Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması

Published: January 9, 2020 doi: 10.3791/60410
* These authors contributed equally

Summary

Neoplazi anlayışı için baş ve boyun kanseri hastalarında mutasyona uğramış spesifik genler ile murine modellerinin geliştirilmesi gereklidir. Burada, belirli genomik değişikliklerile murine HNC hücre hatları oluşturmak için adeno-ilişkili bir virüs-Cas9 sistemi kullanarak primer minür dil hücrelerinin in vitro dönüşümü için bir protokol salıyoruz.

Abstract

Primer normal epitel hücrelerinin kullanımı, onkogenlerde ve tümör baskılayıcı genlerde spesifik mutasyonlar getirerek hücresel dönüşüm için gerekli genomik değişiklikleri tekrarlanabilir bir şekilde tetiklemelerini mümkün kılar. farelerde kısa palindromik tekrar (CRISPR) tabanlı genom düzenleme teknolojisi. Bu teknoloji, fare kullanarak insan kanserlerinde meydana gelen genetik değişiklikleri doğru bir şekilde taklit etmemizi sağlar. Genetik olarak murine primer hücreleri dönüştürerek, daha iyi kanser gelişimi, ilerleme, tedavi ve tanı inceleyebilirsiniz. Bu çalışmada, adeno ilişkili virüs (AAV) in vitro kullanarak genom düzenleme sağlamak için Cre-indüklanabilir Cas9 fare dil epitel hücreleri kullanılır. Özellikle, normal dil epitel hücrelerinde KRAS, p53 ve APC değiştirerek, biz bir murine baş ve boyun kanseri üretti (HNC) in vitro hücre hattı, hangi syngeneic farelerde tümörijenik. Burada sunulan yöntem, belirli genomik değişikliklerle HNC hücre hatlarının nasıl üretilebildiğini ayrıntılı olarak açıklar ve sinjenezik farelerde tümör ilerlemesini tahmin etmeye uygunluklarını açıklar. Bu umut verici yöntemin hnc tümör biyolojisi ve tedavisi için bilgilendirici ve yararlı olacağını öngörüyoruz.

Introduction

HNC dünya çapında yaygın bir malignitedir1. HNC neoplazi sinin oluşumunun modelleştirilmesi şu anda bilimsel bir dönüm noktasında2. HNC2,3,4 (örneğin, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 ve RAS) birçok genetik mutasyon tespit edilmiş olsa da, HNC indüklemek için konser de gerekli genomik değişikliklerin belirli kombinasyonları belirsizliğini koruyor.

İnsan HNC hücre hatlarının mevcut kullanımı önemli ölçüde patogenez ve tedavi ile ilişkili mekanizmaları naçıklığa kavuşturmak için yardımcı oldu3. Ancak, immün azat lı murine sistemlerinde insan hücre hatlarının incelenmesinin sınırlamaları vardır, çünkü bu sistemler in vivo neoplastik prosese, spesifik gen mutasyonlarının rolüne ve immün mikroortamdaki tedavi yanıtlarına hitap etmez. Bu nedenle, farklı genlerin dönüşüm sürecine nasıl katkıda bulundugunu incelemek ve immünyonlu farelerde yeni molekül temelli tedavileri test etmek için spesifik genetik degistirimlere sahip murin hücre hatlarınin geliþimi ve kurulmasý birincil öneme sahiptir.

Biyomedikal araştırmalarda gen fonksiyon çalışmaları, örneğin5,çift iplikçikli sonları (DSBs) tanıtarak, DNA düzenleme teknolojilerinde gelişmelerden önemli ölçüde etkilenmiştir. Çinko parmak nükleazlarının kullanımı, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar ve kümelenmiş düzenleyici aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR/Cas9) dahil olmak üzere bu teknolojiler, çekirgesinde ilgi çeken herhangi bir genin manipülasyonuna olanak sağlar. En son CRISPR/Cas9 sistemleri, Cas9 nükleazını genomdaki belirli bir bölgede DSB oluşturmak üzere yönlendiren bir kılavuz RNA'dan (gRNA) oluşur. Bu sistem, en geleneksel olarak tedavi edilmesi en zor organizmalar5'te bile, herhangi bir hücre veya hedef dokudaki endojengenlerindeğiştirilmesinde geniş bir tanıma kazanmıştır. Sadeliği, hızı ve verimliliği sayesinde diğer sistemlere göre birden fazla avantajı vardır.

Onkolojide CRISPR/CAS9 teknolojisi kanser hücrelerini etkin bir şekilde taklit etme ihtiyacını karşılamıştır. HNC bu sistemi kurmak için, biz güçlü KRAS onkogen ve iki önemli tümör baskılayıcı genler, APC ve p536manipüle. GENIE veritabanı7göre, Bu kombinasyon HNC nadirdir. RAS mutasyonları (HRAS, NRAS ve KRAS) tüm HNC popülasyonlarının sadece ~%7'sinde mevcuttur. Bu tümörler tedaviye dirençli olma eğilimindedir8,9.

Cas9 ve gRNA'sının teslimi, aav veya lentivirüsler kullanılarak viral transdüksiyon yoluyla sağlanır. Rekombinant AAV genellikle yüksek titreşme, hafif bağışıklık yanıtı, geniş bir hücre yelpazesi nekadar bilgi verme yeteneği ve genel güvenlik sayesinde genleri hedef hücrelere ulaştırmak için tercih edilen bir yöntemdir. Bir AAV sistemi kullanılarak, çeşitli dokuya özgü fare hücre hatları oluşturuldu ve yeni hücre hatları halageliştiriliyor 10,11,12. Ancak, murine HNC hücre hattı modelleri hücreleri üretebilir verimli bir genomik düzenleme sistemi geliştirilmeye devam etmektedir. Bu çalışmada, primer minyon dil hücrelerini tümörijenik duruma dönüştürmek için in vitro AAV-Cas9 tabanlı bir sistem geliştirmeye çalıştık. Bu eşsiz CRISPR/Cas9 dönüşüm protokolü ve kurulan tümör hücre hattı, genomik değişikliklerin çeşitliliğiile indüklenen HNC'nin biyolojisini daha iyi anlamak için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma Negev Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Ben Gurion Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvan deneyleri IACUC (IL.80-12-2015 ve IL.29-05-2018(E)) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan hayvan testleri, barınma ve çevre koşullarının tüm yönleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak hazırlanmıştır13.

1. Adeno ile ilişkili virüs üretimi

  1. 1. Gün: Hücre kültürü
    1. DMEM'in 15 mL'sinde 14,5 cm plaka başına 4 x 106 HEK293T hücre tohumu. Polietilenmin (PEI) (1 μg/μL) ile transfeksiyon için 10 tabak hazırlayın.
  2. 2. Gün: PEI kullanarak HEK293T hücrelerinin transfeksiyonu
    1. Transfeksiyondan önce ortamı çıkarın ve sıcak DMEM 1 saat ile yeniden besleyin.
    2. Prewarm transfeksiyon reaktifleri ve DMEM.
    3. AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 g AAV 2/9n capsid plazmid içeren ilgi plazmid 10 g kullanın (AAV2 rep geni ve AAV9 kapak geni ile, ve plaka başına yardımcı plazmid (pAdDelta F5 yardımcı) 10 μg (Bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Yardımcı plazmid yeni nesil - pAdDeltaF614,15,16 da AAV üretimi için kullanılabilir.
    4. Plazmidleri tabak başına 1 mL düz DMEM ile karıştırın. Daha sonra plazmid karışımına ve girdabına 90 μL polietilenin (toplam plazmid: PEI konsantrasyonu = 1:3) ekleyin.
    5. PEI-plazmid DNA karışımını oda sıcaklığında 20 dakika (RT) kuluçkaya yatırın.
    6. Karışımı HEK293T hücrelerinin üzerine damla şeklinde ekleyin ve plakaları 37 °C'de hücre kültürü kuluçka makinesine 24 saat için %5 CO2 ile aktarın.
  3. 3. Gün: Transfeksiyon sonrası orta değişim
    1. Ortamı tamamen çıkarın ve 15 mL taze DMEM ekleyin.
  4. Gün 5: Virüs Hasat
    1. Kuru buz/etanol banyosu hazırlayın.
    2. Hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayın ve 50 mL tüpler (50 mL tüp başına 2 plaka) içine aktarın.
    3. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 800 x g'de dönme tüpleri.
    4. Tüm tüplerden supernatant atın. Sadece ilk tüpe 0,5 mL lysis tamponu (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) plaka başına (yani 10 plaka için 5 mL) ekleyin. Hücreleri yeniden askıya alın ve toplam hacmi bir sonraki tüpe aktarın ve son tüpe kadar devam edin.
    5. Hücre süspansiyonuna yeni bir 50 mL tüp aktarın. 1.4.4 adımda açıklandığı gibi aynı aktarım yöntemini kullanarak tüpleri aynı lysis tamponu hacmiyle (plaka başına 0,5 mL) yıkayın.
    6. Hücre süspansiyonuna kuru buz/etanol banyosu ile 37 °C su banyosu arasında ~10 dk dondurma/çözülme döngüleri üç tur akıtın. Her çözülmeden kısa bir süre sonra girdap.
    7. Arınma aynı gün yapılırsa, rt'de denge ve elüsasyon arabelleği (tarif için Tablo 1'e bakınız) ayarlayın.
    8. Plaka başına 50 adet benzonaz ekleyin ve 37 °C'de 1,5 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Benzonaz, konak üretici hücrelerinden kalan nükleik asitleri ve hücre süspansiyonunda bulunan plazmid DNA'sını sindirmek için kullanılır.
    9. Tüpleri 3.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de döndürün.
    10. Supernatant'ı 18 G çelik iğne kullanarak şırıngada toplayın ve çözeltiyi 0,45 m'lik bir filtreden 15 mL'lik bir tüpe geçirerek kaba bir şekilde elde edin.
    11. Ham lysate'yi arınmaya veya arınmaya devam edene kadar birkaç hafta 4 °C'de saklayın.

2. AAV arıtma

  1. 5. gün veya sonrası
    1. Rt'ye denge ve elüsasyon arabelleği yerleştirin.
    2. Kromatografi kolonlarını 10 mL lik denge tamponu ile yıkayın.
    3. Sütun17'ye heparin-agarose plakası başına 0,5 mL ekleyin ve sonra denge tamponu ekleyin (heparin-agarose'un hacmi 4 kat). Kolon ters çevirerek çözeltileri karıştırın ve agarose tortu sağlar.
    4. Yerçekimi tarafından sütundan denge tampon elute.
      NOT: Agarose'un kurumasını önlemek için bazı denge tamponu bırakın.
    5. Ham lysate'yi kolona yükleyin ve 4 °C'de 2 saat boyunca sürekli ajitasyon la kuluçkaya yatırın. Dik bir konuma sütun getirin ve çökelti agarose sağlar.
    6. Yerçekimi ile ham lysate elute.
    7. Kolon denge tamponu (heparin-agarose hacmi 4x) ile yıkayın.
    8. Sütunun altına 100 kDa santrifüj protein filtresi yerleştirin ve bir elüsyon tamponu (heparin-agarose hacmi3 kat) kullanarak virüsü filtreye aşındırın.
      NOT: Elüsyon arabelleği 15 mL'yi geçmemelidir.
    9. Filtrede 1 mL'den az kalana kadar filtreyi ~30 dk için 3.000 x g'de santrifüj edin.
    10. Filtrede 1 mL'den az kalana kadar filtreyi ~30 dk için 3.000 x g'de PBS ve santrifüj ile doldurun. Tüm tuzları kaldırmak için bu adımı 2x tekrarlayın.
    11. Virüs çözeltisini 3.000 x g'de santrifüj ile filtreye yoğunlaştırarak mümkün olduğunca küçük bir hacme (200°L'den az) ulaşın.
    12. Bir iğne ve şırınga ile virüs çözeltisi aspirate ve bir tüp içine 0,22 μm filtre ile çözüm itin.
    13. Depolama için konsantre viral parçacıkların aliquots olun.
      NOT: Aliquots 4 °C'de kısa süreli depolama için ~20 μL ve -80 °C'de uzun süreli depolama için ~5 μL olmalıdır.
    14. Daha önce açıklandığı gibi viral titre ve viral transdüksiyon verimliliğini belirlemek14,18,19,20.

3. Birincil hücrelerin izolasyonu ve kültürü

  1. 1. Gün
    1. 6 haftalık erkek veya kadın B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J co2 boğulma veya başka bir IACUC onaylı protokol ile ötenazi.
      NOT: Bu CRISPR/Cas9 knockin fareler, cag organizatörü tarafından yönetilen cas9 enonukleaz ve EGFP'nin Cre rekombinaza bağımlı ifadesine sahiptir. Bu farelerin genomunda bulunan yukarı Lox-Stop-Lox (LSL) dizisi Cre rekombinaz yokluğunda Cas9 ve EGFP ekspresyonunu engeller. Tek kılavuz RNA (sgRNA) ve Cre kaynağı ile birlikte kullanıldığında, onlar vivo veya ex vivo14tek veya birden fazla fare genlerinin düzenlenmesine izin verir.
    2. Cerrahi makas kullanarak ötenazi liyatatan dili ayırın.
    3. Neşter kullanarak dil dokusunu çok küçük parçalara ayırarak dokuyu elle ayırın. Doku parçalarını 4.5ml RPMI düz orta (dışarı serum ile) içeren 15 mL tüp içinde toplayın.
    4. Doku parçalarına üçlü enzim karışımını (200 μl) (tarif için Tablo 1'e bakın) ekleyin.
    5. Doku-enzim karışımını 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve dokunun ve dokunun ve dokunun.
    6. Enzim intiamını durdurmak için doku-enzim karışımına HBSS/PBS içeren %5 fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
    7. Dağılmış hücreleri ve daha büyük doku parçalarını ayırmak için yukarıdaki hücre süspansiyonuna steril 70 μm naylon örgü ile filtre uygulayın.
    8. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 300 x g için 5 dk'lık HBSS/PBS'de RT'de santrifüj ile yıkayın.
    9. Kültür ortamındaki peleti yeniden askıya alın (RPMI/DMEM'de %10 FBS) ve farklı hücre kolonileri oluşana kadar 60 mm kültür yemeklerinde büyür.
      1. Hücre kolonileri oluşana kadar 3 mL tam ortam (%10 FBS) içeren 60 mm'lik bir kültür kabında filtrenin üstünde tutulan kültür hücresi agregaları.
    10. 1 haftalık kültürden sonra fibroblast kontaminasyonu için birincil hücreleri mikroskopik olarak inceleyin. Fibroblastları gidermek için 37 °C'de 37 °C'de %0,25 tripsin %0,02 EDTA çözeltisi ile agregalardan ve hücre süspansiyonlarından geliştirilen birincil hücreleri tedavi edin.
      NOT: Genellikle hücre agregalarından elde edilen birincil kültür, tek hücreli süspansiyonlara göre daha fazla koloni üretir. Bu kolonilerden hücreler AAV transdüksiyonu ile daha iyi transdüksiyon verimi sağlar.

4. Primer hücrelerin AAV transdüksiyonu

  1. 10. Gün
    1. Tohum 2 x 105 ana hücreleri tam medya 2 mL 6 kuyu plakaları iyi başına (RPMI/ DMEM% 10 FBS).
    2. Ertesi gün, 1012 viral genom/mL (1010 transducing birimleri/mL) ile hücreleri aktarın ve 37 °C'de 48 saat viral parçacık içeren ortamdaki hücreleri kuluçkaya yatırın.
    3. Viral parçacık içeren ortamı çıkarın ve AAV'den geçirilen hücreleri tam ortamla besleyin.
      NOT: Sadece transdüksiyon geçirmiş hücreler GFP ifade eder ve çoğalmaya başlar. Transdüksiyon geçirmeyen hücreler 2 hafta içinde ölür.
    4. Kültür genişleme 2 hafta sonra, doğrulama ve in vivo tümörijenik deneyler için hücreleri tohum.
      NOT: Standart protokoller kullanılarak spesifik genom düzenlemenin doğrulanması için AAV transdükse hücrelerinden ve Cas9 farelerinden normal primer hücrelerden genomik DNA çıkarıldı. Çıkarılan DNA'nın dizilendirilmesi ve sıralı verilerin analizi(Tablo 2)daha önce açıklandığı gibi bir hibridizasyon yakalama tabanlı yeni nesil sıralama testi (örneğin, MSK-IMPACT platformu) kullanılarak yapılmıştır21.

5. İmmünfluoresans ve batı lekeleme kullanarak normal hücrelerin tümörijenik hücrelere dönüşümünün doğrulanması

  1. İmmünofloresans
    1. 12 mm cam kapaklı 2 x 105 hücre yiyerek bir gece kuvöze yerleştirin.
    2. PBS'de %4 paraformaldehitteki hücreleri düzeltin (pH = 7.4) ve immünoresans etiketleme işlemi.
    3. Sabit hücreleri % 1 BSA'da ilk primer antikorveya PBST'de %1 serum içeren sabit hücreleri, RT'de 1 saat nemli bir odada veya 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. Kullanılan birincil antikorlar tavşan monoklonal anti-KRT 14, tavşan monoklonal anti-E-kadherin antikor ve Cas9 fare mAb'dir.
    4. Hücreleri 1x PBS ile 5 dk boyunca 3x yıkayarak kapaklardan birincil antikor çözeltisini çıkarın.
    5. Cy3 eşek anti-tavşan IgG ve / veya Cy3 keçi anti-fare IgG ikincil antikorlar ile hücreleri kuluçka 5% BSA PBST için 1 saat rt karanlıkta.
    6. İkincil antikor solüsyonu kapaklardan çıkarın ve 5.1.4 adımda açıklandığı gibi hücreleri 3kat yıkayın.
    7. DaPI (DAPI Fluoromount) içeren montaj ortamı bir damla ile kapakları monte.
    8. Slaytlar floresan mikroskobu kullanılarak görüntülene kadar 4 °C'de karanlıkta saklayın.
  2. Batı lekeleme
    1. Tohum 1 x 106 dönüştürülmüş hücreleri 100 mm kültür çanağı içinde ve bir gece kuvözde yerleştirin.
    2. Dönüştürülmüş hücreleri 200 μl buz gibi PBS'ye yıkayın ve kazıyın.
    3. Hücreleri peletlemek için 4 °C'de 2.000 x g'de 10 dk hücre süspansiyonu içeren tüpü santrifüj edin.
    4. Fosfataz inhibitörü kokteylleri ve 4 °C'de 10 dakika proteaz inhibitörü içeren lysis tamponu (bkz. Tablo 1)kullanarak hücreleri aspire edin ve hücreleri lyse. 10.000 x g ve 4 °C'de 10 dk için lysate santrifüj ve temizlenmiş lysates toplamak.
    5. Üreticinin protokolünü izleyerek protein konsantrasyonu belirlemek için ticari olarak kullanılabilir bir Bradford test kiti kullanın. Protein örneklerini 0,5 veya 1 μg/μL'ye ayarlamak için 4x numune tamponu (500 mM Tris pH = 6.8 = %40 gliserol, %8 SDS, %20 H2O, %0.02 bromofenol mavisi) kullanın.
      NOT: Numuneler -80 °C'de veya Batı leke analizi yapılana kadar saklanabilir.
    6. %10 sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) ile eşit miktarda toplam lizat (30 μg) ayrı ayrı dır. Boyanın jelin dibine ulaştığından emin olun. Proteini 30 dk boyunca 25 V'de yarı kuru lekelerle naylon membrana aktarın.
    7. Tris-tamponlu salin (TBS)-0.1% Tween (TBST) tamamen kapsayacak şekilde membran üzerine% 5 BSA dökün. Membranı 1 saat boyunca tökezleyin. Mebrane'yi bir gecede primer antikorlarla (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, anti-β catenin, anti p53, anti-fosfo-ERK ve anti-β aktin %5 BSA TBST'de seyreltilmiş) inkütam.
    8. Kuluçkadan sonra membranları 10 dakika boyunca 1x TBST ile yıkayın ve çözeltinin membranı tamamen kapladığından emin olun. Bu yıkama 3x gerçekleştirin ve sonra membrana horseradish peroksidaz (HRP)-konjuge ikincil antikor (seyreltilmiş 1:10.000% 5 BSA TBST) ekleyin. RT'de 1 saat kuluçka.
    9. Kuluçkadan sonra membranları 10 dakika boyunca 1x TBST ile yıkayın ve çözeltinin membranı tamamen kapladığından emin olun. Bantları ortaya çıkarmak için chemiluminescence görüntüleme (bkz. Malzemeler Tablosu)gerçekleştirin ve buna göre görüntüleri yakalayın.
  3. İmmünyetersiz farelerde dönüştürülmüş hücrelerin tümörijenik potansiyelinin doğrulanması
    NOT: Fareler Negev Ben-Gurion Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine göre bakım ve tedavi edildi. Nod. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. In vivo çalışmalarda SCID) ve C57BL/6 fareler kullanıldı. Fareler 12 saatlik ışık/karanlık döngüsü ile hava filtreli laminar akış dolaplarında yer aldı ve yiyecek ve su reklamı libitum ile beslendi.
    1. 6-8 haftalık kadın NOD kullanın. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Çalışma için SCID) ve C57BL/6 fareler.
    2. AAV-Cas9 dönüştürülmüş hücreleri trypsize. 37 °C'de önceden ısınmış DMEM kullanarak tripsinizasyonu durdurun ve 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
    3. Tüpü 800 x g'de 10 dk oda sıcaklığında santrifüj edin. Supernatant atın ve FBS olmadan DMEM ortamda hücre pelet resuspend. Santrifüjü tekrar gerçekleştirin ve hücre peletini 1x PBS'de yeniden askıya alın.
      NOT: Hücreleri 1x PBS'de çok uzun süre tutmayın. Hücre kümelenmesini önlemek için hücre süspansiyonuna her zaman buz üzerinde tutun.
    4. Hücreleri saymak ve hücreleri istenilen konsantrasyona (2,5 x 107 hücre/mL) 1x PBS kullanarak seyreltmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Her NOD sağ kanadında AAV-Cas9 dönüştürülmüş hücre süspansiyon bir deri altı enjeksiyon uğrama ile tümörler oluşturmak. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) fare (2 x 106 hücre/fare). Syngeneic farelerde bir ortotropik model oluşturmak için, enjekte 0.5 × 106 birincil hücreler veya AAV-Cas9 C57BL / 6 immünobeceriksiz farelerin dil içine hücreleri dönüştürülmüş.
    5. Co2 boğulma ile enjeksiyondan sonra hayvanları ötenazi yapın ve immünohistokimya analizi için ötenazi yapılan farelerdeki tümörleri inceleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normal Cas9 hücrelerini dönüştürmek için AAV sistemini kullanma
Şekil 1 bu çalışmada kullanılan AAV transgen plazmidinin ayrıntılı bir vektör haritasını sunmaktadır. Şekil 2, AAV-Cas9 tabanlı sistemin tasarımını ve çalışmasını özetler. Viral parçacıklar üretmek için HEK293T hücreleri PEI transfeksiyon yöntemi kullanılarak AAV transgen vektörü ve diğer viral ambalaj vektörleri ile transfeced edildi. Transfeksiyondan sonra virüs içeren hücreler toplanıp lysed edildi ve heparin-agarose arıtma işlemi kullanılarak viral parçacıklar saflaştırıldı ve yoğunlaştı(Şekil 2A). Bu saflaştırılmış viral parçacıklar, cas9 farelerinden izole edilen birincil hücrelerin in vitro dönüşümünde etkinliğini kontrol etmek için kullanılmıştır. Bizim sistemimizde, AAV transgen ekspresyon kaseti, her yerde bulunan CAG organizatörü (pCAG), Bir LoxP-Stop-LoxP kaseti (LSL), Cas9 çekirdek geni, kendi kendini yarık P2 peptid ve iki homologkollartarafından kuşatılmış gen muhabiri (EGFP) taşıyan fare hücreleri içinde Cre bağımlı Cas9 Rosa26 hedefleme şablonuna homolog rekombinasyon yoluyla tanıtılır. Transekneden hücrelerin Cre rekombinaz aktivitesi LSL'yi uyarır ve Cas9 ve GFP ekspresyonunu tetikler (Şekil 2B). Cas9 nükleaz aktivitesi, hedef ilgi alanlarında, gRNA'lar aracılığıyla yönlendirilen çift iplikli bir kopuşa neden olur ve gen düzenlemede yardımcı olur. Bu çalışmada kullanılan AAV sistemi, transdükse hücrelerde çokkatlı gRNA'ların (KRAS, p53 ve APC için sgRNA'lar) sağlanmasına ve ayrıca homolojiye yönelik onarım (HDR) yoluyla onkojenik KRASG12D alelinin ifade edilmesinde yardımcı olur.

Figure 1
Şekil 1: Bu çalışmada kullanılan AAV transgen plazmidinin vektör haritası. Bu AAV sistemi Cre rekombinaz ve KRAS, p53 ve APC hedefleyen üç U6 odaklı sgRNA ifade eden bir AAV omurgası vardır. Ayrıca KRAS G12D homoloji yönelimli onarım (HDR) donör içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Normal hücrelerin dönüşümünde bir AAV-Cas9 sisteminin tasarımı ve çalışması. (A) AAV transgeni ve ambalaj plazmidleri ile transfekse sonra HEK293T'den AAV partiküllerinin üretimi ve saflaştırılmasının ana hatlarını. (B) Primer hücrelerin AAV partikülleri ile viral transdüksiyonu ve Cre-bağımlı Cas9 ekspresyonu CRISPR düzenlemeve primer hücrelerin tümörijenik hücrelere dönüşümsağlayan mekanizması. Kras G12D alelinin HDR ile bir knockin'i ile üç farklı gen için gRNA'ları entegre eden tek bir AAV vektörü Cre bağımlı Cas9 fare birincil hücrelerine ulaştı. Transekte edilen hücrelerdeki kre rekombinaz aktivitesi LoxP-Stop-LoxP kasetinin eksizyonuna yol açar ve Cas9 ve GFP ekspresyonunu tetikler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İzole fare embriyonik fibroblast hücrelerinde in vitro AAV-Cas9 sisteminin doğrulanması
Birincil fare embriyonik fibroblast (MEF) hücreleri sadece hücresel büyüme ve proliferasyon22gen ablasyon sonuçlarını incelemek için kullanılmıştır . AAV-Cas9 sisteminin normal hücrelerin dönüşümündeki verimliliğini doğrulamak için Cas9 fare embriyolarından (E14) izole edilmiş MEF hücrelerini AAV ile aktardık. MEF hücreleri daha önce açıklandığı gibi izole edildi23,24. 14 günlük Cas9 fare embriyolarından MEF'ler, kültür ve in vitro aktarımı kolay olduğu için kullanıldı. Kısacası, AAV transdüksiyonu ile MEF'leri dönüştürmek için, yaklaşık %30'luk bir araya gelen primer MEF'ler transdüksiyona hazır kabul edildi. Transdüksiyondan bir saat önce, MEF kültür ortamı değiştirildi. Saflaştırılmış AAV buz üzerinde çözüldü ve MEF kültür medyası aspire edildi. 106-1014 viral genom/mL arasında değişen bir titre ile viral supernatant her kuyuya eklendi ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırıldı. Viral supernatant 48 saat sonra çıkarıldı, MEF kültür ortamının 2 mL'si ile değiştirildi ve transdüksiyondan yaklaşık 5 gün sonra GFP ifadesine kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırıldı. GFP ifade eden MEF'ler alt kültüre geçirildi ve doğrulandı. Bu vektör için 1012 viral genom/mL (1010 transducing ünitesine/mL'ye eşdeğer) primer MEF hücrelerini etkin bir şekilde tümörijenik MEF'lere dönüştürebileceğini tespit ettik(Şekil 3A). Transeed hücreleri Cre, Cas9 ve GFP 'yi ifade eder (Şekil 3B,C). AAV dönüştürülmüş MEF hücrelerinin tümörijenik potansiyeline erişmek için, 0.5 x 106 hücre (primer/AAV transemetli MEF) dil, dudak ve subkutan NOD-SCID farelerde enjekte edildi. Dönüştürülmüş hücreler bu farelerde tümör oluşturmayan primer MEF ile karşılaştırıldığında tümör oluşturmuştur(Şekil 3D-F).

Figure 3
Şekil 3: AAV-Cas9 sistemini kullanarak birincil MEF hücrelerinin doğrulanması ve in vitro dönüşümü. (A) AAV parçacıkları kullanılarak Cas9 farelerinden toplanan embriyolardan fibroblastların in vitro dönüşümü. (B) GFP, Cre ve Cas9 ekspresyonunu gösteren primer MEF ve AAV transejik MEF hücrelerinin temsili immünoresans görüntüsü. DAPI çekirdeği lekelemek için kullanıldı. (C) Embriyonik normal fibroblastlarda ve genetik olarak düzenlenmiş fibroblastlarda Cre, Cas9, GFP ve β-aktin gösteren batı lekeleme. (D) Dönüştürülmüş fibroblast hücreleri ile enjekte edildikten sonra bir NOD-SCID fare geliştirilen bir dil tümörü temsili görüntü. (E) Dönüştürülmüş fibroblast hücreleri ile enjekte edildikten sonra bir NOD-SCID fare oluşan bir dudak tümörü temsili görüntü. (F) Dönüştürülmüş fibroblast hücreleri ile enjekte edildikten sonra bir NOD-SCID fare geliştirilen bir yan tümör temsili görüntü. Oklar bir tümörü gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

AAV-Cas9 sistemini kullanarak primer dil epitel hücrelerinden tümörijenik murine dil epitel hücre hattının in vitro üretimi
AAV sisteminin dönüşüm özelliğini MEF hücreleri kullanarak doğruladıktan sonra, Cas9 farelerinden birincil dil epitel hücrelerini izole ettik ve in vitro olarak kültürledik. Primer dil hücreleri AAV viral partikülleri (1010 cfu/mL) ile transeneden alındı ve bir hafta sonra hücreler GFP ifade etmeye başladı. Primer dil epitel hücrelerinin tümörijenik dönüşümü(Şekil 4A)immünfloresans ve Batı lekeleme kullanılarak doğrulandı (Şekil 4B,C). Dönüştürülmüş hücreler gelişmiş KRT 14, E-kadherin ve GFP ekspresyonu sergilerler(Şekil 4B). Primer dil epitel hücrelerinin tümörijenik dönüşümü GFP (yani, Cas9 ve GFP'nin Cre-bağımlı ekspresyonu) ekspresyonu ile doğrulandı (Şekil 4C). KRT14 ve E-kadherin ekspresyonu epitel hücre özelliklerini doğrular. Protein doğrulama, gelişmiş β-katenin, fosfo-ERK ve azaltılmış p53 ekspresyonu(Şekil 4C),APC ve p53'ün etkili bir şekilde aşağılanmasını ve mutant KRAS'ın dil hücrelerine dahil olduğunu göstererek tümörijenik hale getirdiğini doğruladı. Dönüştürülmüş hücrelerden izole edilen DNA'nın derin dizilimi ile genomik analiz, TP53 ve APC genlerinin AAV-Cas9 sistemi tarafından etkili gen düzenlemesini ve çerçeve değişimini doğrulamıştır(Tablo 2). AAV'ye dönüştürülmüş dil hücre hattının tümörijenik özelliği, immünobeceriksiz yabani tip C57BL/6 farelerin diline enjekte edilerek daha da değerlendirildi. Dilin KRAS mutant epitel hücreleri (KRAS Mut EpT) olarak belirlenen dönüştürülmüş dil hücreleri, C57BL/6 farelerinde etkili bir şekilde tümör oluşturur(Şekil 4D). KRAS Mut EpT tümörleri oral ve maksillofasiyal patolog tarafından rutin hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ve immünohistokimya ile değerlendirildi. Tümörler belirgin nükleer atipiile bir mil hücre morfolojisi sergiledi: pleomorfizm, hiperkromatizm, dev nükleoli, çeşitli nükleoller, ve atipik mitotik figürlerile yüksek mitotik oranı. Perivasküler invazyon ve anjiyo invazyon da kaydedildi. Bu morfolojik özelliklere tümörle ilişkili olmayan inflamasyonla sınırlı ydı. İmmünohistokimyasal olarak, neoplastik hücreler e-kadherin ve KRT 14 için sitoplazmaik olarak pozitifti, epitel dokusunun her ikisi de. KRT 14 skuamöz epitel tipiktir, tümör hücrelerinin skuamöz kökenli destekleyen ve böylece skuamöz hücreli karsinom tanısı (Şekil 4E). Bu nedenle, bu yaklaşım istenilen gen değişikliği ile in vitro birincil hücreleri dönüştürmek için çok yönlü bir metodoloji sağlar. Buna ek olarak, bu metodoloji gerçek bir tümör mikroçevre ortamında neoplazi daha iyi anlaşılması için syngeneic farelerde vivo bu gelişmiş hücre hatlarının kullanımını kolaylaştırır.

Figure 4
Şekil 4: AAV-Cas9 sistemi kullanılarak primer dil epitel hücrelerinin in vitro dönüşümü. (A) Cas9 farelerinin dilinden elde edilen normal epitel hücrelerinin in vitro transformasyonşetiği şematik gösterimi. (B) AAV-transeksed dil epitel hücrelerinin KRT14, E-kadherin ve GFP ekspresyonunu gösteren temsili immünofloresan görüntüsü. (C) Cas9, β-catenin ve fosfo-ERK upregülasyonunu gösteren batı lekeleri p53 protein düzeyi nin aşağıregülasyonu ile genetik olarak düzenlenmiş epitel hücrelerini gösterir. (D) Dönüştürülmüş dil epitel hücreleri (KRAS Mut EpT) ile enjekte edildikten sonra immünobeceriksiz farelerin dilinde gelişen bir tümörün temsili görüntüsü. (E) 20x ve 40x büyütmede H&E, E-kadherin ve KRT 14 boyama için tümör doku bölümlerinin temsili görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Viral hasat için hücre lisis tampon Birim
150 mM NaCl 876.6 mg
50 mM Tris-HCl 605.7 mg
pH 8.5'i ayarlamak için HCl kullanın
Moleküler sınıf su 100 mL'ye kadar makyaj yapın
Denklik tamponu
1 mM MgCl2 9.52 mg
2,5 mM KCl 18.64 mg
Tüm PBS 1X'i karıştırın ve pH'ı 7,2'ye ayarlayın 100 mL'ye kadar makyaj yapın
Elüsyon arabelleği
0,5 M NaCl 2.92g
Tüm PBS 1X'i karıştırın ve pH'ı 7,2'ye ayarlayın 100 mL'ye kadar makyaj yapın
10X Üçlü Enzim Stok Çözeltisi:
Kollajenaz 1 g son eksi [10 mg/ml]
Hyaluronidase 100 mg [1 mg/ml]
DNase 20.000 Adet son conc. [200 mg/ml]
PBS 1X 100 mL'ye kadar makyaj yapın
Plazmid karışımı (bir 14.5cm Plaka için)
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR 10 μg
AAV 2/9 capsid vektör 10 μg
pAD Delta F5 yardımcı 10 μg
PEI (1μg/μl Stok) 90°L
DMEM 1 mL

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan tamponların tarifleri.

Tablo 2: Kras Mut EpT hücrelerinin genom analiz verileri. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çeşitli yöntemler daha önce başarı 25 değişken dereceleri ile kültürbirincil hücreleri dönüştürmek için kullanılmıştır25,26,27,28. Bu yöntemlerin çoğu dönüşüm için fare fibroblast hücreleri kullanın14,17,18,19 veya 4-nitroquinoline-1-oksit (4-NQO)21gibikanserojen kullanın,22 murine hücre hattı modelleri geliştirmek için. Nakavt ve transgenik fare modellerinin kullanımı da HNC'nin geliştirilmesini ve farklılaşmasını yöneten çeşitli moleküler yollar hakkında anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiştir. Benzersiz bir genetik desen ile murine oral epitel hücre hatlarının kullanımı kesinlikle bu çalışmaları tamamlayacak, ve sonraki biyokimyasal tahliller tedavi ve HNC tanısına katkıda bulunacak. Ancak, sadece birkaç rapor fare oral epitelhücrelerininkurulması tarif var 28,29,30,31,32,33 ve bu hücre hatları yaygın kullanımda değildir.

Bu murine oral epitel hücre hatlarının en önemli sınırlaması moleküler düzeyde yaygın olarak karakterize edilmemeleri ve nadir gen desenlerini ifade ettikleri saptanmış olmalarıdır. Böylece, bu rüri hücre hattı modellerinin sınırlı moleküler anlayışı ve etkin bir metodolojinin olmaması, cas9 knock-in farelerde aav-CRISPR genom düzenleme teknolojisinin eşsiz potansiyelini kullanarak spesifik gen değişiklikleri. Bu çalışmada, karsinom hücrelerine yol açan genetik değişiklikleri doğrulamak için primer mindik hücrelerini tümörijenik duruma dönüştürmek için in vitro AAV-Cas9 sistemini tanıttık ve geliştirdik. AAV aracılı CRISPR kaynaklı somatik gen düzenlemesini çeşitli sgRNA kombinasyonları ile yüksek verimliliğe sahip spesifik gen mutasyonları ile murine dil epitel hücrelerini başarıyla oluşturduk.

Bu metodoloji, HNC hücre özerk etyolojisi daha iyi anlamak için yeni bir deneysel yaklaşım sunuyor. Murine primer dil epitel hücreleri ile başlayarak, sınırlı sayıda gen silerek ve tek bir KRAS mutasyonu sunarak bu hücreleri tümörijeniteye dönüştürmeyi başardık. Bu metodolojiyi kullanarak, diğer karsinomlara karıştığı bilinen diğer genlerin HNC'ye daha çok benzeyen maligniteler üretip üretemediğini araştırmak mümkündür. KRAS Mut EpT'deki tümörlerin morfolojik özellikleri skuamöz hücreli karsinom olduğunu doğruladı. Sinjenezik farelerde KRAS Mut EpT tümörlerinin histopatolojik analizi baş ve boyun karsinomu agresif biyolojik davranış ile ilişkilidir ve destekleyicidir. Bu nedenle kanser hücrelerinin genotiplerini tümörlerin spesifik klinik ve histopatolojik özelliklerine bağlamak mümkün olabilir.

Bu metodolojinin başlıca avantajları, belirli gen mutasyonları kullanarak herhangi bir organdan birincil hücrelerden hücre hatları geliştirebilme ve sistemi daha sağlam ve kararlı kılan AAV-Cas9 kullanımıdır. Endojen Cas9 sistemi diğer gen nakavtlarının kullanılmasını mümkün kılar. Mevcut metodolojinin en büyük dezavantajı, birincil kültürün yanı sıra birincil hücreleri nakletmek için gereken yüksek viral parçacıkların titreştirilmesi için gereken zamantır. Ancak, bu her hücre türü için yalıtım işlemi standartlaştırılarak aşılabilir. Verimli transdüksiyon için yüksek bir AAV viral titre gerektiren sorun viral ambalaj ve daha iyi bir arıtma işlemi için capsid ve yardımcı plazmidler en son nesil kullanımı ile hafifletilebilir.

Gelecekte, daha iyi ve daha verimli bir AAV sistemi tasarlanmış ve organa özgü genetiği değiştirilmiş tümör modelleri yapmak için in vivo ekstrapolated olabilir. Sonuç olarak, bu yaklaşımla murine hücre hatlarının oluşturulması onkoloji bağlamında çeşitli hipotezleri test etmek için değerli bir in vitro hücre kültürü tabanlı bir araç olarak hizmet verecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.S. Biyobilim Enstitüsü Danışma Kurulu'nda ve Menarini Ricerche Puma Biyoteknoloji, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics ve Menarini Ricerche'den araştırma fonları aldı. M.S. aynı zamanda Medendi Medical Travel'ın kurucularındandır ve son 2 yıl içinde Menarini Ricerche ve ADC Pharma'dan fahri ödül almıştır. Diğer tüm yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Dr. Daniel Gitler'a pAd Delta 5 Helper plazmidini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (ISF, 700/16) (ME), Amerika Birleşik Devletleri-İsrail Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (ME ve MS), İsrail Kanser Derneği (ICA, 20170024) (ME için), İsrail Kanser Araştırma Vakfı (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME) ve Endişe Vakfı (ME) tarafından finanse edilmiştir #7895. Fellowship: ME ve SJ ve MP BGU Kreitman burs alon bursu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti mouse HRP Jackson ImmunoResearch 115-035-146
Anti rabbit HRP Jackson ImmunoResearch 711-035-152
Cas9 Mouse mAb Cell Signaling Technology 14697
Cre BioLegend 900901
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-165-144
GFP Santa Cruz Biotechnology sc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) Cell Signaling Technology 4370
Rabbit monoclonal anti E cadherin Cell Signaling Technology 3195S
Rabbit monoclonal anti-KRT 14 Abcam AB-ab181595
β actin MP Biomedicals 691001
β catenin Cell Signaling Technology 9582S
Cell lines
HEK93T ATCC CRL-3216
Culture Media, Chemicals and Reagents
Bradford Reagent Bio-Rad 30015484
BSA Amresco 0332-TAM-50G
DAPI fluoromount Southern Biotech 0100-20
DMEM Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 01-055-1A
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) Cyanagen XLS3.0100 and XLS071.0250
FBS Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 04-127-1A
HBSS Sigma H6648
Heparin - Agarose Sigma H6508
Isolate II Genomic DNA Kit Bioline BIO-52066
MgCl2 Panreac AppliChem 300283
NaCl Bio Lab Ltd 1903059100
PBS Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 02-023-1A
PEI Polysciences 23966-1
Pen Strep Solution Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 03-031-1B
PFA Santa Cruz Biotechnology 30525-89-4
Phosphatase inhibitor cocktail Biotool B15001A/B
Protease inhibitor cocktail MilliporeSigma P2714-1BTL
Tris buffer MERCK Millipore 648311-1KG
Enzymes
Benzonase Sigma E1014
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019
DNAse Thermo Fisher Scientific 18047019
Hyaluronidase MilliporeSigma H3506
Trypsin Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. 03-050-1B
Glass wares
Cover slips Bar Naor BNCB00130RA1
Slides Bar Naor BN9308C
Mouse strains
C57BL/6 Envigo
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J Jackson labs 24857
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR Broad Institute of MIT Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 capsid vector Addgene 112865
pAD Delta F5 helper Ben Gurion University of the Negev Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA filter 100 KDa Millipore UFC910024
0.22 µm sterile filters, 4 mm Millex SLGV004SL
0.45 µm sterile filters, 13 mm Millex SLHV013SL
Culture plates Greiner Bio-One
Falcon tubes Greiner Bio-One

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
  3. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
  4. Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
  5. Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
  6. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
  7. AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
  8. Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
  9. Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).
  10. Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).
  11. Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
  12. Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
  13. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , National Academy Press. (1996).
  14. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  15. Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
  16. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  17. Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
  18. Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
  19. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
  20. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
  21. Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
  22. Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
  23. Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
  24. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
  25. Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
  26. Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
  27. Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
  28. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  29. Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
  30. Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
  31. Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
  32. Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
  33. He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).

Tags

Kanser Araştırma Sayı 155 baş ve boyun kanseri murine kanseri modelleri genomik düzenleme CRISPR adeno ilişkili virüs vektörü in vitro hücre dönüşümü tümör hücre hattı
Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prasad, M., Jagadeeshan, S.,More

Prasad, M., Jagadeeshan, S., Scaltriti, M., Allon, I., Elkabets, M. In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System. J. Vis. Exp. (155), e60410, doi:10.3791/60410 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter