina y fosfo-ERK de regulación ascendente con regulación descendente del nivel de proteína p53, mostrando las células epiteliales editadas genéticamente. (D) Imagen representativa de un tumor que se desarrolló en la lengua de los ratones inmunocompetentes después de inyectarlos con células epiteliales de lengua transformadas (KRAS Mut EpT). (E) Imágenes representativas de secciones de tejido tumoral para tinción de H&E, E-cadherin y KRT 14 a un aumento de 20x y 40x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tampón de lisis celular para la cosecha viral | Volumen |
| 150 mM NaCl | 876.6mg |
| 50 mM Tris-HCl | 605.7mg |
| Utilice HCl para ajustar el pH 8.5 | |
| Agua de grado molecular | Hacer hasta 100 mL |
| Búfer de equilibrio | |
| 1 mM MgCl2 | 9,52 mg |
| 2,5 mM KCl | 18.64mg |
| Mezclar todo en PBS 1X y ajustar el pH a 7.2 | Hacer hasta 100 mL |
| Búfer de elución | |
| 0.5 M NaCl | 2.92g |
| Mezclar todo en PBS 1X y ajustar el pH a 7.2 | Hacer hasta 100 mL |
| Solución de stock de triple enzima 10X: | |
| Colagenasa | 1 g de conc. final [10 mg/ml] |
| Hialuronidasa | 100 mg [1 mg/ml] |
| Adnsa | 20.000 Unidades de conc. [200 mg/ml] |
| PBS 1X | Hacer hasta 100 mL |
| Mezcla de plásmido (para una placa de 14,5 cm) | |
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR | 10 g |
| Vector de cápside AAV 2/9 | 10 g |
| ayudante pAD Delta F5 | 10 g |
| PEI (1 g/l Stock) | 90l |
| DMEM | 1 mL |
Tabla 1: Recetas de tampones utilizados en este estudio.
Tabla 2: Datos de análisis del genoma de las células Kras Mut EpT. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
Varios métodos se han utilizado previamente para transformar células primarias en cultivo con grados variables de éxito25,26,27,28. La mayoría de estos métodos utilizan células de fibroblastos de ratón para la transformación14,17,18,19 o utilizan carcinógenos como 4-nitroquinolina-1-óxido (4-NQO)21,22 para el desarrollo de modelos de línea celular murina. El uso de modelos de ratón noqueados y transgénicos también ha mejorado en gran medida nuestra comprensión de las diversas vías moleculares que rigen el desarrollo y la diferenciación de HNC. El uso de líneas celulares epiteliales orales murinos con un patrón genético único sin duda complementaría estos estudios, y sus ensayos bioquímicos posteriores contribuirían al tratamiento y diagnóstico de HNC. Sin embargo, sólo unos pocos informes han descrito el establecimiento de células epiteliales orales de ratón28,29,30,31,32,33 y estas líneas celulares no están en uso generalizado.
La principal limitación de estas líneas celulares epiteliales orales murinas es que no se caracterizan extensamente a nivel molecular y se encontró que expresan patrones genéticos poco comunes. Por lo tanto, la limitada comprensión molecular de estos modelos de líneas celulares murinas y la falta de una metodología eficiente nos llevaron a aprovechar el potencial único de la tecnología de edición del genoma AAV-CRISPR en ratones knock-in Cas9 para establecer líneas celulares murinas con alteraciones genéticas específicas. En este estudio, introdujimos y desarrollamos un sistema AAV-Cas9 in vitro para transformar las células murinas primarias en un estado tumorigénico para confirmar las alteraciones genéticas que dan lugar a células carcinoma. Establecimos con éxito células epiteliales de lengua murina con mutaciones genéticas específicas con alta eficiencia utilizando la edición de genes somáticos inducidapor por CRISPR mediado por El AAV mediante varias combinaciones de ARNS.
Esta metodología ofrece un nuevo enfoque experimental para comprender mejor la etiología autónoma celular de hnc. Comenzando con las células epiteliales de la lengua primaria murina, pudimos transformar dichas células en tumorigenicidad eliminando un conjunto limitado de genes e introduciendo una sola mutación KRAS. Usando esta metodología, ahora es posible investigar si otros genes que se sabe que están implicados en otros carcinomas pueden producir neoplasias malignas que se parecen más a HNC. Las características morfológicas de los tumores de KRAS Mut EpT confirmaron el carcinoma de células escamosas. El análisis histopatológico de tumores KRAS Mut EpT en ratones sinémicos se asocia y apoya el comportamiento biológico agresivo del carcinoma de cabeza y cuello. Por lo tanto, puede ser posible vincular los genotipos de las células cancerosas con características clínicas e histopatológicas específicas de los tumores.
Las principales ventajas de esta metodología son la capacidad de desarrollar líneas celulares a partir de células primarias desde cualquier órgano utilizando mutaciones genéticas específicas y el uso de AAV-Cas9, lo que hace que el sistema sea más robusto y estable. El sistema endógeno Cas9 permite utilizar otros nocauts genéticos. La principal desventaja de la metodología actual es el tiempo necesario para aislar y establecer el cultivo primario, así como el alto titer de partículas virales necesarias para transducir las células primarias. Sin embargo, esto podría superarse estandarizando el proceso de aislamiento para cada tipo de celda. El problema de requerir un diter viral alto aAV para una transducción eficiente podría aliviarse mediante el uso de la última generación de plásmidos cápside y ayudantes para envases virales y un mejor proceso de purificación.
En el futuro, un sistema AAV mejor y más eficiente podría ser diseñado y extrapolado in vivo para hacer modelos de tumores genéticamente modificados específicos de órganos. En conclusión, el establecimiento de las líneas celulares murinas mediante este enfoque servirá como una valiosa herramienta basada en el cultivo celular in vitro para probar varias hipótesis en el contexto de la oncología.
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Disclosures
M.S. forma parte del Consejo Asesor del Instituto de Biociencia, y Menarini Ricerche ha recibido fondos de investigación de Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics y Menarini Ricerche. M.S. también es cofundador de Medendi Medical Travel, y en los últimos 2 años, ha recibido honorarios de Menarini Ricerche y ADC Pharma. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Queremos agradecer al Dr. Daniel Gitler por proporcionarnos el plásmido pAd Delta 5 Helper. Este trabajo fue financiado por la Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (a ME), la Fundación Binacional de Ciencias De Estados Unidos-Israel (BSF, 2017323) (a ME y MS), la Asociación Israelí contra el Cáncer (ICA, 20170024) (a ME), la Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (a ME) y la Concern Foundation (#7895) (a ME). Beca: la beca Alon a ME y BGU Kreitman becas a SJ y MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
