Summary
Utveckling av murina modeller med specifika gener muterade i huvud-och halscancer patienter krävs för förståelsen av neoplasi. Här presenterar vi ett protokoll för in vitro-omvandling av primära murina tungan celler med ett Adeno-associerat virus-Cas9 system för att generera murina HNC cellinjer med specifika genomiska förändringar.
Abstract
Användning av primära normala epitelceller gör det möjligt att reproducerbart inducera genomiska förändringar som krävs för cellulär omvandling genom att införa specifika mutationer i onkogener och tumörsuppressorgener, med hjälp av klustrade regulatoriska interfördelade kort palindrom REPEAT (CRISPR)-baserad genredigeringsteknik hos möss. Denna teknik ger oss möjlighet att exakt efterlikna de genetiska förändringar som sker i mänskliga cancerformer med hjälp av möss. Genom att genetiskt omvandla murina primära celler, vi kan bättre studera cancerutveckling, progression, behandling, och diagnos. I denna studie, vi använde CRE-inducerbara Cas9 mus tungan epitelceller att möjliggöra genom redigering med Adeno-Associated virus (AAV) in vitro-. Specifikt, genom att förändra Kras, p53, och APC i normala tungan epitelceller, genererade vi en murin huvud och halscancer (HNC) cellinjer in vitro, som är tumörframkallande i uterustransplantat möss. Den metod som presenteras här beskriver i detalj hur man genererar HNC cellinjer med specifika genomiska förändringar och förklarar deras lämplighet för att förutsäga tumör progression i uterustransplantat möss. Vi föreställa sig att denna lovande metod kommer att vara informativ och användbar för att studera tumörbiologi och terapi av HNC.
Introduction
HNC är en vanlig malignitet över hela världen1. Modellering uppkomsten av HNC neoplasi är för närvarande vid en vetenskaplig vändpunkt2. Medan många genetiska mutationer har identifierats i HNC2,3,4 (t. ex. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, och RAS) de specifika kombinationer av genomiska förändringar som krävs i samförstånd för att inducera HNC förbli oklara.
Den nuvarande användningen av mänskliga HNC cellinjer har signifikant bidragit till att belysa mekanismerna i samband med patogenes och behandling3. Emellertid, studiet av mänskliga cellinjer i immunkomprometterade murina system har sina begränsningar, eftersom dessa system inte ta itu med in vivo neoplastiska processen, den roll som specifika genmutationer, och behandlingssvar i en immun mikromiljö. Därför är utveckling och etablering av murina cellinjer med specifika genetiska förändringar av största vikt för att studera hur olika gener bidrar till omvandlingsprocessen och för att testa nya molekyl-baserade terapier hos immunkompetenta möss.
Gen funktionsstudier inom biomedicinsk forskning har påverkats betydligt av framstegen inom DNA-redigeringstekniker, genom att införa dubbel-strand raster (DSBs), till exempel5. Dessa tekniker, inklusive användning av zink finger nukleaser, transkription Activator-liknande effektornukleaser, och klustrade regulatoriska interfördelade korta palindrom repetitioner (CRISPR/Cas9), möjliggöra manipulation av någon gen av intresse vid dess Locus. Den senaste CRISPR/Cas9 system består av en guide RNA (gRNA) som leder Cas9 Nuclease att generera en DSB på en specifik plats i genomet. Detta system har fått ett omfattande erkännande i att modifiera endogena gener i någon cell eller målvävnad, även i de mest traditionellt svårbehandlade organismerna5. Det har flera fördelar jämfört med andra system på grund av dess enkelhet, snabbhet och effektivitet.
I onkologi har CRISPR/CAS9 Technology uppfyllt behovet av att effektivt efterlikna cancerceller. För att etablera detta system i HNC, manipulerade vi potenta KRAS onkogen och två viktiga tumörsuppressorgener, APC och p536. Enligt GENIE databas7, denna kombination är sällsynt i HNC. RAS-mutationer (HRAS, NRAS och KRAS) förekommer i endast ~ 7% av alla HNC populationer. Dessa tumörer tenderar att vara resistenta mot terapi8,9.
Leverans av Cas9 och dess gRNA uppnås genom viral transduktion med antingen AAVs eller lentiviruses. Rekombinant AAV är ofta den föredragna metoden för att leverera gener till målceller på grund av dess höga titer, milt immunsvar, förmåga att transduce ett brett spektrum av celler, och övergripande säkerhet. Med hjälp av ett AAV-system har olika vävnadsspecifika mus cells linjer genererats, och nya cellinjer utvecklas fortfarande10,11,12. Men en effektiv genomisk redigering system som kan generera murina HNC cell linje modeller celler återstår att utvecklas. I denna studie, vi försökte utveckla en in vitro AAV-Cas9-baserade system för att omvandla primära murina tungan celler till en tumörframkallande tillstånd. Detta unika CRISPR/Cas9 Transformation Protocol och den etablerade tumör cellinjer kan användas för att bättre förstå biologi av HNC induceras av en mångfald av genomiska förändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Ben Gurion universitetet i Negev djuromsorg och användning kommittén. Djurförsök godkändes av IACUC (IL. 80-12-2015 och IL. 29-05-2018 (E)). Alla aspekter av djurförsök, bostäder och miljöförhållanden som används i denna studie var i enlighet med vägledningen för vård och användning av försöksdjur13.
1. Adeno-associerad virus produktion
- Dag 1: cell odling
- Utsäde 4 x 106 HEK293T celler per 14,5 cm plåt i 15 ml DMEM. Förbered 10 plattor för transfektion med Polyethylenimine (PEI) (1 μg/μL).
- Dag 2: transfektion av HEK293T celler med hjälp av PEI
- Ta bort media och föda upp med varm DMEM 1 h före transfektion.
- Förvärmningsmedel för transfektion och DMEM.
- Använd 10 μg av Plasmiden av ränta som innehåller AAV ITR (AAV pCM109 EFS CRE SG APC SG KRAS SG p53-KRAS HDR). 10 μg av AAV 2/9n kapsid plasmid (med rep genen av AAV2 och den Cap genen av AAV9, och 10 μg av hjälparen plasmid (paddelta F5 hjälpare) per pläterar (se bordlägga av material).
Obs: en ny generation av Helper plasmid-pAdDeltaF614,15,16 som också kan användas för AAV produktion är tillgänglig. - Blanda plasmiderna i 1 mL vanlig DMEM per platta. Tillsätt sedan 90 μL av Polyethylenimine (total plasmid: PEI-koncentration = 1:3) till plasmid-blandningen och Vortex kortfattat.
- Inkubera den PEI-plasmid DNA-blandningen i 20 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Tillsätt blandningen droppvis ovanpå HEK293T cellerna och överför plattorna till cellkulturen inkubator vid 37 ° c med 5% Co2 för 24 h.
- Dag 3: medelstor förändring efter transfektion
- Ta bort mediet helt och tillsätt 15 mL färskt DMEM.
- Dag 5: skörd av viruset
- Förbered en torr is/etanol bad.
- Samla cellerna med en cell skrapa och överföra dem till 50 mL rör (2 plattor per 50 mL rör).
- Spinn rören vid 800 x g i 15 min vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten från alla rören. Tillsätt 0,5 mL av lyseringsbufferten (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) per platta (dvs. 5 mL för 10 plattor) till det första röret. Omsuspendera cellerna och överför den totala volymen till nästa rör och Fortsätt tills det sista röret.
- Överför cellsuspensionen till ett nytt 50 mL-rör. Tvätta rören med samma volym av lyseringsbuffert (0,5 mL per platta) med samma överföringsmetod som beskrivs i steg 1.4.4.
- Ämne cellsuspensionen till tre omgångar ~ 10 min frys/Tina cykler mellan en torr is/etanol bad och en 37 ° c vattenbad. Vortex kort efter varje upptinning.
- Om reningen utförs på samma dag, Ställ in jämvikts och elutionsbuffert (se tabell 1 för receptet) vid RT.
- Tillsätt 50 enheter bensonas per tallrik och inkubera vid 37 ° c för 1,5 h.
Anmärkning: Benzonase används för att smälta kvarvarande nukleinsyror från värd producent celler och plasmid-DNA som finns i cellsuspensionen. - Snurra rören på 3 000 x g i 15 min vid 4 ° c.
- Samla supernatanten i en spruta med en 18 G stålnål och tryck lösningen genom ett 0,45 μm filter i en 15 mL tub för att få den råa lysate.
- Förvara den råa lysate vid 4 ° c i några veckor tills rening eller fortsätta rening.
2. AAV rening
- Dag 5 eller senare
- Placera jämvikts och elutionsbuffert vid RT.
- Tvätta kromatografikolonner med 10 mL av equilibrationbufferten.
- Tillsätt 0,5 ml per tallrik heparin-Agreste till kolonnen17 och tillsätt sedan jämvikts buffert (4x volymen av heparin-Agreste). Blanda lösningarna genom att invertera kolonnen och låt aguppstod sediment.
- Eluera equilibrationbufferten från kolonnen med tyngdkraften.
Obs: lämna några jämvikts buffert för att förhindra aguppstod från uttorkning. - Fyll på den råa lysatet på kolonnen och inkubera i 2 timmar vid 4 ° c med ständig agitation. Placera kolonnen i upprätt läge och låt Agros till sediment.
- Eluera den råa lysate av tyngdkraften.
- Tvätta kolonnen med jämvikts buffert (4x volymen av heparin-Agreste).
- Placera ett 100 kDa-centrifugalproteinfilter under kolonnen och eluera viruset med hjälp av en elutionsbuffert (3x volymen av heparin-againen) i filtret.
Anmärkning: elueringbufferten får inte överstiga 15 mL. - Centrifugera filtret på 3 000 x g för ~ 30 min tills mindre än 1 ml finns kvar i filtret.
- Fyll filtret med PBS och centrifugera vid 3 000 x g för ~ 30 min tills mindre än 1 ml finns kvar i filtret. Upprepa detta steg 2x för att ta bort alla salter.
- Koncentrera virus lösningen i filtret genom centrifugering vid 3 000 x g för att komma fram till en så liten volym som möjligt (mindre än 200 μl).
- Aspirera på virus lösningen med en nål och spruta och tryck lösningen genom ett 0,22 μm-filter i ett rör.
- Gör alikvoter av koncentrerade virala partiklar för lagring.
Anmärkning: alikvoter ska vara ~ 20 μL för korttidsförvaring vid 4 ° c och ~ 5 μL för långtidsförvaring vid-80 ° c. - Bestäm viral titer och viral signaltransduktion effektivitet som beskrivits tidigare14,18,19,20.
3. isolering och kultur av primära celler
- Dag 1
- Euthanize en 6-veckors gammal manlig eller kvinnlig B6; 129-gt (ROSA) 26SorTM1 (CAG-Cas9 *,-EGFP) Fezh/j av co2 kvävning eller något annat iacuc godkänt protokoll.
Obs: dessa CRISPR/Cas9 Knockin möss har CRE driver-beroende uttryck av Cas9 Endonuklease och egfp regisserad av en CAG promotor. Den uppströms LOX-Stop-LOX (LSL) sekvens som finns i genomet av dessa möss förhindra uttrycket av Cas9 och EGFP i avsaknad av CRE driver. När de används i kombination med Single guide RNAs (sgRNAs) och en CRE källa, de tillåter redigering av enstaka eller flera mus gener in vivo eller ex vivo14. - Dissekera tungan från euthanized möss med kirurgisk sax.
- Manuellt separera vävnaden genom att malning tungan vävnaden i mycket små fragment med hjälp av en skalpell. Samla upp vävnads fragmenten i ett 15 mL-rör innehållande 4,5 ml RPMI Plain medium (med ut-serum).
- Tillsätt den tredubbla enzym blandningen (200 μl) (se tabell 1 för receptet) till vävnads fragmenten.
- Inkubera vävnaden-enzym blandningen vid 37 ° c i 30 min och knacka på röret var 10 min för att förbättra enzymatisk dissociation av vävnaden.
- Tillsätt 5% fetalt bovint serum (FBS) innehållande HBSS/PBS till vävnads enzym blandningen för att stoppa enzym effekten.
- Filtrera ovanstående cellsuspension genom ett sterilt 70 μm nylonnät för att separera de spridda cellerna och större vävnads fragment.
- Tvätta den filtrerade cellsuspensionen genom centrifugering för 300 x g i 5 min i Hbss/PBS vid RT.
- Omsuspendera pelleten i odlingssubstrat (10% FBS i RPMI/DMEM) och odla i 60 mm kultur rätter tills distinkta cellkolonier bildas.
- Odlings cells aggregat behålls ovanpå filtret i en 60 mm kultur rätt som innehåller 3 mL komplett media (10% FBS i RPMI/DMEM) tills cellkolonier bildas.
- Mikroskopiskt undersöka de primära cellerna för förekomst av fibroblast förorening efter 1 veckas kultur. Behandla de primära celler som utvecklats från aggregat och cellsuspensioner med 0,25 trypsin 0,02% EDTA lösning vid 37 ° c för 1 min att ta bort fibroblaster.
Anmärkning: vanligtvis den primära kulturen från cell aggregat producerar fler kolonier jämfört med encellig suspensioner. Cellerna från dessa kolonier ger bättre transduktionseffektivitet med AAV-transduktion.
- Euthanize en 6-veckors gammal manlig eller kvinnlig B6; 129-gt (ROSA) 26SorTM1 (CAG-Cas9 *,-EGFP) Fezh/j av co2 kvävning eller något annat iacuc godkänt protokoll.
4. AAV-transduktion av primära celler
- Dag 10
- Utsäde 2 x 105 primära celler per brunn i 6 väl plattor i 2 ml komplett media (10% FBS i RPMI/DMEM).
- Nästa dag, transduce cellerna med 1012 viral genomet/ml (1010 transducing enheter/ml) och inkubera cellerna i viral partikel-innehållande media för 48 h vid 37 ° c.
- Ta bort de virala partikelinnehåll ande medierna och mata de AAV-omvandade cellerna med kompletta medier.
Obs: endast celler som genomgick transduktion kommer att uttrycka GFP och börja förökar sig. Celler som inte genomgick transduktion kommer så småningom att dö inom 2 veckor. - Efter 2 veckors kultur expansion, utsäde cellerna för validering och in vivo tumorigena experiment.
Anmärkning: genomisk DNA Frånaav-transduced celler och normala primära celler från Cas9 möss extraherades för validering av specifika genom redigering med hjälp av standardprotokoll. Sekvensering av det extraherade DNA och analys av sekvenserade data (tabell 2) utfördes med hjälp av en hybridisering Capture-baserade nästa generations sekvenserings analys (t. ex., msk-Impact plattform) som beskrivs tidigare21.
5. validering av omvandlingen av normala celler till tumorigena celler med hjälp av immunofluorescens och Western blotting
- Immunofluorescens
- Utsäde 2 x 105 celler på 12 mm glas täckband och placera dem i en inkubator över natten.
- Fix celler i 4% PARAFORMALDEHYD i PBS (pH = 7,4) och process för immunofluorescensteknik.
- Inkubera de fasta cellerna med den första primära antikroppen i 1% BSA eller 1% serum i PBST i en fuktad kammare för 1 h vid RT eller över natten vid 4 ° c. De primära antikropparna som används är kanin monoklonal anti-KRT 14, kanin monoklonal anti-E-cadherin antikropp, och Cas9 Mouse mAb.
- Ta bort den primära antikroppslösningen från täckglas genom att tvätta cellerna 3x i 5 min med 1x PBS.
- Inkubera cellerna med Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG och/eller Cy3 Goat anti-Mouse IgG sekundära antikroppar i 5% BSA i PBST för 1 h vid RT i mörker.
- Ta bort den sekundära antikroppslösningen från täckglas och tvätta cellerna 3x enligt beskrivningen i steg 5.1.4.
- Montera täckglas med en droppe monteringsmedel som innehåller DAPI (DAPI Fluoromount).
- Förvaras i mörker vid 4 ° c tills bilderna avbildas med fluorescensmikroskopi.
- Västlig blotting
- Utsäde 1 x 106 omvandlas celler i en 100 mm kultur skålen och placera dem i en inkubator över natten.
- Tvätta och skrapa de transformerade cellerna till 200 μl iskall PBS.
- Centrifugera röret som innehåller cellsuspensionen i 10 min vid 2 000 x g vid 4 ° c för att pelleten cellerna.
- Aspirera supernatanten och lysera cellerna med hjälp av lyseringsbuffert (se tabell 1) som innehåller cocktails av fosfatashämmare och en proteashämmare under 10 min vid 4 ° c. Centrifugera lysaterna i 10 min vid 10 000 x g och 4 ° c och samla upp de rensade lysaterna.
- Använd en kommersiellt tillgänglig Bradford assay kit för att bestämma protein koncentrationen efter tillverkarens protokoll. Använd 4x prov buffert (500 mM Tris pH = 6,8, 40% glycerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% bromfenolblått) för att justera proteinproverna till 0,5 eller 1 μg/μl. koka vid 96 ° c i 5 min.
Anm.: proverna kan förvaras vid-80 ° c eller tills en västerländsk blot-analys utförs. - Separata lika mängder av totalt lysat (30 μg) med 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektrofores (SDS-PAGE). Se till att färgen når botten av gelen. Överför proteinet till nylonmembranet genom halvtorr blotting vid 25 V i 30 min.
- Häll 5% BSA i Tris-buffrad saltlösning (TBS)-0,1% Tween (TBST) över membranet för att täcka det helt. Blockera membranet i 1 h vid RT. Inkubera mebrane med primära antikroppar (anti-CRE, anti-Cas9, anti-GFP, anti-β catenin, anti p53, anti-Phospho-erk, och anti-β aktin utspädd i 5% BSA tbst) vid 4 ° c över natten.
- Efter inkubering, tvätta membranen i 10 min med 1x TBST att se till att lösningen täcker membranet helt. Utför denna tvätt 3x, och tillsätt sedan pepparrots peroxidas (HRP)-konjugerad sekundär antikropp (utspädd 1:10000 i 5% BSA TBST) till membranet. Inkubera i 1 h vid RT.
- Efter inkubering, tvätta membranen i 10 min med 1x TBST att se till att lösningen täcker membranet helt. Utför av kemiluminiscensanalysatorn av Imaging (se tabell över material) för att exponera banden och ta bilder i enlighet med detta.
- Validering av den tumorigena potentialen hos transformerade celler hos immunkompetenta möss
Obs: möss upprätthölls och behandlades enligt de institutionella riktlinjerna från Ben-Gurion University of the Negev. Nicka. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (nickar. SCID) och C57BL/6-möss användes för in vivo-studierna. Möss var inrymt i luft-filtrerade laminärt flöde skåp med en 12 timmars ljus/mörker cykel och matades mat och vatten AD libitum.- Använd 6-8 veckor gammal kvinnlig Nick. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (nickar. SCID) och C57BL/6 möss för studien.
- Trypsinize AAV-Cas9 omvandlade celler. Stoppa trypsinization med DMEM föruppvärmd vid 37 ° c och samla i en 50 ml tub.
- Centrifugera röret vid 800 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i DMEM-mediet utan FBS. Utför centrifugering igen och Omsuspendera cellpelleten i 1x PBS.
Obs: Förvara inte cellerna i 1x PBS under alltför lång tid. Håll alltid cellsuspensionen på is för att förhindra cell klumpar. - Använd en automatisk cell räknare för att räkna cellerna och späd cellerna till önskad koncentration (2,5 x 107 celler/ml) med 1x PBS. Generera tumörer genom en subkutan injektion av AAV-Cas9 omvandlas cellsuspensionen i den högra flanken av varje NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr HSD (nickar. SCID) mus (2 x 106 celler/mus). För att generera en Writer modell i uterustransplantat möss, injicera 0,5 × 106 primära celler eller AAV-Cas9 omvandlas celler till tungan av C57BL/6 immunkompetenta möss.
- Euthanize djuren 2 veckor efter injektion av CO2 kvävning, och dissekera tumörer från euthanized möss för immunohistokemi analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda AAV-systemet för att omvandla normala Cas9-celler
Figur 1 ger en detaljerad vektor karta över den AAV transgenens-plasmid som används i denna studie. Figur 2 beskriver utformningen och arbetet av AAV-Cas9 baserat-system. För att producera virala partiklar, var de HEK293T cellerna transfekterade med AAV transgenens vektor och andra virala förpackningar vektorer med hjälp av Pei transfection metod. Efter transfektion, virusinfekterade celler samlades in och lyseras, och med hjälp av heparin-aguppstod reningsprocessen, var viruspartiklar renas och koncentrerad (figur 2A). Dessa renade virala partiklar användes för in vitro-omvandling av primära celler isolerade från Cas9 möss för att kontrollera effekten. I vårt system, är AAV transgenens Expression kassett införs genom homolog rekombination i CRE-beroende Cas9 Rosa26 inriktning mall inom musceller som bär en allestädande CAG promotor (pCAG), en LoxP-Stop-LoxP kassett (LSL), en Cas9 nukleasgenen, en självklyva P2A peptid, och reporter genen (EGFP) flankerad av två homolog armar14. Den CRE driver aktiviteten av de sensorik cellerna exciserar LSL och inducerar Cas9 och GFP uttryck (figur 2B). Cas9 Nuclease Activity introducerar en dubbel-strandad rast på målplatserna av intresse, riktade genom gRNAs, och hjälper till i genredigering. Den AAV system som används i denna studie hjälper till att leverera multiplexade grnas (sgrnas för KRAS, p53, och APC) och även i att uttrycka en onkogena KRASG12D allel genom homologi-riktad reparation (HDR) i de omvandlade cellerna.
Figur 1: vektor karta över den AAV transgenens-plasmid som används i denna studie. Detta AAV-system har en AAV-ryggrad som uttrycker CRE driver och tre U6-drivna sgRNAs som inriktar sig på KRAS, p53 och APC. Den innehåller också en KRAS G12D Homology-riktad reparation (HDR) givare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: design och bearbetning av ett AAV-Cas9-system för att omvandla normala celler. (A) Beskrivning av produktion och rening av AAV-partiklar från HEK293T efter transfecting dem med AAV transgenens och förpackning plasmider. B) viral transduktion av primära celler med AAV-partiklar och mekanismen genom vilken CRE-Dependent Cas9 Expression möjliggör CRISPR-redigering och omvandling av primära celler till tumorigena celler. En enda AAV-vektor som integrerar grnas för tre olika gener med en Knockin av KRAS G12D allel genom HDR med en CRE driver Expression-kassett levererades till CRE-beroende Cas9 mus primära celler. CRE driver aktivitet i de omvandade cellerna leder till excision av LoxP-Stop-LoxP-kassetten och inducerar Cas9 och GFP-uttryck. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Validering av AAV-Cas9-systemet in vitro i isolerade mus embryonala fibroblastceller
Primära mus embryonala fibroblast (MEF) celler har använts uteslutande för att studera konsekvenserna av genablation i cellulära tillväxt och proliferation22. För att validera effektiviteten hos AAV-Cas9-systemet vid omformning av normala celler, omvandlade vi MEF-celler isolerade från Cas9-möss (E14) med AAV. MEF-cellerna isolerades enligt beskrivningen tidigare23,24. MEFs från 14-dagars gamla Cas9 mus embryon användes eftersom de är lätta att odla och transduce in vitro-. I korthet, att omvandla MEFS via AAV-transduktion, primära MEFS vid cirka 30% sammanflödet ansågs redo för transduktion. En timme före Transduction ändrades MEF-kulturmedierna. Den renade AAV upptinades på is och MEF kultur Media var aspirerade. Viral supernatanten med en titer varierande från 106-1014 viral genomet/ml lades till varje brunn och inkuberades över natten vid 37 ° c. Den virala supernatanten avlägsnades efter 48 h, ersatt med 2 mL MEF odlingssubstrat, och sedan inkuberas vid 37 ° c tills GFP-uttryck, ca 5 dagar efter transduktion. GFP-uttrycker MEFs var subculodlade och validerade. Observera att för denna vektor fann vi att 1012 virala genom/ml (motsvarande 1010 transducing enheter/ml) effektivt kan omvandla primära MEF celler till tumörframkallande MEFS (figur 3A). De omvandade cellerna uttryckte CRE, Cas9 och GFP (figur 3B, C). För att få tillgång till den tumorigena potentialen hos AAV omvandlade MEF-celler, injicerades 0,5 x 106 celler (primär/AAV-TRANSDUCED MEF) i tungan, läpp, och subkutant i nod-scid möss. Transformerade celler bildade tumörer i dessa möss, jämfört med den primära MEF, som inte bildar tumörer (figur 3D-F).
Figur 3: validering och in vitro-omvandling av primära MEF-celler med hjälp av AAV-Cas9-systemet. A) Beskrivning av den in vitro-omvandling av fibroblaster från embryon som samlats in från Cas9 möss med AAV-partiklar. B) representativ immunofluorescensbild av primära MEF-och AAV-OMVANDADE MEF-celler som visar uttrycket för GFP, CRE och Cas9. DAPI användes för att färga kärnan. (C) Western blotting visar CRE, CAS9, GFP, och β-Actin i embryonala normala fibroblaster och genetiskt redigerade fibroblaster. (D) representativ bild av en tunga tumör som utvecklades i en nod-scid mus efter injicering med transformerade fibroblastceller. (E) representativ bild av en läpp tumör som bildas i en nod-scid mus efter injicering med transformerade fibroblastceller. Frepresentativ bild av en flank tumör som utvecklades i en nod-scid-mus efter injicering med transformerade fibroblastceller. Pilarna indikerar en tumör. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
In vitro-generering av den tumorigena murina tungan epitelcelllinjen från primära tungan epitelceller med hjälp av AAV-Cas9 systemet
Efter validering av omvandla egendom av AAV systemet med hjälp av MEF celler, isolerade vi primära tungan epitelceller från Cas9 möss och odlade dem in vitro-. Primär tunga celler var sensorik med AAV viruspartiklar (1010 CFU/ml), och efter en vecka celler började uttrycka GFP. Den tumorigena omvandlingen av primära tunga epitelceller (figur 4A) bekräftades med hjälp av immunofluorescens och Western blotting (figur 4B, C). De transformerade cellerna uppvisar förstärkt KRT 14, E-cadherin och GFP-uttryck (figur 4B). Den tumorigena omvandlingen av primär tungans epitelceller bekräftades genom uttrycket av GFP (dvs. det CRE-beroende uttrycket av Cas9 och GFP) (figur 4C). Uttrycket av KRT14 och E-cadherin bekräftar deras epitelceller egenskaper. Protein validering bekräftade förstärkt β-catenin, Phospho-erk, och minskat p53-uttryck (figur 4C), vilket indikerar en effektiv nedreglering av APC och p53 och införlivandet av muterade Kras i tungan celler, vilket gör dem tumorigenic. Genomisk analys genom djupsekvensering av DNA som isolerats från de transformerade cellerna bekräftade den effektiva gen redigeringen och ram förskjutningen av TP53-och APC-generna genom AAV-Cas9-systemet (tabell 2). Den tumorigena egenskapen för den AAV-omvandlade tungan cell linjen bedömdes ytterligare genom att injicera den i tungan av immunkompetenta vild typ C57BL/6 möss. Den omvandlade tungan celler, betecknas som KRAS mutant epitelceller i tungan (KRAS Mut EpT), bilda tumörer effektivt i C57BL/6 möss (figur 4D). KRAS Mut EpT tumörer utvärderades av en oral och käk patolog genom rutinmässig hematoxylin och eosin (H & E) färgning och immunohistokemi. Tumörerna uppvisade en spindel cells morfologi med framstående nukleär atypia: Pleomorfism, hyperchromatism, jätte kärnor, flera nukleolerna, och en hög mitotisk hastighet med atypiska mitotiska siffror. Perivaskulär invasion och angioinvasion noterades också. Dessa morfologiska egenskaper åtföljdes av mycket begränsad till obefintlig tumör-associerad inflammation. Immunohistokchemically, de neoplastiska cellerna var cytoplasmically positiva för E-cadherin och KRT 14, båda markörer för epitelial vävnad. KRT 14 är typiskt för skivepitelcancer epitel, stödja skivepitelcancer ursprung tumörceller och därmed diagnosen skivepitelcancer (figur 4E). Därför ger detta tillvägagångssätt en mångsidig metod för att omvandla primära celler in vitro med en önskad genförändring. Dessutom, denna metod underlättar användningen av dessa utvecklade cellinjer in vivo i uterustransplantat möss för bättre förståelse av neoplasi i en verklig tumör mikromiljö Milieu.
Figur 4: in vitro-omvandling av primära tunga epitelceller med hjälp av AAV-Cas9-systemet. Aschematisk representation av den in vitro-omvandling av normala epitelceller som erhållits från tungan hos Cas9 möss. B) representativ immunofluorescensbild av AAV-transduced tunga epitelceller som visar uttrycket av KRT14, E-cadherin och GFP. (C) Western blot visar Cas9, β-catenin, och Phospho-erk uprekling med p53 proteinnivå downregulation, visar de genetiskt redigerade epitelceller. (D) representativ bild av en tumör som utvecklats på tungan av de immunkompetenta möss efter injicering av dem med transformerade tungan epitelceller (KRAS Mut EpT). (E) representativa bilder av tumör vävnad sektioner för H & E, e-cadherin, och Krt 14 färgning vid 20x och 40x förstoring. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Celllysis buffert för viral skörd | Volym |
| 150 mM NaCl | 876.6 mg |
| 50 mM Tris-HCl | 605.7 mg |
| Använd HCl för att justera pH 8,5 | |
| Vatten av molekylär kvalitet | Gör upp till 100 mL |
| Equilibration buffert | |
| 1 mM MgCl2 | 9,52 mg |
| 2,5 mM KCl | 18,64 mg |
| Blanda alla i PBS 1X och justera pH till 7,2 | Gör upp till 100 mL |
| Elueringbuffert | |
| 0,5 M NaCl | Mer från 2,92 g |
| Blanda alla i PBS 1X och justera pH till 7,2 | Gör upp till 100 mL |
| 10X Triple enzym stamlösning: | |
| Kollagenas från | 1 g slutlig konc. [10 mg/ml] |
| Hyaluronidase | 100 mg [1 mg/ml] |
| DNAS | 20 000 enheter slutlig konc. [200 mg/ml] |
| PBS 1X | Gör upp till 100 mL |
| Plasmid mix (för en 14,5 cm plåt) | |
| AAV pCM109 EFS CRE SG APC SG KRAS SG p53-KRAS HDR | 10μg |
| AAV 2/9 kapsid vektor | 10μg |
| pAD delta F5 Helper | 10μg |
| PEI (1 μg/μl lager) | 90 μl |
| DMEM | 1 mL |
Tabell 1: recept på buffertar som används i denna studie.
Tabell 2: data för genomanalys av KRAS Mut EpT-celler. Vänligen klicka här för att se denna tabell (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera metoder har tidigare använts för att omvandla primära celler i kulturen med varierande grad av framgång25,26,27,28. De flesta av dessa metoder använder mus fibroblast celler för omvandling14,17,18,19 eller använda cancerframkallande ämnen såsom 4-nitrokinolin-1-oxid (4-nqo)21,22 för att utveckla murina cellinjer modeller. Användning av knockout och transgena musmodeller har också kraftigt förbättrat vår förståelse av de olika molekylära vägar som styr utvecklingen och differentieringen av HNC. Användning av murin oral epitelial cellinjer med ett unikt genetiskt mönster skulle säkerligen komplettera dessa studier, och deras efterföljande biokemiska analyser skulle bidra till behandling och diagnos av HNC. Emellertid, endast ett fåtal rapporter har beskrivit inrättandet av mus muntliga epitelceller28,29,30,31,32,33 och dessa cellinjer är inte i utbredd användning.
Den största begränsningen av dessa murina muntliga epitelcellinjer är att de inte kännetecknas i stor utsträckning på molekylär nivå och konstaterades för att uttrycka ovanliga gen mönster. Således, den begränsade molekylära förståelsen av dessa murina cellinjer modeller och avsaknaden av en effektiv metodik fick oss att utnyttja den unika potentialen hos AAV-CRISPR genom redigering teknik i Cas9 Knock-in möss för att upprätta murina cellinjer med specifika genförändringar. I denna studie introducerade och utvecklade vi ett in vitro AAV-Cas9-system för att omvandla primära murina celler till ett tumorigent tillstånd för att bekräfta de genetiska förändringar som ger upphov till cancerceller. Vi har framgångsrikt etablerat murina tungan epitelceller med specifika genmutationer med hög verkningsgrad med hjälp av AAV-medierad CRISPR-inducerad somatisk genredigering av flera sgRNA kombinationer.
Denna metod erbjuder en ny experimentell metod för att bättre förstå den cell-autonoma etiologin för HNC. Börjar med murina primära tungan epitelceller, vi kunde omvandla sådana celler till tumorigenicitet genom att ta bort en begränsad uppsättning av gener och införa en enda KRAS mutation. Med hjälp av denna metod är det nu möjligt att undersöka om andra gener som är kända för att vara inblandade i andra karcinom kan producera maligniteter som närmare liknar HNC. De morfologiska egenskaperna hos tumörerna från KRAS Mut EpT bekräftade skivepitelcancer. Den histopatologiska analysen av KRAS Mut EpT-tumörer i uterustransplantat-möss är förknippad med och stödjande av det aggressiva biologiska beteendet hos huvud-och halscancer. Sålunda, det kan vara möjligt att koppla genotyper av cancerceller till specifika kliniska och histopatologiska funktioner i tumörerna.
De främsta fördelarna med denna metodik är förmågan att utveckla cellinjer från primära celler från alla organ med hjälp av specifika genmutationer och användningen av AAV-Cas9, vilket gör systemet mer robust och stabilt. Det endogena Cas9 systemet gör det möjligt att använda andra genknockouts. Den största nackdelen med den nuvarande metoden är den tid som krävs för att isolera och fastställa den primära kulturen samt den höga titern av virala partiklar som behövs för att transduce de primära cellerna. Detta kan dock lösas genom att standardisera isolerings processen för varje celltyp. Problemet med att kräva en hög AAV viral titer för effektiv transduktion kunde lindras genom användning av den senaste generationen av kapsid och hjälpare plasmider för viral förpackning och en bättre reningsprocess.
I framtiden kan ett bättre och effektivare AAV-system utformas och extrapoleras in vivo för att göra organspecifika genetiskt modifierade tumörmodeller. Sammanfattningsvis kommer upprättandet av murina cellinjer genom detta tillvägagångssätt att fungera som en värdefull in vitro-cellkultur-baserat verktyg för att testa flera hypoteser i samband med onkologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MS är på den rådgivande nämnden för Bioscience Institute, och Menarini Ricerche har fått forskningsmedel från Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics och Menarini Ricerche. MS är också en av grundarna av medendi Medical Travel, och under de senaste 2 åren, har fått arvoden från Menarini Ricerche och ADC Pharma. Alla andra författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka doktor Daniel Gitler för att förse oss med pAd delta 5 Helper plasmid. Detta arbete finansierades av Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (för mig), USA-Israel binational Science Foundation (BSF, 2017323) (för mig och MS), The Israel cancer Association (ICA, 20170024) (för mig), Israel cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (för mig), och oro Foundation (#7895) (för mig). Fellowship: Alon Fellowship till mig och BGU kreitman stipendier till SJ och MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
| Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
| Cre | BioLegend | 900901 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
| Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
| GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
| β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
| β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
| Cell lines | |||
| HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
| Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
| BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
| DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
| DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
| ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
| FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Heparin - Agarose | Sigma | H6508 | |
| Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
| MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
| NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
| PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
| PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
| Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
| Enzymes | |||
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
| Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
| Glass wares | |||
| Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
| Slides | Bar Naor | BN9308C | |
| Mouse strains | |||
| C57BL/6 | Envigo | ||
| B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
| NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
| Plasmids | |||
| AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
| AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
| pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
| Plastic wares | |||
| Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
| 0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
| 0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
| Culture plates | Greiner Bio-One | ||
| Falcon tubes | Greiner Bio-One |
References
- Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
- Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
- Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
- Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
- AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
- Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
- Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
- Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
- Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
- Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
- Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
- Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
- Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
- Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
- Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
- Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
- Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
- Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
- Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
- Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
- Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
- He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).
